液相检测器

检测器的作用是将柱流出物中样品组成和含量的变化转化为可供检测的信号，常用检测器有紫外吸收、荧光、示差折光、化学发光、蒸发光等。

1.紫外可见吸收检测器（ultraviolet－visible detector，UVD）紫外吸收检测器是目前HPLC中应用最广泛的检测器。

其特点是灵敏度较高，线性范围宽，噪声低，对流速和温度变化不敏感，适用于梯度洗脱，对强吸收物质检测限可达1ng，检测后不破坏样品，可用于制备，并能与任何检测器串联使用。

它要求被检测样品组分有紫外吸收，使用的洗脱液无紫外吸收或紫外吸收波长与被测组分紫外吸收波长不同，在被测组分吸收波长处没有吸收。

紫外吸收检测器工作原理基于朗伯一比耳定律：其中A为吸光度（消光值）,Io为入射光强，I为透射光强，ε为样品的摩尔吸光系数，b为光程长，C为样品浓度。

紫外吸收检测器按光路系统可分为单光路和双光路。

单光路没有光路补偿，稳定性较差，作梯度洗脱时洗脱液组成变化将会引起基线漂移。

双光路以洗脱液做光路补偿，稳定性好，梯度洗脱时，由于光路补偿基线很稳定，一般高档仪器都采用双光路。

（1）紫外吸收检测器紫外吸收检测器常用氘灯作光源，氘灯则发射出紫外-可见区范围的连续波长，并安装一个光栅型单色器，其波长选择范围宽（190nm～800nm）。

它有两个流通池，一个作参比，一个作测量用，光源发出的紫外光照射到流通池上，若两流通池都通过纯的均匀溶剂，则它们在紫外波长下几乎无吸收，光电管上接受到的辐射强度相等，无信号输出。

当组分进入测量池时，吸收一定的紫外光，使两光电管接受到的辐射强度不等，这时有信号输出，输出信号大小与组分浓度有关。

局限：流动相的选择受到一定限制，即具有一定紫外吸收的溶剂不能做流动相，每种溶剂都有截止波长，当小于该截止波长的紫外光通过溶剂时，溶剂的透光率降至10%以下，因此，紫外吸收检测器的工作波长不能小于溶剂的截止波长。

（2）光电二极管阵列检测器（photodiode array detector，PDAD）也称快速扫描紫外可见分光检测器，是一种新型的光吸收式检测器。

它采用光电二极管阵列作为检测元件，构成多通道并行工作，同时检测由光栅分光，再入射到阵列式接收器上的全部波长的光信号，然后对二极管阵列快速扫描采集数据，得到吸收值(A)是保留时间(tR)和波长(l)函数的三维色谱光谱图。

