超级感受态细胞制备方法-化转
感受态细胞的制备及转化实验报告 [制备感受态细胞实验报告]
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效价：指能用 1ug 的标准质粒能够转化出的菌落数。
再放到恒温振荡箱 60min
具体步骤
四．试验结果
化学效价检测
化学检测结果 菌数 4*10^7
.把感受细胞从超低温冰箱中拿出(冰水先预备好再拿出感受态细胞在
电转化检测结果 菌数 10^9
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五．试验分析
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表，经 42
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前培育
C2+处理的感受态细胞，其转化率一般能到达 5×106~2×107 转化子
将单菌落接种到 10ml 的培育液中，在恒温振荡器 37°下过夜培育
/ug 质粒 DN，可以满足一般的基因克隆试验。如在 C2+的基础上，联合其
水洗 3 加 10ml 水 离心 水倒掉
(50Ul~100Ul 若这里不能长到 10^6 则不行用)
4)XX 油 10%洗 2 次〔每次加 5ml〕中间离心两次 在第二次加 XX 油悬
电转化效价
浮后离心后加 120uLGYT 悬浮液
取 Pug19uL 加入感受态细胞再将此移到电击杯
5) 一个人预备 4 个小管子〔每个 40uL 扔到液氮速冻 放到-70℃
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感受态细胞的制备及转化实验报告 [制备感受态细胞 实验报告]
也可大大促进转化的作用。细胞的感受态一般出如今对数生长期，新颖幼 嫩的细胞是制备感受态细胞和进行胜利转化的关键。
制备出的感受态细胞临时不用时，可加入占总体积 15%的无菌 XX 油
重组 DN 分子体外构建完成后，必需导入特定的宿主〔受体〕细胞，使
感受态细胞的制备和转化
感受态细胞的制备和转化或者：设计好实验项⽬，如正、负对照（参考如下表格，按表格内容操作）3.细菌培养液，各加⽆菌⽔⾄150µL（不超过200µL）涂LB/ Amp/IPTG/X-Gal平板（此步骤的⽬的是计算转化率）；对其余各项，分别各取⼀半涂布于LB/ Amp平板上，余下的转化液置4℃冰箱保存。
倒置平板，37℃培养12-14⼩时。
⼀般来说，含有活性半乳糖苷酶的细菌⽐⽆活性酶的细菌⽣长慢，故过夜培养后可见到毫⽶⼤⼩的阳性⽩⾊菌落⽽阴性的兰⾊菌落只有针尖⼤⼩。
5. 将上述菌液摇匀后取100µl 涂布于含Amp的筛选平板上，正⾯向上放置半⼩时，待菌液完全被培养基吸收后倒置培养⽫，37℃培养16-24⼩时。
6. 计算转化率，统计每个培养⽫中的菌落数。
转化后在含抗⽣素的平板上长出的菌落即为转化⼦,根据此⽫中的菌落数可计算出转化⼦总数和转化频率,公式如下：转化⼦总数＝菌落数×稀释倍数×转化反应原液总体积／涂板菌液体积转化频率（转化⼦数／每mg质粒DNA）＝转化⼦总数／质粒DNA加⼊量(mg)感受态细胞总数＝对照组２菌落数×稀释倍数×菌液总体积／涂板菌液体积感受态细胞转化效率＝转化⼦总数／感受态细胞总数[注意] 本实验⽅法也适⽤于其它E.coli受体菌株的不同的质粒DNA的转化。
但它们的转化效率并不⼀定⼀样。
有的转化效率⾼,需将转化液进⾏多梯度稀释涂板才能得到单菌落平板,⽽有的转化效率低,涂板时必须将菌液浓缩(如离⼼),才能较准确的计算转化率。
第四节注意事项与提⽰1. 倒平板时应避免培养基温度过⾼，若温度过⾼，则加⼊的氨苄青霉素会失效，且培养基凝固后表⾯及⽫盖会形成⼤量冷凝⽔，易于造成污染及影响单菌落的形成。
若⽤⼿掌感受培养基觉得很烫但尚可忍受时，培养基温度即为55℃左右。
制备好的LB/Amp平板可于4℃冰箱储存2个⽉，时间过长氨苄青霉素将会失效。
超级感受态细胞DH5α的制备
制备和转化感受态大肠杆菌的Inoue方法：制备超级感受态细胞采用Inoue的方法（1990）制备大肠杆菌感受态细胞很好时甚至能达到Hanahan方法（1980）的转化效率。
但在标准的实验室条件下，达到l×108~3×108个转化克隆/ug质粒DNA的转化效率更为常见。
