关于质粒抽提的杂菌污染问题解决方案
分子生物学实验中常见的问题与对策-9
分⼦⽣物学实验中常见的问题与对策-9⼀、质粒提取常见问题分析与策略1.⽤试剂盒未提出质粒或质粒得率低有哪些原因？1）细菌⽼化请凃布平板培养后，重新挑选新菌落进⾏液体培养。
2）细菌培养物⽣长过度或不新鲜不要于37℃培养超过16⼩时，分离质粒前长时间存放培养物是不利的。
3）质粒拷贝数低由于使⽤低拷贝数载体引起的质粒DNA提取量低，可更换具有相同功能的⾼拷贝数载体。
4）菌体中⽆质粒有些菌体本⾝不能在某些菌种中稳定存在，经多次转接后有可能造成质粒丢失。
例如柯斯质粒在⼤肠杆菌中长期保存不稳定，因此不要频繁转接，每次接种时应该接种单菌落。
另外检查筛选⽤抗⽣素使⽤浓度是否正确。
5）菌体过量，碱裂解不充分取样时菌液过多，导致菌体裂解不充分，可减少菌体⽤量或增加溶液悬浮液、裂解液、中和液的⽤量。
对低拷贝数质粒，提取时可加⼤菌体⽤量并加倍增加溶液悬浮液、裂解液、中和液的⽤量（应保持1：1：1.4⽐例）。
6）溶液使⽤不当溶液裂解液、中和液在温度较低时容易出现盐析，如出现，应将其放⼊37℃⽔浴⾄完全溶解、澄清，⽅可使⽤。
7）质粒未全部溶解（尤其质粒较⼤时）洗脱溶解质粒时，可适当加温或延长溶解时间。
8）⼄醇残留洗涤液Ⅱ洗涤后应离⼼并静置数分钟尽量去除残留⼄醇后，再加⼊洗脱液洗脱回收。
9）洗脱液加⼊位置不正确洗脱液应加⼊吸附柱中膜的中央以确保洗脱液完全覆盖吸附膜的表⾯达到最⼤洗脱效率。
10）洗脱效率：洗脱效率与洗脱液PH值、洗脱液⽤量、洗脱次数、加⼊洗脱液后的静置时间和是否预热等因素有关。
PH7.0－8.5之间，洗脱液⽤量不得⼩于50µl，重复洗脱2-3次，增加室温静置时间及65℃⽔浴预热可以有效提⾼得率30%。
2.试剂盒提取质粒纯度不⾼，如何解决？1）有蛋⽩质污染应在加⼊去蛋⽩液后，以⾜够⾼的转速离⼼，使沉淀紧密，并⼩⼼地吸取上清液，避免吸⼊沉淀。
另外，不要使⽤过多菌体。
经悬浮液、裂解液、中和液处理，离⼼后溶液应为澄清的，如果还混有微⼩蛋⽩悬浮物可再次离⼼去除后再进⾏下⼀步骤。
如何避免食用菌接种环节的杂菌污染
摸索蘑菇种植规律 。功夫不负有心人 ，蘑菇 种植 当年就给他带来丰厚的收入 ，
年产值 达８ 万元 ，纯收入５ 万元 以上 。
依靠种植蘑 菇使袁德 永走上致富路 ，但他并没有忘记带动乡亲共 同致富 。 当他成功的消息传遍 了周边村庄 ，吸引不少 人过来取经学艺时 ，他不管是生人
还 是亲戚朋 友 ，总是热情接待 ，毫无保 留地传授香菇 生产 经验 和技术。如今 ，
在 他的帮助下 ，江苏连云港 、新沂和本县周 围一 些农 民也种起 了蘑 菇 ，开始 走 上 蘑菇致富路。 （ 李静 良 山东省 郯城县 归昌 乡党委 邮编 ：２ ７ ６ １ ２ ２）
１ ． 各种 接种工具 和用 品等应随 同料 中暴 露时 间过长 ， “ 准” 指的是接 种动 袋 、料 瓶 、菌种等一 并进行 消毒处理 ，
２ ． 接 种 箱 消 毒 使 用 物 无菌 操 作 规 程 。
气 雾 消毒 剂 、福尔 马林 等对 空气 消毒 时 ，会 发 生 氧化 反 应产 生 大量 的 热 量 ，因此 ，在保 证 消 毒 效果 的 前提 下 ，消 毒 剂的使用不宜过量。 ３ ． 提 高接 种速 度 ， 控 制 好接 种 时间 。接 种 速 度慢 、时 间长 ，不 仅 工 作 效率 低 、生产 周 期