由此可及时观察与每一组分的色谱图相应的光谱数据，从而迅速决定具有最佳选择性和灵敏度的波长。

单光束二极管阵列检测器，光源发出的光先通过检测池，透射光由全息光栅色散成多色光，射到阵列元件上，使所有波长的光在接收器上同时被检测。

阵列式接收器上的光信号用电子学的方法快速扫描提取出来，每幅图象仅需要10ms，远远超过色谱流出峰的速度，因此可随峰扫描。

2．荧光检测器（fluorescence detector，FD）荧光检测器是一种高灵敏度、有选择性的检测器，可检测能产生荧光的化合物。

某些不发荧光的物质可通过化学衍生化生成荧光衍生物，再进行荧光检测。

其最小检测浓度可达0.1ng／ml，适用于痕量分析；一般情况下荧光检测器的灵敏度比紫外检测器约高2个数量级，但其线性范围不如紫外检测器宽。

近年来，采用激光作为荧光检测器的光源而产生的激光诱导荧光检测器极大地增强了荧光检测的信噪比，因而具有很高的灵敏度，在痕量和超痕量分析中得到广泛应用。

a.荧光的产生从电子跃迁的角度来讲，荧光是指某些物质吸收了与它本身特征频率相同的光线以后，原子中的某些电子从基态中的最低振动能级跃迁到较高的某些振动能级。

电子在同类分子或其他分子中撞击，消耗了相当的能量，从而下降到第一电子激发态中的最低振动能级，能量的这种转移形式称为无辐射跃迁。

由最低振动能级下降到基态中的某些不同能级，同时发出比原来吸收的频率低、波长长的一种光，就是荧光。

被化合物吸收的光称为激发光，产生的荧光称为发射光。

荧光的波长总要长于分子吸收的紫外光波长，通常在可见光范围内。

荧光的性质与分子结构有密切关系，不同结构的分子被激发后，并不是都能发射荧光。

b.定量基础在光致发光中，发射出的辐射总依赖于所吸收的辐射量。

由于一个受激发的分子回到基态时可能以无辐射跃迁的形式产生能量损失，因而发射辐射的光子数通常都少于吸收辐射的光子数，它以量子效率Q来表示。

在固定的实验条件下，量子效率是个常数，通常Q小于1。

对可用荧光检测的物质来说，Q值一般在0.1～0.9之间。

荧光强度F与吸收光强度成正比.对于稀溶液，荧光强度与荧光物质溶液浓度、摩尔吸光系数、吸收池厚度、入射光强度、荧光的量子效率及荧光的收集效率等成正相关。

在其他因素保持不变的条件下，物质的荧光强度与该物质溶液浓度成正比,这是荧光检测器的定量基础。

荧光检测器属于溶质型检测器，可直接用于定量分析。

c.激发光谱和发射光谱荧光涉及光的吸收和发射两个过程，因此任何荧光化合物，都有两种特征的光谱：激发光谱(exitation spectrum)和发射光谱(emission spectrum)。

荧光属于光致发光，需选择合适的激发光波长(Ex)以利于检测。

激发波长可通过荧光化合物的激发光谱来确定。

激发光谱的具体检测办法是通过扫描激发单色器，使不同波长的入射光激发荧光化合物，产生的荧光通过固定波长的发射单色器，由光检测元件检测。

最终得到荧光强度对激发波长的关系曲线就是激发光谱。

在激发光谱曲线的最大波长处，处于激发态的分子数目最多，即所吸收的光能量也最多，能产生最强的荧光。

当考虑灵敏度时，测定应选择最大激发波长。

一般所说的荧光光谱，实际上仅指荧光发射光谱。

它是在激发单色器波长固定时，发射单色器进行波长扫描所得的荧光强度随荧光波长(即发射波长，Em)变化的曲线。

荧光光谱可供鉴别荧光物质，并作为荧光测定时选择合适的测定波长的依据。

另外，由于荧光测量仪器的特性，使光源的能量分布、单色器的透射率和检测器的响应等性能会随波长而变，所以同一化合物在不同的仪器上会得到不同的光谱图，且彼此间无类比性，这种光谱称为表观光谱。

要使同一化合物在不同的仪器上能得到具有相同特性的荧光光谱，则需要对仪器的上述特性进行校正。

经过校正的光谱称为真正的荧光光谱。

激发波长和发射波长是荧光检测的必要参数。

选择合适的激发波长和发射波长，对检测的灵敏度和选择性都很重要，尤其是可以较大程度地提高检测灵敏度。

3. 示差折光检测器（differential refractive Index detector，RID）示差折光检测器是一种浓度型通用检测器，对所有溶质都有响应，某些不能用选择性检测器检测的组分，如高分子化合物、糖类、脂肪烷烃等，可用示差检测器检测。