与Hanahan方法相比，这一方法的优点在于并不过分地讲究细节，但是重复性更好，而且更有预见性。
这一方法与其他方法有所不同的是细菌在18℃进行培养而不是通常的37℃。
否则这个方法也就没有什么特别之处，而不过是一个司空见惯的标准程序。
没有人知道为何在低温进行细菌培养会影响转化效率。
也许是18℃时合成的菌膜成分和物理性状更有利于攫取DNA，也许是低温使有利于高效转化的生长时相延长了。
在18℃进行细菌培养并非易事，大多数实验室缺乏在夏天和冬天能够准确保持18℃的摇床。
将摇床置于4℃冷室，用温控器加温至18 ℃是一个解决问题的方法。
也可使培养物的温度维持在20~23℃，这样做并不会造成转化效率降低，这一温度在很多实验室其实是室温。
在这一温度范围，细菌生长得很慢，倍增时间大约为2.5~4h。
如此缓慢的生长可能会导致培养失败，尤其是在晚间较迟的时候，这时细菌的OD600吸收值似乎永远不能达到理想的0.6。
解决这个问题的方法是晚上就进行培养，第二天一早收获细菌。
分子克隆中常用的很多大肠杆菌品系都适用于这种方法，如XL-Blue、DH1、JM103、JM108/109、DH5a 和HB101。
材料注息：标记〈！〉试剂的正确操作，请参见附录12。
缓冲液和溶液贮存液、缓冲液和试剂成分请见附录1。
使用时将贮存液稀释至适当浓度。
二甲亚砜DMSO 〈！〉二甲亚砜的氧化产物据推测为二甲硫醚，是转化的抑制物（Hanahan 1985）。
为避免上述问题，应购买高质量的DMSOInoue转化缦冲液（见步骤1)用前置于冰上预冷至0℃。
核酸和寡核苷酸质粒DNA (重组质粒〉构建方法采用本章方案17和22所提供的方法。
感受态细胞制备与转化
Ⅰ、CaCl2法制备感受态细胞（大肠杆菌）①挑取37℃培养16-20h的单菌落（直径2-3mm）于含有100mlLB或SOB的500或1000ml 的三角瓶中，剧烈振荡培养3h至OD值为0.2-0.4（据文献大肠杆菌DH5α菌株培养物OD 值为0.2-0.4时，约含109个菌/ml；②转移菌体至无菌、一次性冰冷的50ml聚丙烯离心管内。
将离心管内培养物放置于冰上10min，以使其冷却至0℃；③将离心管内培养物4℃，4000rmp，10min以收集菌体；④弃去上清培养基，并颠转离心管放于一叠吸水纸上1min，吸取多余培养基；⑤用30ml冰冷MgCl2-CaCl2溶液（80mM MgCl2和20mM CaCl2）漩涡振荡重悬菌体沉淀，置于冰上10min；⑥将离心管内培养物4℃，4000rmp，10min以收集菌体；/⑦弃去上清培养基，并颠转离心管放于一叠吸水纸上1min，吸取多余培养基；⑧用2ml冰冷0.1MCaCl2溶液（2ml冰冷0.1MCaCl2/50ml原初培养物）漩涡振荡重悬菌体沉淀；⑨放于4℃冰箱14-20h。
获得的感受态细胞即可直接用于转化或添加甘油至终浓度10%（7:3,7是菌液，3是甘油），分装离心管内（150-200μl），存于-70℃。
感受态细胞的冻存制备①每4ml重悬细胞中添加140μlDMSO，轻摇混匀，冰上放置重悬物15min；②另外每管重悬物中再添加140μlDMSO，轻摇混匀，重新放于冰浴中；③迅速将重悬物分装于冷的、无菌小管内，将小管浸入液氮中瞬时冰冻感受态细胞，将小管存于-70℃冰箱。
Ⅱ、大肠杆菌转化①CaCl2法制备大肠杆菌感受态细胞Luria-Bertani（LB）培养基（1L）：胰蛋白胨（10g），酵母提取物（5g），NaCl（10g）pH7.5/NaOH，dH2O至1L，灭菌LB平板：LB培养基（500ml），Agar（7g），灭菌。
冷却55-65℃倒平板。
实验四.感受态细胞的制备、转化及转化子的筛选
3. 取1.5ml的上述菌液转入1.5ml灭菌离心管中，在冰 上冷却30min，于4℃ 4000 rmp离心10min；（从 这一步起，之后所有操作均应在冰上进行，速度 尽量快而稳） 4. 倒净上清液，用1ml冰冷的0.1M CaCl2溶液轻轻悬 浮细胞（可以用枪头来回吹打，不用剧烈），冰 浴， 4℃ 4000 rmp离心10min；
LB液体培养基： Tryptone 10g Yeast Extract 5g NaCl 10g 加去离子水1L，用NaOH调PH值至7.0，高温高压灭菌后 4℃保存。（如制作固体培养基，应加Agar 15g/L）
三、实验步骤
CaCl2制备感受态细胞
