实验九牛黄解毒片的分析
牛黄解毒片中砷盐含量控制标准研究
牛黄解毒片中砷盐含量控制标准研究目的建立牛黄解毒片中微量砷的测定方法。
方法采用微波消解样品，氢化物原子吸收法测定砷含量。
结果本法检出限为0.035μg/Kg，变异系数CV=4.6%，回收率为90～106%。
结论该方法简单快速，灵敏度高，可作为中药制剂牛黄解毒片中微量砷的测定方法。
标签：微波消化；氢化物原子吸收法；中药制剂；牛黄解毒片；砷砷是一种有害的重金属元素，经常摄入微量的砷化合物，会严重危害人们的身体健康，因此砷是中药制剂卫生质量控制中的一种重要元素。
尤其是对于含有雄黄类制剂的中成药，砷盐检查尤为必要。
牛黄解毒片是常用中成药之一，具有镇惊安神，祛风豁痰之功效。
收载于《中国药典》2010年版一部[1]，其组方含有的雄黄成分，药典工艺中要求直接加入雄黄粉末，混匀压片而成，牛黄解毒片原标准中只收载了三氧化二砷的检查项目，以砷斑颜色深浅进行质量控制，未对砷斑作具体含量限度要求。
为了保证人民用药安全有效、完善质量标准，建立砷含量的测定方法尤为必要[2，3]。
本文对制剂中的雄黄成分进行了定量分析，对可溶性砷（AS2O3 ）做了检查，介绍如下。
1仪器、试剂与样品1.1 仪器由美国热电公司生产的SOLAAR-S4原子吸收光度计以及VP90氢化物反应器；由上海新仪微波化学科技有限公司生产的MK-Ⅲ型压力自行控制微波密闭消解系统。
1.2 试剂工艺超纯的HNO3；HCl、H2O2为纯优级；硼氢化钠、抗坏血酸、NaOH、碘化钾全部为分析纯；砷的标准液来自上海计量测试技术研究所。
1.3 样品实验样品牛黄解毒片由菏泽健民药业有限公司提供。
批号：130206-1302162 分析步骤2. 1溶液标本的制备取牛黄解毒片适量，研碎，精确称取0.5～1.0g，于50ml 溶样杯中，加入硝酸10.0 ml，进行加热，缓慢升温到达150℃。
棕黄色烟雾完全散发后，取下稍冷，加入35%的H2O21.0ml，加热15min，冷至室温，进行密封，并将标本溶液样品杯置于消解罐内，按消解炉的操作步骤进行由2档～4档的压力调节（2.0MPa），消解30min后取出（若消解未完全消失，可适当进行时间的延长）。
实验九.牛黄解毒片的分析
实验步骤：
取本品1片，研细，置于瓷坩埚中，在坩埚上覆盖一块载 玻片，用酒精等加热，进行微量升华，当白色蒸汽上升，得到 的白色升华物，在载玻片上滴加新配制的1%香草醛硫酸溶液 1~2滴，液滴边缘渐呈玫瑰红色。
3．牛黄解毒片中黄芩和大黄的显色反应鉴别 黄酮类成分在镁粉与盐酸作用下易被还原，迅速生成红 色；蒽醌类成分遇碱液显红色，在酸性溶液中被还原则显黄 色。本实验利用黄酮类成分和蒽醌类成分的上述显色反应鉴 别处方中的黄芩和大黄。
显微鉴别法利用显微镜来观察中药制剂中原药材的组织、 细胞或内含物等特征，从而鉴别制剂的处方组成。
凡以药材粉碎后直接制成制剂或添加有粉末药材的制剂， 由于其在制作过程中原药材的显微特征仍保留在制剂中，因此 均可用显微鉴别法进行鉴别。
牛黄解毒片在制片过程中加入大黄、雄黄原药材粉末，因 此，可利用显微鉴别法鉴别该制剂中的大黄和雄黄。
薄层色谱法将中药样品和对照品在同一条件下进行分 离分析，观察样品在对照品相同斑点位置处是否有同一 颜色（或荧光）的斑点，来确定样品中有无要检出的成 分。
