细胞传代实验报告

细胞传代培养

一.实验目的

初步掌握哺乳动物细胞的原代培养与传代培养的基本操作过程，为生物技术在医学上的

应用打下基础。

二、原理

从生物体中取出某种组织或细胞，模拟体内生理条件，在人工培养条件下使其生存、生

长、繁殖或传代，这一过程称为细胞培养。细胞培养技术的最大优点是使我们得以直接

观察

活细胞，并在有控制的环境条件下进行实验，避免了体内实验时的许多复杂因素，还可

以与

体内实验互为补充，可同时提供大量生物性状相同的细胞作为研究对象，耗费少，比较

经济，

因此成为生物学研究的重要手段。

细胞培养可分为原代培养和传代(继代)培养。直接从体内获取的组织细胞进行首次培养

为

原代培养；当原代培养的细胞增殖达到一定密度后，则需要做再培养，即将培养的细胞

分散

后，从一个容器以1：2或其他比率转移到另一个或几个容器中扩大培养，为传代培养，

传

代培养的累积次数就是细胞的代数。

细胞培养是一种程序复杂、要求条件多而严格的实验性工作。所有离体细胞的生长都受

温度、渗透压、ph值、无机盐影响，消毒、配液等均有严格的规范和要求，特别是无菌

操

作是细胞培养成败的关键。

三、材料和试剂

1、细胞：293细胞株

2、试剂：0.25％胰酶、1640培养基（含10％小牛血清）

3、仪器和器材：倒置显微镜，培养箱、电动枪，培养板，吸液枪，5ml玻璃吸管、酒精

灯等

四、操作步骤

1、将长满细胞的培养板中原来的培养液吸去。

2、加入1~2ml 0.25％胰酶溶液，使板底细胞都浸入溶液中。

3、马上吸走胰酶液，再次加入2ml左右的胰酶，同样马上吸去，再加入几滴胰酶放入

培养箱中消化几分钟

4、用吸管将贴壁的细胞反复吹打成悬液，再按照观察的生长情况确定的传代比例传代

5.根据确定的比例来取需要的量（剩余的细胞拿来做细胞计数），加入4ml左右的培养液

6.前后左右的来回震荡使细胞分散均匀后，将培养板放入培养箱

7.收拾整理超净台

附：消化液配制方法：

称取2.5克胰酶蛋白酶，加入100ml10xpbs+纯水溶解到1l，滤器过滤除菌，4℃保存，

用前可在37℃下回温。

10x pbs配方：na2hpo4(14.2g) kh2po4(2.32g) nacl(80g) kcl(2.02g) (调至ph=7.4）

五、实验结果

传代后的细胞在2小时左右就能附着在培养瓶壁上，2天左右就在瓶内形成单层，

达到七八成满。这时需再次传代

六、讨论与反思

无菌操作中的注意事项

在无菌操作中，一定要保持工作区的无菌清洁。为此，在操作前要认真地洗手并用75％乙醇消毒。操作前20～30分钟起动超净台灭菌。培养瓶要在超净台内才能打开瓶塞，打开之前和加塞前瓶口都要在酒精灯上烧一下，打开瓶口后的操作全部都要在超净台内完成。操作完毕后，加上瓶塞，才能拿到超净台外。使用的吸管在从消毒的铁筒中取出后要手拿末端，将尖端在火上烧一下，戴上胶皮乳头，然后再去吸取液体。总之，在整个无菌操作过程中都应该在酒精灯的周围进行。

每天观察细胞形态，掌握好细胞是否健康的标准：健康细胞的形态饱满，折光性好，生长致密时即可传代。

多做，熟能生巧篇二：细胞生物学实验传代培养

一、【实验目的】

1、了解动物细胞传代培养的基本原理。

2、掌握动物细胞传代培养的基本操作，并对hela细胞进行传代培养。

二、【实验原理】

hela 是henrietta lacks的简称，henrietta lacks 是一位患有子宫颈癌的美国妇女的名字，在她死后，该细胞走被广泛散发到各研究机构，并无限次地繁殖分裂下去。