品。
作要 准确 到位过程 中 向箱 内传 递 物 要到处乱撞 、乱放 。 ５ 、接种操作完毕 ，及时移走物品 ， ２ 。 进箱操作前 ，在箱外用清水洗净双 并将箱 内收拾干净 。
三 、避 免接种箱 内空气 杂茵 引起的
焰 “ 封 口”的 目的。 ４． 接 种操 作 要做 到 “ 轻 、快 、
使用 同一种 消毒剂 引起消毒 效果差 ，生 产上 应注意 不 同的消毒剂 轮换使用 ）。
《防止杂菌污染的技术》 讲义
《防止杂菌污染的技术》讲义一、引言在各种生产和实验环境中，防止杂菌污染是至关重要的。
杂菌的污染不仅会影响产品的质量和产量，还可能导致严重的安全问题。
因此，掌握有效的防止杂菌污染的技术是必不可少的。
二、杂菌污染的来源（一）空气传播空气中存在着大量的微生物，如细菌、真菌孢子等。
在通风不良的环境中，这些微生物容易随着空气流动进入工作区域，造成污染。
（二）人员带入操作人员自身可能携带杂菌，如皮肤表面、衣物上的微生物。
在操作过程中，如果不遵循严格的卫生规范，就容易将杂菌引入到工作环境中。
（三）原材料污染原材料在采集、运输和储存过程中，如果受到污染，也会成为杂菌的来源。
（四）设备和器具未经过彻底清洁和消毒的设备、器具表面可能附着有杂菌。
三、防止杂菌污染的技术措施（一）环境控制1、清洁和消毒定期对工作环境进行彻底的清洁，包括地面、墙壁、天花板等。
使用有效的消毒剂，如含氯消毒剂、过氧乙酸等，按照规定的浓度和作用时间进行消毒处理。
2、通风系统安装良好的通风系统，保证空气的流通和新鲜。
可以采用过滤装置，如高效空气过滤器（HEPA），过滤空气中的微生物。
3、温度和湿度控制保持适宜的温度和湿度条件，不同的生产或实验环境可能有不同的要求，但一般来说，较低的温度和湿度不利于微生物的生长繁殖。
（二）人员管理1、培训对操作人员进行严格的培训，使其了解杂菌污染的危害和预防措施，掌握正确的操作方法和卫生规范。
2、着装要求操作人员应穿着专门的工作服、帽子、口罩和手套，进入工作区域前要进行清洁和消毒。
3、洗手和消毒在操作前后，操作人员要严格洗手，并使用消毒剂进行消毒。
（三）原材料控制1、采购选择质量可靠的原材料供应商，确保原材料在采集和运输过程中不受污染。
2、检验对原材料进行严格的检验，检测是否存在杂菌污染。
对于有污染风险的原材料，要进行预处理，如消毒、灭菌等。
3、储存原材料应储存在适宜的环境中，避免受潮、受污染。
（四）设备和器具的清洁与消毒1、定期清洁制定设备和器具的清洁计划，定期进行拆卸、清洗和消毒。
质粒提取实验注意事项
质粒提取实验注意事项质粒提取是分子生物学中常用的实验技术之一，它能够从细菌中提取目标质粒，用于后续的转染、定量PCR、序列测定等实验。
质粒提取实验虽然操作简单，但是仍然需要遵循一定的注意事项，才能确保实验的顺利进行和结果的准确性。
下面将介绍质粒提取实验的注意事项。
1. 实验前的准备工作：在进行质粒提取实验之前，首先要做好实验室的准备工作。
要确保实验室中的工作台、仪器和试剂瓶都是干净整洁的，避免污染影响实验结果。