示差检测器是基于连续测定样品流路和参比流路之间折射率的变化来测定样品含量的。

光从一种介质进入另一种介质时，由于两种物质的折射率不同就会产生折射。

只要样品组分与流动相的折光指数不同，就可被检测，二者相差愈大，灵敏度愈高，在一定浓度范围内检测器的输出与溶质浓度成正比。

任意一束光由一种介质射入另一种介质时，由于两种介质的折射率不同而发生折射现象。

折射率（refactive）是一个无量纲的常数，光在真空中的速度和光在某种介质中的速度之比定义为该介质的折射率，其大小表明了介质光学密度的高低。

介质的折射率随温度升高而降低。

同一介质对不同波长的光，具有不同的折射率，在紫外和红外光谱区，折射率随波长变化大，在可见光谱区，折射率随波长增加而缓慢下降（图4-2-1）。

一般选用20℃时，两钠线的平均值589.3nm为检测波长测定溶剂的折射率，表示为nD。

表4-2-1 是常用溶剂在20℃时的nP值。

示差折光检测器是通过连续测定色谱柱流出液折射率的变化而对样品浓度进行检测的。

检测器的灵敏度与溶剂和溶质的性质都有关系，溶有样品的流动相和流动相本身之间折射率之差反映了样品在流动相中的浓度。

因此，示差折光检测器的响应信号由下式表示：式中，Z为仪器常数，n为溶液的折射率，n0为溶剂的折射率。

根据稀溶液中相加和定律，溶液的折射率等于溶剂和溶质各自的折射率乘以各自的摩尔浓度之和即示差折光检测器的响应信号与溶质的浓度成正比，说明它属于浓度型检测器。

每种物质都有一定的折射率，上式表明，原则上只要是与溶剂有差别的样品都可以用该检测器检测。

因此，示差折光检测器是一种通用型检测器。

样品的浓度越高，即ci越大，溶质与溶剂的折射率差别越大，即ni-n0值越大，检测器的响应信号越大。

4. 电化学检测器（elec）chemical detector，ED）电化学检测器主要有安培、极谱、库仑、电位、电导等检测器，属选择性检测器，可检测具有电活性的化合物。

目前它已在各种无机和有机阴阳离子、生物组织和体液的代谢物、食品添加剂、环境污染物、生化制品、农药及医药等的测定中获得了广泛的应用。

其中，电导检测器在离子色谱中应用最多。

电化学检测器的优点是：①灵敏度高，最小检测量～般为ng级，有目可达pg级；②选择性好，可测定大量非电活性物质中极痕量的电活性物质；③线性范围宽，一般为4～5个数量级；④设备简单，成本较低；⑤易于自动操作。

电化学检测器也是一种专用型检测器，池体积很小，灵敏度很高，最小检测量可达10-9～10-12g；线性范围宽。

一般为4～5个数量级；只能测定具有电解活性（电氧化一还原性）物质，同时要求洗脱液具有导电性（可向洗脱液中加入少量电解质，或在柱后补加适量电解质溶液，这并不影响分离效率）。

电化学检测器目前在生化、医学、食品、环境分析中得到广泛应用。

根据运行原理，电化学检测器可分为平衡电化学检测器和动态电化学检测器。

前者被测物质不发生氧化-还原反应，如电导检测器和pH检测器；后者被测物质发生氧化一还原反应，如极谱检测器，安培检测器和库仑检测器，它们都是以测量极化电极和参比电极间电流和所加电压的关系为基础，故统称伏安检测器。

以下对常用的电化学检测器作简单介绍。

（1）电导检测器电导检测器直接测定柱后洗脱液的电导变化。

将被测洗脱液置于施加电场的两个电极间，电导值1／R（R为两电极间电阻值）与电极截面积A，两电极间距离L和各离子的电导总和∑Cⅰλⅰ之间有如下关系:式中Cⅰ为i离子的摩尔浓度，λⅰ为i离子的摩尔电导。

在测定电导和pH值时，两电极间应没有氧化一还原反应发生，也就是不应有直流电流产生。

因此在测量电极间施加的是高频交流电压，或采用四电极或五电极电导测量技术，以有效地消除双电层电容和电解效应的影响。

（2）伏安检测器伏安检测器70％用于与生命科学有关的分析检测。

它的选择性好，可以在其它化合物存在的条件下检出某一欲测化合物，检测限可达1×10-10mol／L。

伏安检测器的工作原理是:当电解活性物质经过电极表面时。

若电极材料和溶液之间存在电位差，则在电极表面可以产生电极反应，形成电流，经微电流放大器放大后记录下来就可得到色谱图。