1. 从新活化的大肠杆菌TG1平板上挑取一单菌落，接 种于3-5ml的LB液体培养液中，37℃振荡培养12h； 2. 将上述培养液以1:50-1:100转接于100ml LB液体培 养基中， 37℃振荡扩大培养，1-1.5h后测OD的DNA分子加到100µl的感受态细胞中， 冰上放置30min； 2. 42℃加热45s后，立即放在冰中1min； 3. 然后加入到1ml的LB液体培养基中，37℃振荡培 养1h； 4. 取上述培养液50µl涂在含有Amp的LB固体培养基 表面进行筛选。 5. 12h后观察LB固体培养基平板长菌情况。
5. 弃去上清液，加入500µl冰冷的0.1M CaCl2溶液， 小心悬浮（方法同上）。冰浴， 4℃ 4000 rmp离 心10min；
6.弃去上清液，加入100µl含15%甘油的冰冷的0.1M CaCl2溶液，小心悬浮（方法同上），冰上放置片 刻后，即成感受态细胞。 （感受态细胞在-70℃下可保存半年至一年）
四、实验结果与思考题 拍照转化子的筛选情况，并分析结果。
实验四：感受态细胞的制备、转化 及转化子的筛选
感受态细胞的制备及转化
感受态细胞的制备一、实验原理受体细胞通过一些特殊方法（如电击法，CaCl2，MnCl2，MgCl2等化学试剂法)的处理后，使细胞膜的通透性发生了暂时性的改变，成为能允许外源DNA分子进入的状态，成为感受态细胞。
本方案介绍的方法为TSS法和KCM转化法。
二、材料及准备工作一）材料准备二)试剂配制1、液体LB培养基（200ml，高压灭菌，4℃保存备用）蛋白胨 2.0g酵母提取物 1.0g氯化钠（NaCl） 2.0g2、固体LB培养基（2×100ml，高压灭菌）蛋白胨2×1.0g酵母提取物2×0.5g氯化钠（NaCl）2×1.0g琼脂粉2×1.5g温度降低到45℃后（不烫手），取其中一瓶加入氨苄至终浓度100μg/ml（100mlLB加100μl 100mg/ml的氨苄）后铺平皿，另一瓶直接铺平皿。
4℃保存备用。
3、TSS液（100ml）（有效期2周）聚乙二醇（PEG8000）10g 终浓度10%DMSO 5ml 终浓度5%MgCl2(1mol/L）5ml 终浓度50mmol/LLB 85ml 终浓度85%去离子水补足100ml，0.22μm过滤器过滤后，4℃保存备用注：聚乙二醇分子量可以为3000-80004、5×KCM液（10ml）（可-20℃长期保存备用）KCl（2mol/L） 2.5mlCaCl2(1mol/L) 1.5mlMgCl2(1mol/L) 2.5ml水补足到10ml, 0.22μm过滤器过滤后，4℃保存备用（不要高压消毒）5、氨苄青霉素（amp）（100mg/ml）取0.5g氨苄青霉素，溶解于5ml去离子水中，0.5ml分装，-20℃保存备用三）仪器设备1、低温大容量离心机2、恒温水浴锅3、超净台4、高压锅5、37℃孵育箱6、恒温摇床7、制冰机8、分光光度计9、微量移液枪10、低温冰箱三、步骤及注意事项一）感受态制备（TSS法）1、取菌种，划LB平皿板（无氨苄）；2、挑取分离良好的独立克隆，接种到5ml LB 中，220rpm ，37℃恒温摇床孵育过夜；3、取1 ml摇好的菌液，接种到100 ml LB 中（500ml锥形烧瓶），220rpm ，37℃孵育2.5-3.0h，菌液OD600达到0.2-0.5（0.36效果较好，不要超过0.6）；4、取出菌液，冰浴20min；然后4℃，3000 rpm离心5 min ，收集细菌；5、用10 ml 冰浴预冷的TSS液重悬细菌，然后4℃，3000 rpm离心5 min；再用冰浴预冷的TSS液重悬细菌，即成感受态；6、用1.5 ml离心管按150μl分装；-80℃长时间保存。
高效转化及感受态细胞的制备
关于感受态细胞及转化克隆/建库/表达专用超级高效感受态细胞国外的同学说一般他们克隆都是直接购买感受态细胞转化，实验效率很高的。
我总是以为如果是一般的克隆实验，自己做感受态好像够用了－－如果是建库，购买现成的感受态细胞就是非常必要的首选，因为转化效率确实比实际手工制备的高2－3个数量级以上，特别是建库，能实实在在地提高实验的效率。
实际上，除了建库以外，Stratagene为更好的表达蛋白、以及转化效率较低的巨无霸质粒，而特别优化了一些感受态细胞，做表达的人其实可以参考一下，有点用处的。
生物通在这里借用Merck公司提供的资料供大家参考。
Stratagene的XL10-Gold®几乎算得上是高效转化的代名词了，研究者一旦要克隆大质粒、连接DNA和建库，克隆甲基化DNA，进行蓝白斑筛选等，首选的就是XL10-Gold®和其衍生菌。