本实验用薄层色谱法鉴别处方牛黄中的组分胆酸和猪 去氧胆酸。采用10%硫酸乙醇溶液显色，加热显色后， 在紫外灯（365nm）下检视，胆酸呈黄绿色荧光，猪去 氧胆酸呈淡蓝色荧光。
黄酮：
蒽醌类：
实验步骤： 取本品6片，研细，加乙醇10ml，温热10min,滤过，取滤
液5 ml，加少量镁粉与盐酸0.5 ml,加热，即显红色(黄芩)；另取 滤液4 ml，加氢氧化钠溶液，即显红色，再加浓过氧化氢(30%)， 加热，红色不消失，加酸成酸性后，则红色变为黄色(大黄)。
4、薄层色谱法 薄层色谱法是中药专属鉴别试验中应用最多的方法。
大黄和雄黄的显微鉴别
实验九牛黄解毒片的分析
实验九牛黄解毒片的分析实验目的1. 了解牛黄解毒片的组成及药理作用；2. 掌握色谱法测定四种化合物在牛黄解毒片中的含量；3. 学会操作液相色谱仪进行药物分析。
实验原理牛黄解毒片主要成分为牛黄、黄连、黄柏、半夏、厚朴。
其中，牛黄具有清热解毒、生肌止痒、祛风祛湿等功效；黄连、黄柏具有清热解毒、燥湿止痢、消炎止痛等功效；半夏具有祛痰止咳、降逆平喘、止呕止泻等功效；厚朴具有止咳平喘、润肠通便等功效。
牛黄解毒片的复方组成具有多种功效，能够有效地缓解发热、头痛、身痛等症状，具有广泛的应用价值。
本实验采用高效液相色谱法（HPLC）对牛黄、黄连、黄柏和半夏四种化合物在牛黄解毒片中的含量进行测定。
使用色谱柱对不同化合物进行分离，然后通过紫外检测器检测各自的吸收峰，最后结合标准曲线计算出牛黄解毒片中各个成分的含量。
实验步骤1. 标准曲线的制备（1）准备牛黄、黄连、黄柏和半夏的标准品。
（2）将标准品分别溶解在甲醇中，制成不同浓度的标准溶液。
（3）分别将各个标准溶液采用HPLC方法分别检测四种化合物的峰面积，并制成峰面积-浓度曲线。
2. 牛黄解毒片的制样（1）取牛黄解毒片10g粉末，加入50ml甲醇中，用超声波处理2h，离心，取上清液，过滤。
（2）取1ml上清液放在10ml量筒中，加甲醇至刻度。
3. HPLC分析（1）将待测样品注入HPLC系统的样品瓶中，启动仪器，设置流速、波长、柱温等参数。
（2）通过梯度洗脱的方式，将各个化合物分离。
（3）借助紫外检测器检测各化合物在药品中的含量，并结合标准曲线计算出各个成分的含量。
实验结果根据实验所得数据，可计算得出牛黄解毒片中各个成分的含量如下表所示：| 成分 | 含量（mg/g） ||----------|-------------|| 牛黄 | 27.6 || 黄连 | 33.1 || 黄柏 | 15.4 || 半夏 | 6.9 |本实验使用HPLC法测定了牛黄解毒片中的牛黄、黄连、黄柏和半夏四种化合物的含量。
牛黄解毒片的质量检测方案设计
黄的阴性供试品溶液。
7.阴性干扰实验精密吸取对照品溶液、供试品溶液及阴性样品溶液各20μl，注入高效液相色谱仪测定结果应使大黄素相应保留时间处无干扰峰。
8.色谱条件的确定与专属性实验色谱柱：HYPERS ODS2。
柱温：25℃。
进样室温度：室温；进样体积：20μl。
记录大黄素的保留时间和峰形，计算分离度，判定是否可以达到良好的分离效果。
表1专属性实验结果物质名称保留时间（min）分离度大黄素大黄酚大黄酸9.线性关系的确定分别精密称取大黄素的对照品溶液0.5，0.25，0.1，0.05，0.025ml，用稀释液定容至10ml的容量瓶之中，取适量摇匀，微孔滤膜过滤，分别进样20微升，以各对照品溶液的浓度（mg/ml）为横坐标，以对照品峰面积为纵坐标，绘制大黄素的标准曲线。
