离子交换层析

球蛋白
白蛋白
IgM
球蛋白
7．洗脱液的收集 利用自动分步收集器收集，并以 20%磺基水杨酸测试，当蛋白液 下来时，开始分管收集，至无蛋白液为止。
8．交换柱的再生 将使用过的 DEAE－纤维素移入烧杯中，用 2Mol/L NaCl 液浸泡， 抽滤并洗涤数次。如不立即使用，可加 1/10 000 的叠氮钠防腐，保存于 4℃冰箱中。使用 时，再以碱－酸－碱处理。
洗脱部分
IgG IgG 运铁蛋白、纤维蛋白原 白蛋白、IgA IgM 白蛋白
表 1－7 各种 Ig 解脱吸附条件
不加 NaCl PB 离子强度（Mol/L） 0.01 0.025 0.035 0.040
0.10 0.40
pH 8.0 8.0 7.0 5.9
5.8 5.2~4.5
Ig
其他
IgG IgE IgA
二、凝胶层析
凝胶层析又称为分子筛层析或凝胶过滤。具有分子筛作用的物质很多，如浮石、琼脂、 琼脂糖、聚乙烯醇、聚丙烯酰胺、葡聚糖凝胶等。以葡聚糖凝胶应用最广，商品名是 sephadex 型号很多，从 G10 到 G200，它的主要应用范围是：①分级分离各种抗原与抗体； ②去掉复合物中的小分子物质。如除盐、荧光素和游离的放射性同位素以及水解的蛋白质 碎片；③分析血清中的免疫复合物；④分子量的测定。
溶液的 pH 值与蛋白质等电点相同时，静电荷为 0，当溶液 pH 值大于蛋白质等电点时， 则羧基游离，蛋白质带负电荷。反之，溶液的 pH 值小于蛋白质等电点时，则氨基电离， 蛋白质带正电荷。溶液的 pH 值距蛋白质等电点越远，蛋白质的电荷越多。反之则越少。 血清蛋白质均带负电荷，但各种蛋白质带负电荷的程度有所差异，以白蛋白为最多，依次 为 球蛋白， 球蛋白和 球蛋白。
样品的加量与 DEAE—纤维素有一个最适比的关系，超过这个比值，吸附就不完全，直 接影响到分离的纯度。经过粗提的 —球蛋白 50mg～100mg，用干重约 4g DEAE－纤维 素装柱分离，可获得理想结果。
6．洗脱 对于阴离子交换剂而言，洗脱的办法是使 pH 逐渐降低，而离子浓度逐渐升 高。一般的办法，是稳定一个因素而改变另一个因素洗脱。洗脱可采用分段洗脱和连续洗 脱法，前者较实用，后者较准确。
装柱时，先剪一块圆形的尼龙纱布（直径与层析柱内径一致），放入层析柱底部。将柱 下端连接细塑料管，夹上螺旋夹。把层析柱垂直固定在三角铁架上，倒入起始缓冲液至一 半的柱高，除去死区及塑料管内的气泡。再将平衡的 DEAE－纤维素糊状物沿管壁倒入柱 中。注意不要产生气泡，如有气泡应排除或重装。拧开螺旋夹，使流速至 1ml/5min，待 缓冲液快接近纤维素面时，继续倒入纤维素糊，同时用玻璃棒搅拌表面层，以免使两次加 入的 纤维素形成分界层，通过进出缓冲液调节流量，也可通过塑料管的升降来控制，至 柱床体积不变为止。剪一圆形滤纸（与柱内径大小一致），从柱的上端轻轻放入， 使其 沉接于纤维素床表面，以免在加样时打乱纤维素层。装好柱的柱面应该是平整的，无倾斜， 整个柱床内无气泡、不分层。继续平衡，使流出液的 pH 值与流入液的 pH 值完全一致为 止。
1．剂型的选择 根据蛋白质在所用缓冲液 pH 值下带电荷的种类选择，如 pH 高于蛋 白质等电点，应选阴离子交换剂，反之应选阳离子交换剂。一般情况下，DEAE-纤维素用 于分离酸性蛋白，而 CM 纤维素用于分离碱性蛋白质。
下面以 DEAE-纤维素操作为例，介绍试验方法
2．膨胀活化 此步的目的在于除去杂质，暴露 DEAE-纤维素上的极性基团。DEAE纤维素的用量则根据柱容积的大小和所需过柱样品的量来决定。一般是 1.0g DEAE-纤维 素相当于 6ml～8ml 柱床体积。
离子交换层析
一、概 述
离子交换层析技术是以离子交换纤维素或以离子交换葡聚糖凝胶为固定相，以蛋白质 等样品为移动相，分离和提纯蛋白质、核酸、酶、激素和多糖等的一项技术。
（一）原理
在纤维素与葡聚糖分子上结合有一定的离子基团，当结合阳离子基团时，可换出阴离 子，则称为阴离子交换剂。如二乙氨乙基（Dicthylaminoethyl，DEAE）纤维素。在纤维 素上结合了 DEAE，含有带正电荷的阳离子纤维素—O—C6 H14N+H，它的反离子为阴离 子（如 Cl-等），可与带负电荷的蛋白质阴离子进行交换。当结合阴离子基团时，可置换 阳离子，称为阳离子交换剂，如羧甲基（Carboxymethy， CM）纤维素。纤维素分子上带 有负电荷的阴离子（纤维素－O－CH2－COO 一），其反离子为阳离子（如 Na+等）,可与 带正电荷蛋白质阳离子进行交换。
3．平衡 将 DEAE—纤维素放入 0.0lMol/L pH 7. 4 PB 液中（即起始缓冲液），静止 1h，不时搅拌，待纤维素下沉后，倾去上清液或抽滤除去洗液，如此反复几次至倾出液体 的 pH 值与加入的 PB 液的 pH 值相近时为止。