另外，要准备好所需的耗材和试剂，如离心管、离心管架、洗涤缓冲液、溶解缓冲液等。
并根据实验计划，提前准备好质粒所在的宿主菌培养液，提取缓冲液等相关材料。
2. 操作过程中的注意事项：在进行质粒提取实验的操作过程中，需要严格遵守操作规程，确保实验操作的准确性和稳定性。
在进行菌培养和离心等步骤时，要避免振荡或剧烈振动，以免对菌体和质粒的完整性产生影响。
另外，在使用洗涤缓冲液、溶解缓冲液和纯化缓冲液时，要注意溶液的pH值和温度是否符合要求，以及是否在有效期内。
同时要注意防止留下DNA和蛋白质残留，避免污染影响后续实验。
3. 质粒提取后的保存和处理：在完成质粒提取实验后，提取得到的质粒需进行适当的保存和处理。
一般情况下，提取得到的质粒可以用无菌的ddH2O或TE缓冲液溶解后，分装成适量的小份，然后在-20或更低的温度下保存。
另外要注意标记好每份提取得到的质粒，以免混淆。
在进行保存和后续实验过程中，要避免频繁的冻融，以免对质粒的完整性产生影响。
4. 实验后的清洁和记录工作：在完成质粒提取实验后，要及时清理实验台和操作工具，保持实验室的整洁。
同时要详细记录实验过程中的操作步骤、使用的试剂和仪器，以及实验结果等相关信息。
这些记录对于实验结果的分析和后续实验的开展都是十分重要的。
总之，质粒提取实验是一项重要的实验技术，在进行实验时需要严格遵循操作规程，注意操作细节，确保实验结果的准确性和可靠性。
希本通过本文介绍的注意事项，能够帮助实验人员顺利进行质粒提取实验，并获得高质量的实验数据。
质粒提取常见问题
细菌太老，活力不够 质粒为严谨型 在 DNA 结合溶液中已经 形成沉淀
画线培养细菌使之活化。 使用 5-10ml 菌液但是不要超过 10ml 菌液。
将 DNA 结合溶液加热到 37℃混匀冷却到 30℃备用。
DNA 结合柱太干 用错试剂
步骤 7 之后立即用 DP 洗脱液洗脱。 请仔细核对试剂名称。
用自动 荧光 测序没 有结果
悬器或剧烈震荡
紫外测定 DNA 浓度 低于琼 脂糖 凝胶测 定浓度
微量的 污染物 同时 被洗脱 出来， 会影响 紫外 分光光 度计读数
用酚/仿抽提， 酒精沉淀，70%酒 精清洗后干燥， 水溶，重 新紫外定量。
质粒酶切效果不好
要优化
使用 TE 缓冲液 使用 EndA+菌株导致 DNA 在酶切时降解
总体积的 1/10，酶切时间不要超过 2 小时。 尽量使用 DP 洗脱液洗脱。 在步骤 5 之后用 1ml 40%异丙醇/4.2M 盐酸胍溶液清洗 DNA 胞 裂解溶 液后 使用涡 加细胞裂解溶液后不要剧烈震荡
测序反应体系中 DNA 的 量加得不够
使用 TE 洗脱
杂质多 内切酶 浓度和 酶切 时间需
提取的质粒要经过琼脂糖凝胶电泳定量。要使用新鲜的 LB 培养基和新活化的菌株摇菌。
最好使用 DP 洗脱液洗脱（TE 中的 EDTA 能降低测序反应 中 M g2+的有效浓度）。 重复步骤 6。 尽量使用内切酶 的最佳酶切 缓冲液；内 切酶浓度不 要超过
DNA 结合柱中酒精没有除 增加步骤 7 的离心时间，如果 DNA 已经洗脱出来，可以用
干净。
酒精沉淀 DNA 并风干，然后水溶。
摇细菌 时间太 长， 造成空 菌生长过量。
确认是否所有的 培养基都加 了抗生素， 不要培养细 菌超过 24 小时（固体/液体培养基），一般 12-16 小时已经足够。