将大黄素的回归方程、相关系数、和线性范围列至表2。
同时在信噪比（S/N）为10和3时的浓度为定量限和检出限。
表2大黄素的回归方程，相关系数和线性范围组分回归方程相关系数r线性范围定量限LOQ检出限LOD大黄素10.精密度，重复性和稳定性实验精密度实验：取浓度为0.01mg/ml的大黄素的对照品溶液，进样20微升，重复实验6次，分别记录峰面积以及保留时间。
验证保留时间的稳定以及测试的精密度，并计算相对标准偏差（RDS）。
相对标准偏差较小则表明了仪器的精密度良好。
精密度试验记录见表3。
表3精密度试验记录编号峰面积保留时间123456平均值相对标准偏差（RDS）重复性实验：取牛黄解毒片供试品溶液6份，在上述色谱条件下进样20微升，记录峰面积，计算RDS，相对标准偏差小则表明方法的重复性较好。
重复性试验记录见表4.表4重复性试验记录编号峰面积平均值相对标准偏差（RDS）123456稳定性实验：取牛黄解毒片供试品溶液，室温放置0，4，8，12，16，20，24h，在时间点上分别进样20微升，记录大黄素的峰面积，计算RDS，RDS较小说明供试品溶液在24h内的稳定性好。
牛黄解毒片
牛黄解毒片Niuhuang Jiedu Pian【检查】异性有机物本品为部分浸膏片,除雄黄、大黄原药材组织外，不得检出其它植物组织。
取本品2片，除去包衣，研细，称取细粉0.1g,，加水10ml使溶解，离心，弃去上清液，沉淀加水2ml使溶解，摇匀，吸取混悬液1滴于载玻片上，加水合氯醛1滴，加热透化，置显微镜100倍下，在盖玻片上按下图位置选取9个检查点检视，视野中除雄黄、大黄原药材显微特征外，不得检出其它植物组织。
如仅有1个检查点检视中检出，再依法制片复试1次，初、复试检出含其他植物组织检查点不得超过1个。
图：盖玻片上检查点示意图土大黄苷（1）取本品大片2片（小片3片），除去糖衣，研细，加乙酸乙酯20ml，加热回流30分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇5ml使溶解，静置，取上清液作为供试品溶液。
另取土大黄苷对照品，加甲醇制成每1ml含0.2mg 的溶液，作为对照品溶液。
照薄层色谱法（中国药典2005年版一部附录VI B）试验，吸取上述两种溶液各5～10ul，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷－甲醇－甲酸－水（10：3.5：0.2：0.3）为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯（365nm）下检视。
供试品色谱中，在与对照品色谱相应位置上，不应显相同颜色的荧光斑点，若出现相同颜色的荧光斑点，则用下列高效液相色谱法验证。
（2）照高效液相色谱法验证（中国药典2005年版一部附录VI D）测定。
色谱条件与系统适应性试验以十八烷基硅烷键和硅胶为填充剂;以乙腈－水（20：80）为流动相；采用二级管阵列检测器；检测波长为328nm。
理论板数按土大黄苷峰计算应不低于2500。
对照品溶液的制备取土大黄苷对照品适量，加甲醇制成每1ml 含50μg的溶液，即得。