4．装柱 层析柱的选择要大小、长度适当。一般而言，柱长和柱直径之比为 10︰1～ 20︰1，柱的内径上下要均匀一致。用前将层析柱在清洁液内浸泡处理 24h，然后依次用 常水、蒸馏水、起始缓冲液充分洗涤。
表 1－5 血清蛋白各成分的吸附与解吸的关系
成分 白蛋白
等电点 4.9
DEAE 吸附能力 强
解吸顺序 后
5.6
5.1
7.3
弱
先
表 1－6 血清的分段洗脱成分
NaCl 浓度（Mol/L） 0.025 0.030 0.040 0.060 0.150
0.01Mol/L PB（pH） 8.0 7.0 7.0 6.5 6.5
表 1－4 分离的血清与所需 DEAE—纤维素量及其他条件的大致关系
血清样品量 （ml） 1~2
5
10 20
DEAE 需用量 （g） 2
5
10 20
选层析柱规格 （cm） 1×25
2×12
2×20 2×37
选脱液量（ml）
100~150 200~300 300~400 400~800
称取所需的量，撒于 0.5Mol/L NaOH 溶液中（1g DEAE—纤维素干粉约需 15 倍 NaOH 液），浸泡 1h 左右，不时搅拌。抽滤（以布氏漏斗加两层滤纸或尼龙纱布抽滤）， 以蒸馏水洗涤，再抽滤，直至滤液近中性为止，再将纤维素浸泡于 0.5Mol/L HCl 中 1h， 同样抽滤液至近中性。再将纤维素浸于 0.5Mol/L NaOH 液中，同样处理，洗至中性。
（一）原理
凝胶是一种多孔性的不带表面电荷的物质，当带 有多种成分的样品溶液在凝胶内运动 时，由于它们的分子量不同而表现出速度的快慢，在缓冲液洗脱时，分子量大的物质不能 进入凝胶孔内，而在凝胶间几乎是垂直 的向下运动，而分子量小的物质则进入凝胶孔内 进行“绕道”运行，这样就可以按分子量的大小，先后流出凝胶柱，达到分离的目的。
表 1-2 商品 DEAE—纤维素和 C M 纤维素的类型和特性
纤维素形状长度来自DE-22 DE-23
改良纤维 改良纤维
（除细粒）
12~400
18~ 400
DE-32 DE-52 DE-11
微粒型 （干） 微粒型 （湿） 旧型号
24~63 24~63 50~250
CM-22
交换当量
（毫克当量/ 克）
蛋白质吸附容量
离子交换葡聚糖的选用，一般根据蛋白质的分子量而定。中等分子量（30 000-200 000） 一般选 A50 和 C50，而低分子量（＜30 000 和高分子量＞200 000）均宜选用 A25 和 C25。
（三）试验方法
阴离子交换剂与阳离子交换剂的装柱和层析过程基本相同。交联葡聚糖的预处理只需充 分溶胀和平衡，不需要除去细粒碎片和酸碱处理。其他步骤也基本同离子交换纤维素。
CM—-O-CH2-COO— P－-O- P O2－
SM－-O-CH2-SO3－ SE－-O-C2H4-SO3－
特点 最常用在 pH8.6 以下
强碱性、极高 pH 仍有效 最常用在 pH4 以上 用于低 pH
强酸性用于极 低 pH
在交换纤维素中，最常用的是 DEAE—纤维素和 CM 纤维素。由于剂型不同，其理化 性质和作用也有所差异。一般而言，微粒型要优于纤维素型，因为微粒型是在纤维素型的 基础上进一步提炼而成。它的交换容量大，粒细、比重大，能装成紧密的层析柱，要求分 辨力高的实验可用此型纤维素（见表 1－2）。
（二）常用离子交换剂的种类与特性
1.离子交换纤维素 离子交换纤维素的种类很多，其种类与特性如表 1－1 所示。
表 1-1 离子交换剂的类型与特点
交换剂
名 称（纤维 素）
二乙氨基乙基
阴离子 交换剂
三乙氨基乙基 氨乙基 胍乙基
羧甲基
阳离子 交换剂
磷酸
磺甲基 磺乙基
作用基团 DEAE+-O-C2H4N+(C2H5)2H DEAE+-O-C2H4N+(C2H5)2H AE+-O-C2 H4-N H2
9.1
9.1
6.8
6.7
6.8
6.7
型号同
离子交换纤维素的优点为：①离子交换纤维素为开放性长链，具有较大的表面积，吸 附容量最大；②离子基团少，排列稀疏，与蛋白质结合不太牢固，易于洗脱；③具有良好 的稳定性，洗脱剂的选择范围广。
2．离子交换交联葡聚糖 离子交换交联葡聚糖也是广泛使用的离子交换剂，它与离子 交换纤维素不同点是载体不同，常用交联葡聚糖的类型与特性见表 1-3。
在适当的盐浓度下，溶液的 pH 值高于等电点时，蛋白质被阴离子交换剂所吸附；当溶 液的 pH 值低于等电点时，蛋白质被阳离子交换剂所吸附。由于各种蛋白质所带的电荷不 同。它们与交换剂的结合程度也不同，只要溶液 pH 值发生改变，就会直接影响到蛋白质 与交换剂的吸附，从而可能把不同的蛋白质逐个分离开来。
表 1-3 常用交联葡聚糖的类型与特性