质粒提取中常见的问题
质粒提取中常见的问题质粒DNA提取常见问题分析1.加入solution.III，经10分钟离心后细菌沉淀怎么不结实，有的漂浮在液面，有的贴在离心管壁上，一摇晃即破碎脱落下来？细菌的用量太少，导致产生的沉淀主要是盐分的沉淀，因为缺少变性的细菌蛋白和细菌基因组DNA 的缠绕，沉淀就显得不结实。
解决方法：将细菌的用量增加。
2.加入soln.III，经10分钟离心后细菌沉淀怎么不结实，呈大块的水泡状，上清较少？（1）使用了过多的细菌，导致菌体未被有效裂解。
解决方法：将细菌用量减半。
（2）细菌悬浮不充分,存留小菌块, 导致菌体未被有效裂解。
解决方法：注意将细菌悬浮充分。
（3）加Solution III后中和不充分。
解决方法：如果细菌用量较多，请注意多翻转几次直至中和后的沉淀呈松散的豆腐花状(也可以稍用力混合直至沉淀呈松散的豆腐花状)。
（4）Solution II出现沉淀。
解决方法：如果实验室内温度低于15℃，使用试剂盒前请注意观察Solution II中是否出现沉淀。
如果出现沉淀，请于37℃水浴溶解沉淀后再使用。
（5）Solution II 长时间暴露于空气中被CO2中和，导致菌体未能被有效裂解。
解决方法：可用经典碱裂解法抽提质粒DNA方法中的II液替代Solution II使用。
3.出现严重的RNA污染？（1）未在Solution I中事先加入RNase A1。
解决方法：补加RNase A1。
（2）加入RNase A1的Solution I长期保存于室温，导致RNase A1活性下降。
（3）细菌过量,RNase A1不能有效降解RNA。
解决方法：将细菌用量减半或增加RNase A1在Solution I中的浓度。
4.抽提的质粒DNA电泳时怎么出现切口.断裂或降解现象？（1）使用的是收集后冷冻保藏的细菌。
解决方法：使用新鲜培养的细菌。
（2）宿主菌富含核酸内切酶。
解决方法：增加一步Rinse A洗涤步骤以彻底去除残留的核酸内切酶。
《防止杂菌污染的技术》 讲义
《防止杂菌污染的技术》讲义一、引言在各种生产和实验过程中，杂菌污染是一个经常面临的问题。
杂菌的存在不仅会影响产品的质量和产量，还可能导致严重的经济损失和安全隐患。
因此，掌握有效的防止杂菌污染的技术至关重要。
本讲义将详细介绍防止杂菌污染的相关技术，希望能为大家提供有益的参考。
二、杂菌污染的来源与危害（一）杂菌污染的来源1、空气传播空气中存在着大量的微生物，如细菌、真菌孢子等。
在通风不良的环境中，这些微生物容易进入生产区域，造成污染。
2、人员操作操作人员的手部、衣物、头发等可能携带杂菌。
如果操作不规范，如未进行严格的消毒、未遵循无菌操作流程等，就容易将杂菌引入。
3、原材料原材料本身可能带有杂菌，如果在使用前未进行有效的处理和检测，就会成为污染源。
4、设备和器具生产设备、容器、工具等如果清洁消毒不彻底，也会滋生和传播杂菌。
（二）杂菌污染的危害1、降低产品质量杂菌的生长和代谢可能会改变产品的成分、结构和性能，导致产品质量下降，不符合标准要求。
2、影响生产效率杂菌的存在可能会消耗营养物质，干扰正常的生产过程，从而降低生产效率，增加生产成本。