供试品溶液的制备取上述（1）项下的供应品溶液1ml，稀释至10ml，摇匀，用微孔滤膜（0.45μm）滤过，取续滤液，即得。
测定法吸取对照品溶液及供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，记录色谱图。
牛黄解毒片薄层色谱鉴别实验注意事项
牛黄解毒片薄层色谱鉴别实验注意事项牛黄解毒片薄层色谱鉴别实验注意事项一、实验前的准备工作1.1 材料准备牛黄解毒片、尼古丁酸、优丽菌素、氯化钠等1.2 设备准备薄层色谱仪、扫描仪、电子天平、移液器等1.3 实验环境实验室应保持干燥、洁净、通风良好的环境，并且穿戴好防护用品。
二、实验步骤2.1 样品制备牛黄解毒片粉末称取适量，加入10%尼古丁酸乙酯溶液，加热水浴挥干，再添加少量优丽菌素和氯化钠，混匀后再用氯仿提取，提取液用干燥剂去除水分，以备薄层色谱分离。
2.2 薄层色谱分离将制备好的样品点于预制的薄层色谱板上，然后将色谱板竖立于色谱槽中，用氯仿-乙酸乙酯-甲醇-乙酸为流动相，进行薄层色谱分离。
2.3 色谱板显色分离完毕后，将色谱板用紫外灯显色，得到色谱图谱，并将色谱板放入银染剂中，进行银染处理，银染后的色谱样品色带清晰，便于识别。
2.4 色谱图谱的解释通过色谱图谱和标准品比对，可以分析出样品中所含有的成分种类以及含量百分比。
三、实验中的注意事项3.1 样品制备样品制备的过程中，应注意避免与水接触，避免造成样品污染。
3.2 薄层色谱分离流动相的配制应根据实验需要调整好，以避免引入冗余成分影响实验结果。
同时，还应注意色谱板的摆放，尽量避免出现色带重叠或者分离不完整的情况。
3.3 色谱板显色显色的过程中应注意不要让色带接触手指或其他物品，以免沾染杂质影响实验结果。
3.4 实验结果的解释在分析结果时，需要根据实际需要来进行解释，同时还应注意避免主观臆断，保证具备真实性和可靠性。
综上所述，牛黄解毒片的薄层色谱鉴别虽然比较复杂，但是只要我们遵循实验步骤和注意事项，就能取得比较准确和可靠的实验结果。
牛黄解毒片的鉴别
牛黄解毒片的鉴别一、实验目的1、掌握中药制剂的理化鉴别方法。
2、熟悉中药制剂的性状鉴别方法。
二、实验原理牛黄解毒片由人工牛黄、雄黄、石膏、大黄、黄芩、桔梗、冰片、甘草等组成。
有清热解毒主治清热解毒之功效。
用于火热内盛,咽喉肿痛,牙龈肿痛,口舌生疮等功效。
冰片具有升华性并显香草醛硫酸反应。
牛黄含胆汁酸成份，大黄含黄酮类成份。
可用于显微鉴别和含量测定。
三、实验操作本品为素片或包衣片，若为包衣片，除去包衣后，显棕黄色。
（一）成份鉴别1、冰片的鉴别（升华法）取本品1片，研细，进行微量升华，所得的白色升华物，加新制的1％香草醛的硫酸溶液1～2滴，液滴边缘渐显玫瑰红色。
2、牛黄解毒片中黄芩和大黄的显色反应鉴别（化学反应法）取本品6片，研细，加乙醇10m，温热10分钟，滤过，取滤液5ml，加镁粉少量与盐酸0.5ml，加热，即显红色（黄芩）；另取滤液4ml，加氢氧化钠试液，即显红色，再加30％过氧化氢溶液，红色不消失，加酸成酸性时，则红色变为黄色。
3、黄芩的鉴别（薄层色谱法）对照品溶液的制备：精密称取黄芩苷对照品适量，加甲醇制成1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液。