XL10-Gold®用途包括：--克隆大DNA：包括表达质粒，基因组DNA克隆--构建质粒文库：减少DNA大小偏倚性，使全长cDNA克隆、双杂交质粒等各种大小的质粒转化效率更接近，提高文库代表性（比DH10B高25倍）。
Hte 基因型Hte（高效转化）基因型是Stratagene开发的特异性提高大质粒、连接DNA的宿主菌基因型，并使细胞生长加快（当天获得菌落），已经成功应用于25kb超螺旋DNA和8kb 连接DNA的克隆。
XL10-Gold®，BL21-Gold，BL21-CodonPlus®，SoloPack® Gold 和96Pack® Gold等系列细胞都带有这个新的性状。
超级感受态细胞Stratagene提供多种>5 x109转化子/μg 超螺旋DNA转化效率的化学法超级感受态细胞正是克隆获得大质粒、连接DNA克隆和建库时最值得推荐的。
电转化感受态细胞Stratagene的电转化感受态细胞特别耐受电击处理，方便好用，在DNA材料极珍贵、量少时，或构建有代表性文库时，建议采用电转化感受态细胞。
Inoue 法制备超级感受态细胞
Inoue 法制备超级感受态细胞越干净越好，越冷越好1. 将洗干净的瓶子（500ml 三角烧瓶）用Milli-Q水浸泡2-3小时，倒去烧瓶中的水并将烧瓶倒扣在吸水纸上2-3 分钟。
用Milli-Q 水配置250ml LB液体培养基。
高压灭菌。
2. 准备两盒1.5ml EP管，每盒中放置两张吸水纸，共约两百个。
高压灭菌。
3. 于早晨7-8点钟小摇菌种，挑取单菌落于5ml Milli-Q 水配置且灭菌的LB液体培养基（无抗性）中，37℃培养12 小时以上（OD600 大于 1.5）。
可以用一个新的50ml 进口离心管（costa，BD等品牌都可以）来摇细菌。
4. 晚上10 点钟左右，按1：100 大摇细菌。
超静台内吸取2.5ml 小摇细菌于高压灭菌的250ml 培养基（无抗性）中，18-22℃，200rpm 摇过夜。
5. 第二天上午测量细菌OD600 值。
Top10, Jm109 等生长速度快的细菌约在上午9 点左右OD600 达到0.55 左右，DH5α 则要到下午4-6 点钟（新手可以多摇几瓶细菌，梯度接菌，如1：50，1：100，1：200 等，哪瓶到了用哪瓶，其它的可以狠心倒掉）。
6. 将OD600达到0.55 的细菌置于冰上10min（OD600在0.4-0.8之间都可以，对结果影响不大）。
7. 4℃，4000rpm，10min 集菌（用新的50ml 进口离心管）。
8. 超静台内弃上清，将管倒扣在事先灭好的吸水纸上，巨大力向下击打，尽可能去掉剩余LB。
9. 每管倒入10ml 预冷的Inoue 转化缓冲液，拧紧盖子。
在冰上来回滑动重悬细菌（重悬的时间与向下击打的力度和来回滑动的速度相关，这两者于感受态效率没有直接关系）。
10. 超静台内向每管倒入约30ml 预冷的Inoue 转化缓冲液，来回颠倒混匀。
11. 4℃，4000rpm，10min 集菌。
12. 超静台内弃上清，将管倒扣在事先灭好的吸水纸上（换一张吧，别用刚才那张），巨大力向下击打，尽可能去掉剩余缓冲液。
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Preparation of Highly Efficient Chemical Competent cell Reagents:
所有的ddH2O都必须是最高级别纯度的水（18.2M）,容器专用，避免一切活性洗涤剂或者有机溶剂。
1:0.5M PIPES(PH6.7)
15.1gPIPES溶于80mlddH2O中，5M KOH调至PH=6.7,定容至100ml，Nalgene（0.22um）过滤除菌，-20度分装保存。
2：Transformation Buffer(TB): For 250ml
MnCl2.4H2O 2.72g 55mmol/L
CaCl2.2H2O 0.55g 15mmol/L
KCl 4.66g 250mmol/L
PIPES(0.5M PH6.7) 5ml 10mmol/L
H2O 补至250ml
Nalgene（0.22um）过滤除菌，Store at 4℃
3：SOB: For 200ml
2%Bactotryptone 4g