3、引发安全问题某些杂菌可能会产生毒素或有害物质，对人体健康造成威胁。
在食品、药品等行业，杂菌污染更是可能引发严重的安全事故。
三、防止杂菌污染的基本原则（一）清洁卫生保持生产环境、设备、器具等的清洁是防止杂菌污染的基础。
定期进行清洁、消毒，去除污垢和微生物滋生的条件。
（二）无菌操作在涉及微生物培养、药品生产等对无菌要求较高的操作中，必须严格遵循无菌操作规范，如使用无菌器具、在无菌环境中操作等。
（三）控制污染源对可能的污染源进行有效控制，如对原材料进行严格检测和处理，加强人员培训和管理，确保操作规范。
（四）监测与检测建立有效的监测和检测机制，及时发现杂菌污染的迹象，采取措施进行处理，防止污染扩散。
四、防止杂菌污染的具体技术（一）环境控制技术1、空气净化采用高效空气过滤器（HEPA）等设备，对进入生产区域的空气进行过滤，去除空气中的微生物。
质粒提取常见问题解析
其pH值在此范围内，如果pH过低可能导致洗脱量低。洗脱时将灭菌蒸馏水或洗脱
缓冲液加热至60℃后使用有利于提高洗脱效率。
△ 洗脱体积太小
洗脱体积对回收率有一定影响。随着洗脱体积的增大回收率增高，但产品浓度降
溶液，才能使用。
△ 吸附柱过载
不同产品中吸附柱吸附能力不同，如果需要提取的质粒量很大，请分多次提取。若
用富集培养基，例如TB 或2×YT，菌液体积必须减少；若质粒或宿主菌是非常高
的拷贝数或生长率，则需调整LB培养液体积。
△ 质粒未全部溶解（尤其质粒较大时）
洗脱ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ解质粒时，可适当加温或延长溶解时间。
△ 混有RNA
RNase A处理不彻底，请减少菌体用量或加入溶液P3之后室温放置一段时间。如
果溶液P1已保存6个月以上，请在溶液P1中添加RNase A。
△ 混有基因组DNA
加入溶液P2和P3后应温和混匀，如果剧烈振荡，可能把基因组DNA剪切成碎片从
而混杂在质粒中。如果加入溶液P2后过于粘稠，无法温和混匀，请减少菌体用
应接种单菌落。另外，检查筛选用抗生素使用浓度是否正确。
△ 碱裂解不充分
使用过多菌体培养液，会导致菌体裂解不充分，可减少菌体用量或增加溶液P1、
P2和P3的用量。对低拷贝数质粒，提取时，可加倍使用溶液P1、P2和P3，可能
有助于增加质粒提取量和质粒质量。
△ 溶液使用不当
溶液P2、P3在温度较低时可能出现浑浊，应置于37℃保温片刻直至溶解为清亮的
△ 大肠杆菌老化
请涂布平板培养后，重新挑选新菌落进行液体培养。
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关于质粒抽提的杂菌污染问题解决方案过
对于从事分子生物学的研究的人来说，质粒抽提几乎是每天都用做的常规技术。
我们经常会收到来自用户的各种求助，像质粒提取失败了、不是自已想要的那个质粒及提取得率低等等。
其实提取质粒并不难，基本上按照质粒提取试剂盒的说明书，小心操作，一般不会有问题。
但是为什么还会有这些问题存在？因为在实验中我们应该注意一些我们经常忽略的细节。
可能实验室的环境的污染，操作时的不注意都会造成我们培养细菌时染杂菌，使得在质粒的提取过程中现象出现异常，导致实验不成功。