培养细胞的特性：

贴附生长：必须贴附于支持物表面才能生长。见于各种实体瘤细胞。

悬浮生长：于悬浮状态下即可生长，不需要贴附于支持物表面。见于各种造血系统肿瘤细胞。

每代贴附生长细胞的生长过程：

1、游离期细胞接种后在培养液中呈悬浮状态．也称悬浮期。此时细胞质回缩，胞体呈圆球形。10分钟一4小时

2、贴壁期细胞附着于底物上，游离期结束。细胞株平均在10分钟一4小时贴壁。

3、血清中有促使细胞贴壁的冷析球蛋白和纤粘素、胶原等糖蛋白（生长基质），这些带正电荷的糖蛋白的促贴壁因子先吸附于底物上，

悬浮细胞再与吸附有促贴

壁因子的附着。

4、潜伏期此时细胞有生长话动，而无细胞分裂。细胞株潜伏期一般为6～24小时。

5、对数生长期细胞数随时间变化成倍增长，活力最佳，最适合进行实验研究。

6、停止期（平台期）细胞长满瓶壁后，细胞虽有活力但不再分裂

细胞传代方法

1、悬浮生长细胞传代

离心法传代：离心（1000转/分）去上清，沉淀物加新培养液后再混匀传代。直接传代法：悬浮细胞沉淀在瓶壁时，将上清培养液去除l／2一2／3，用吸管直接吹打形成细胞悬液再传代。

2.悬浮生长细胞传代（hela细胞）

此类细胞部分呈现贴壁生长现象，但贴壁不牢，可用直接吹打法使纫胞从瓶壁脱落下来，进行传代。

3、贴壁生长细胞传代

采用酶消化法传代。常用的消化液有0.25％的胰蛋白酶液。

细胞培养用液的配制

1、d-hanks原液试剂配方

氯化钠 80.0g 磷酸氢二钠（na hpo ·2h o） 0.6g 氯化钾 4.0g 磷酸二氢钾 0.6g 三

蒸水 1000ml

2、d-hanks工作液试剂配方

d-hanks原液 100ml 三蒸水 896ml 0.5% 酚红液 4ml 3、消化液：

胰蛋白酶作用于与赖氨酸或精氨酸相连接的肽健，除去细胞间粘蛋白及糖蛋白，影响细

胞骨架，从而使细胞分离。胰蛋白酶液浓度越高，作用越强，但超过一定限度会损伤细胞。

胰蛋白酶是一种黄白色粉末，用无ca2+、mg2+的pbs缓冲液配制常用的胰蛋白酶液浓度是

0.25％。用滤器过滤除菌。

胰蛋白酶液消化时间：2-10分钟。用含血清培养液终止其对细胞的消化作用

完全培养基的组成

基础培养基 80％一95％

血清 5％一20％（一般加10％）

碳酸氢钠 2.0 g/l 青、链霉素各100卑位／毫升

血清质量好坏是实验成败的关键。

常用血清有胎牛血洁、新生牛血清、小牛血情、兔血清、马血清等，其中以胎牛血清质

量最好。

优质血清的标准：透明，淡黄色，无沉淀物，无细菌、支原体、病毒污染。血清的灭活

（消除补体活性）：56 ℃，30 分钟

血清的消毒：过滤除菌

三、【实验材料】

实验用具：离心管（2支），移液枪（每个台面一把），枪头，吸管（4根），培养皿（每

组2个）

实验药品：0.25％胰酶，d－hanks，1640培养基

四、【实验操作】

1. 用75%乙醇擦手，取离心管一个，打开超净台（照明、风机），把离心管置于架子上。

然后用75%乙醇擦一下台面，点燃酒精灯。取尖吸管、吸量管各一支，套好吸球，放置在专

用的架上。

2．从冰箱中取出0.25％胰酶、d－hanks、培养基。可以把胰酶和d－hanks的瓶盖打开

或者拧松。

3.取待传代的细胞，用尖吸管弃去旧的培养基，加入d－hanks。轻轻摇动后将hanks弃

掉。

4.用尖吸管吸取适量胰酶加入，加入的量以覆盖整个细胞培养面为宜，轻轻摇动。2－5

分钟后迅速将消化液吸出。消化时间长短是实验成败的关键，宁可短消化，不能过消化。否

则细胞会变死。在倒置显微镜下观察，当细胞质回缩，胞间间隙加大为消化适宜。

5．取培养基加入细胞，反复轻轻吹打培养皿壁，制备细胞细胞悬液。吹打的部位均匀，

从上到小，从左到右，顺序进行吹打，保证各个部位的培养细胞均能吹打

到，成片的细胞已经分散成小的细胞团或者单细胞便停止吹打。吹打时用力不要过猛，

尽量不要出现气泡，以免损伤细胞。

6．至所有细胞从培养皿底部脱落下来，然后吸取至离心管中。1000 rpm离心5分钟。（无

需准确计数时离心可略）