0.5%Yeast Extract 1g
10mM NaCl (5M stock,0.4ml)
2.5mM KCl (2M stock, 0.25ml)
Mix above four in 198ml of ddH2O,Sterilize by autoclave in a 1Lflask. Prepare 2M Magnesium solution(1M MgSO4+1M MgCl2), Sterilize by autoclave.可以直接用2M MgCl2。
Add 2ml of Mg solution into the autoclaved IL flask containing 198ml of BactoTrytone/Yeast Extract/NaCl/KCL solution. Store at 4℃
4：LB agar plates without antibiotics.
5: E.coli for competent cells(usually I use DH5αor XL-blue),without any plasmid.
Procedures
Day1:
1:Streak a favorite strain of E.coli on a LB agar plate without antibiotics. Incubate at 37℃for O/N
2: Make TB and SOB.
Day2:
3:Pick up 1-2 colonies and inoculate them to 200ml of SOB in a 1L flask.
4:Incubate culture at 200-250rpm/min at 18℃.This culturing temperature is critical. If cultured at room temperature, we see about 5 to 10 fold decrease in competency. Never try to culture at 37℃.We usually use a shaker with a cooling system, or put a normal shaking incubator into a cold room to grow cells.
Grow cells until OD600 become between 0.4 and 0.8(0.6 is optimal).It takes 24-48hours depending on the number and size of colonies used.
Day3:
5:Put the flask on ice for 10 min.
6:Spin down at 3000rpm,4℃for 10min.
7:Resuspend gently in 80ml of ice-cold TB(or 1/3volumc of culture medium),place on ice 5min.
8:Spin down again at 3000rpm,4℃for 10min.
9:Resuspend cells in 20ml of TB gently on ice.
10: Add 1.5ml of DMSO (final 7%vol/vol) dropwise while gently shaking. 11:Incubate on ice for 10min.
12:Aliquot cells in 50-100ul into screw-cap tubes.
13:Free them by putting in liquid N2.The use of liquid N2 is critical for high transformation efficiency.
14:Keep cells in liquid N2.Alternatively the cells can be kept at higher temperature in deep freezer(-135℃or -80℃)although the transformation efficiency will be droping during the storage.通常保存于-80℃，一定注意不要频繁的造成温差，每次拿取尽量迅速，同时注意分装。