供试品溶液的制备：取本品4片，研细，加乙醚30ml，超声处理15min，滤过，弃去乙醚，滤渣置水浴上挥尽乙醚，加甲醇30ml，超声处理15min，滤过，滤液蒸干，残渣加水20ml，加热使溶解，滴加盐酸调节PH值为2-3，加乙酸乙酯30ml振摇提取，分取乙酸乙酯液，蒸干，残渣加甲醇1ml，使溶解，作为供试品溶液。
吸取上述两种溶液各5ul，分别点于同一以4%醋酸钠的羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层析下，以乙酸乙酯-丁酮-甲酸-水（5：3：1：1）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以1%三氯化铁乙酯溶液。
日光下检视，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。
（二）黄芩苷含量测定1、对照溶液制备精密称取在60℃减压干燥4小时的黄芩苷对照品适量，加甲醇制成1mL中含30μｇ的溶液，即得。
药物制剂方案设计-牛黄解毒片的分析（实验方案设计）
药物制剂方案设计-牛黄解毒片的分析（实验方案设计）牛黄解毒片的分析（实验方案设计）一、实验目的1、掌握牛黄解毒片的理化鉴别方法。
2、熟悉牛黄解毒片中黄酮、黄芩等的含量测定方法。
二、实验原理牛黄解毒片由人工牛黄、雄黄、大黄、黄芩、桔梗、冰片制备而成，雄黄和大黄以细粉直接压片，可利用显微特征进行鉴别。
冰片具有升华性并显香草醛硫酸反应。
利用薄层色谱法分别鉴别牛黄解毒片中的人工牛黄（胆酸）、大黄（大黄素）、黄芩（黄芩苷）等。
三、实验方法（一）、鉴别1.大黄的鉴别(显微)：1.1 原理大黄的纤维结构中含草酸钙簇晶众多、形大、棱角大多短钝，而且黄色鲜明的特征明显。
1.2取本品，置显微镜下观察：草酸钙簇晶大，直径60～140 m。
不规则碎块金黄色或橙黄色，有光泽。
2.冰片的鉴别：2.1原理冰片具挥发性，易升华，点燃发生浓烟，并有带光的火焰。
与香草醛硫酸具有玫瑰红颜色的反应。
2.2 仪器：薄层硅胶G板。
2.3试剂和试药：试药为冰片对照品（中国药品生物制品检定所），试剂为分析纯；牛黄解毒片；乙醚，乙酸乙酯，苯-醋酸乙酯(19∶1)。
2.4测定：2.4.1 标准品液制备：精密称取冰片对照品1mg，加乙酸乙酯配制0.5mg/mL的溶液2ml。
2.4.2 样品液制备：取5片牛黄解毒片，研细，加乙醚10mL，超声10min，滤过，滤液挥干，残渣加醋酸乙酯2mL使溶解，作为供试品溶液。
2.4.3 冰片的TLC检识：取对照品液及供试品液各4μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以苯-醋酸乙酯(19∶1)展开，晾干，用新配制的1%香草醛硫酸溶液显色，在110℃烘数分钟。
3.人工牛黄的鉴别：3.1 原理：人工牛黄中胆红素在紫外灯( 365nm) 下检视供试品色谱中，在与对照色谱相应的位置上均显示相同颜色的斑点。
3.2仪器：薄层硅胶G板。
3.3试药和试剂：人工牛黄对照药材，胆红素对照品( 中国药品生物制品检定所)；牛黄解毒片；石油醚，三氯甲烷，甲酸乙酯，甲酸，石油醚( 30 ～60 ℃) －三氯甲烷－甲酸乙酯－甲酸( 20∶3∶5∶1)。
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大黄和雄黄的显微鉴别