说到这里，有些人可能会问：那我们染的杂菌是什么菌呢？其实大部分为真菌，也有可能是革兰氏阳性菌如金黄色葡萄球菌等。
为了让大家能能判断出所用的菌体是否染杂菌，继而能从实验现象可以判断出该原因，我们特意在本实验室里做了一个从染杂菌的细菌中提取质粒的对照模拟实验。
实验方案
编号具体方案
号高拷贝质粒的大肠杆菌1 2号号染杂菌的大肠杆菌3 4号全为杂菌（酵母菌）号
5．6号
实验步骤
根据simgen快速质粒DNA小量试剂盒的说明书的操作步骤进行实验。
实验结果
（一）Buffer II裂解不完全
后溶液变粘稠的澄清液体；而部分BufferII2号为正常的大肠杆菌加入如上图所示1、号加入之后溶液呈不粘稠的浑浊、64号变为粘稠的浑浊液体；全为杂菌的5染菌的细菌3、液体。
时，其中的碱性溶液能使革兰氏阴性菌的细胞壁破裂以及蛋白质变Buffer II 在加入号正常的革兰氏阴性细2等细胞内容物。
对于1、性，从而释放出质粒DNA、基因组DNA等细胞内容物从而溶液变为粘稠的DNAII溶液能将其细胞壁破裂，释放出质粒菌，Buffer
溶液能号，我们可以看到它出现了粘稠的浑浊液体，这是因为Buffer II澄清液体，而3、4的细胞壁却不能破裂，真菌）溶解正常的革兰氏阴性细菌的细胞但部分杂菌（革兰氏阳性菌、5、6号都为杂菌，不能被破裂的杂菌呈现浑浊状。
它们的细胞壁较厚，Buffer II溶液只能裂解很小部分的细胞壁使其穿孔而泄露部分核酸（主要是RNA），细胞内的基因组DNA等其他细胞内容物难以释放，所以它呈现了不粘稠的浑浊状。
（二）拷贝数降低或质粒丢
失．
图2
如上图所示1、2号正常细菌浓度平均在545ng/μl左右，而3、4号染杂菌的细菌浓度平均在340ng/μl左右，较1、2号正常的细菌浓度有明显的降低，这是因为杂菌不含质粒DNA，故相同细菌量时，所得的质粒DNA就减少了；而全部为杂菌的5、6号则浓度最低，平均为83ng/μl。
看到这里同学们可能就有疑问了那为什么杂菌也会有浓度呢？这是因为Buffer II溶液对杂菌的细胞
壁仍有腐蚀作用，但是只能溶解部分的细胞壁使其穿孔而泄露部分核酸（主要是RNA），而浓度值主要是因为有RNA残留。
在我们平时转接菌液时，很多同学或实验室人员为了方便会多次转接我们要用的菌液。
其实这是个严重的不规范操作行为，会很容易造成杂菌污染，因为每次开盖转接都会存在染杂菌的风险，多次开盖会使染杂菌的风险增大，一旦染杂菌后就会对这次以及以后的实验会产生影响，即在一次次的转接时杂菌长时间在培养液中，大量传代，以至于它们在培养液中的比重加大，造成在随后的质粒抽提等的实验中影响实验结果，会产生最后所提的质粒得率降低等问题。
从电泳图的亮暗来判断
图3
号则6、5号细菌，而全为杂菌的4、3号正常细菌条带亮于染杂菌的2、1如上图所示
看不到条带，因为它不含质粒。
看到这里大家可能会问那怎么避免细菌培养中长杂菌呢，那就需要大家在实验的过程中注意细节，保证在无菌环境下操作且用到的东西都事先灭菌；控制细菌过夜培养时间；每次接种细菌都从新鲜制备或划线的平板中挑取单菌落接种；并且在质粒抽提前仔细阅读试剂盒说明书后进行操作；注意这些细节肯定会成功。
说明：simgen原创文章，如需转载请注明来源出处
杭州新景生物试剂开发有限公司
新景生物实验室。