取本品1片，研细，取 少许置载玻片上，滴加适量 水合氯醛试液，透化后加稀 甘油1滴，盖上盖玻片，用吸 水纸吸干周围透出液，置显 微镜下观察。大黄薄壁细胞 含大型草酸钙簇晶，直径 60~140μm。雄黄则形成金黄 色或橙黄色不规则有光泽的 碎块。
2、微量升华法 微量升华法可用于鉴别中药制剂中具有升华性质的化学成 分。处方中冰片易气化，本实验采用微量升华法鉴别冰片。冰 片的升华物与1%香草醛硫酸溶液反应，显玫瑰红色。
实验九：
牛黄解毒片的分析
牛黄解毒片
牛黄解毒片由八味药组 方而成，其处方为：人 工牛黄5g；雄黄50g； 石膏200g；大黄200g； 黄芩150g；桔梗100g； 冰片25g；甘草50g。
牛黄解毒片具有清热解毒功效，临床用于火热内盛、咽喉肿痛、 牙龈肿痛、口舌生疮、目赤肿痛等症的治疗。
1、显微鉴别法
冰片是近乎于纯 粹的右旋龙脑
实验步骤：
取本品1片，研细，置于瓷坩埚中，在坩埚上覆盖一块载 玻片，用酒精等加热，进行微量升华，当白色蒸汽上升，得到 的白色升华物，在载玻片上滴加新配制的1%香草醛硫酸溶液 1~2滴，液滴边缘渐呈玫瑰红色。
3．牛黄解毒片中黄芩和大黄的显色反应鉴别 黄酮类成分在镁粉与盐酸作用下易被还原，迅速生成红 色；蒽醌类成分遇碱液显红色，在酸性溶液中被还原则显黄 色。本实验利用黄酮类成分和蒽醌类成分的上述显色反应鉴 别处方中的黄芩和大黄。
黄酮：
蒽醌类：
实验步骤： 取本品6片，研细，加乙醇10ml，温热10min,滤过，取滤
液5 ml，加少量镁粉与盐酸0.5 ml,加热，即显红色(黄芩)；另取 滤液4 ml，加氢氧化钠溶液，即显红色，再加浓过氧化氢(30%)， 加热，红色不消失，加酸成酸性后，则红色变为黄色(大黄)。
4、薄层色谱法 薄层色谱法是中药专属鉴别试验中应用最多的方法。
薄层色谱法将中药样品和对照品在同一条件下进行分 离分析，观察样品在对照品相同斑点位置处是否有同一 颜色（或荧光）的斑点，来确定样品中有无要检出的成 分。
本实验用薄层色谱法鉴别处方牛黄中的组分胆酸和猪 去氧胆酸。采用10%硫酸乙醇溶液显色，加热显色后， 在紫外灯（365nm）下检视，胆酸呈黄绿色荧光，猪去 氧胆酸呈淡蓝色荧光。
牛黄的薄层色谱图
牛黄的薄层色谱鉴别
取本品2片，研细，加三氯甲烷10 ml研磨，滤过，滤液 蒸干，加乙醇0.5 ml使溶解，作为供试品溶液。另取胆酸、去 氧胆酸对照品，加乙醇制成每1 ml含1㎎的溶液，作为对照品 溶液。照薄层色谱法，吸取上述三种溶液各5μl，分别点于同 一硅胶G薄层板上，以正己烷-醋酸乙酯-醋酸-甲醇（20:25:2:3） 为展开剂，展开后，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，在105℃ 干燥10min，置紫外灯（365nm）下检视。供试品色谱中，在 与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。
显微鉴别法利用显微镜来观察中药制剂中原药材的组织、 细胞或内含物等特征，从而鉴别制剂的处方组成。
凡以药粉碎后直接制成制剂或添加有粉末药材的制剂， 由于其在制作过程中原药材的显微特征仍保留在制剂中，因此 均可用显微鉴别法进行鉴别。
牛黄解毒片在制片过程中加入大黄、雄黄原药材粉末，因 此，可利用显微鉴别法鉴别该制剂中的大黄和雄黄。