毛细管胶束电动色谱分离原理
胶束电动色谱法
胶束电动色谱法
胶束电动色谱法（Micellar Electrokinetic Chromatography，MEKC）是一种在胶束电动毛细管电泳（Micellar Electrokinetic Capillary Chromatography，MECC）基础上发展
起来的电动色谱技术。
MEKC是一种将胶束电动毛细管色谱和电泳技术相结合的色
谱方法。
它利用带电胶束作为移动相，通过电流的作用在毛细管中进行分离分析。
胶束通过对待分离物的物理和化学作用，可以增强分离效果，减小基质效应。
在MEKC中，样品中的待分离物首先与带电胶束发生静电相
互作用，然后在电场作用下通过胶束电动驱动向前移动。
分离效果主要取决于待分离物与胶束的相互作用、电场的强度和胶束浓度等因素。
待分离物的分离和检测主要是通过荧光信号来实现的。
MEKC适用于水溶性、中等极性和高极性的化合物的分离分析，包括蛋白质、药物、生物活性物质等。
它具有分离效果好、操作简便、灵敏度高和选择性强等特点，被广泛应用于食品安全、环境监测、药物分析等领域。
简述毛细管电泳分离原理及分离模式
简述毛细管电泳分离原理及分离模式.
答：毛细管电泳的分离原理：带电粒子在电场力的驱动下，在毛细管中按其淌度或和分配系数不同进行高效、快速分离的电泳新技术，也称为高效毛细管电泳。
毛细管电泳分离模式：1、毛细管区带电泳:利用被分离离子在电场作用下移动速度不同而实现分离。
电解质的移动就是由电渗引起的。
2、胶束电动毛细管色谱:胶束存在假固定相,使得溶质不仅可以由于淌度差异而分离,同时可基于水相与胶束相之间的分配系数不同而得到分离。
3、毛细管电色谱:被测组分根据她们在流动相与固定相中的分配系数不同与自身电泳淌度差异而得以分离。
毛细管电泳的分离原理
毛细管电泳的分离原理
毛细管电泳（CE）是一种基于电动力和色谱分离原理的分析技术。
它利用毛细管中载带电荷的离子在电场作用下的迁移速率的差异来实现分离。
在毛细管电泳中，首先将样品注入到一条非常细的毛细管内，然后通过使毛细管两端施加电场来产生电动力。
当电场施加到毛细管上时，带电的分析物会受到电场力的作用而在毛细管内迁移。
不同的物质由于自身的特性，比如大小、电荷等，会以不同的速率迁移。
具体来说，有两种常用的毛细管电泳模式：
1. 毛细管凝胶电泳（CGE）：在该模式下，毛细管内填充了哑离子聚合物凝胶，通过凝胶的孔道来实现分离。
样品中的离子在电场作用下，根据尺寸的不同，在凝胶中迁移速度也不同，从而实现分离。
2. 毛细管毛细管区带电泳（CZE）：在该模式下，毛细管内不填充任何分离介质。
样品中的离子自行在毛细管中迁移，根据大小和电荷的不同，迁移速度也不同，从而实现分离。
总的来说，毛细管电泳的分离原理是利用样品中离子在电场作用下的迁移速率差异，根据大小和电荷特性，在毛细管中实现分离。
电色谱法的分离原理
电色谱法的分离原理电色谱法是一种分析化学技术，它利用电场来分离和检测样品中的化合物。
电色谱法的分离原理基于分子在电场中的迁移速度差异，取决于它们的电荷和尺寸。
以下是电色谱法的主要分离原理：1.电泳迁移：•在电色谱法中，一个电场通过分离介质中的样品。
这个电场可以是直流电场或交流电场。
当样品分子在电场中暴露时，它们会受到电荷的影响，导致它们迁移向电场的一个极性端。
带有相同电荷的分子会互相排斥，而带有相反电荷的分子会被吸引。
2.电动迁移率：•不同化合物在电场中移动的速度取决于它们的电动迁移率。
电动迁移率是分子在电场中移动的速度与电场强度之比。
电动迁移率与分子的电荷、尺寸和分子质量等因素有关。
3.分离介质：•电色谱法通常使用一种分离介质，如凝胶、毛细管、纸或硅胶等。
分离介质可以提供额外的分离机会，因为分子必须在介质内部或表面移动，这会影响它们的分离速度。
4.检测器：•在电色谱法中，通常使用检测器来监测分离后的化合物。
检测器可以是吸收光谱仪、荧光探测器、电导率检测器或质谱仪等。
通过检测分离后的化合物，可以获得它们的定量和定性信息。
5.应用：•电色谱法可以应用于不同类型的分析，包括离子交换色谱、凝胶电泳、毛细管电泳和高效液相色谱（HPLC）等。
这些技术在生物化学、生物医学、环境分析和食品科学等领域中得到广泛应用。
总的来说，电色谱法的分离原理基于分子的电动迁移率，利用电场来驱动分子在分离介质中的运动，从而实现样品中不同化合物的分离和分析。
它是一种强大的分析工具，可以用于研究和监测各种化合物。
高效毛细管电泳法原理
毛细管区带电泳（CZE）
CZE又称毛细管自由电泳，是毛细管电泳中最基本、应用最普遍的一种模式。它在毛细管中 仅填充缓冲液，基于溶质组分在电场中的迁移速度不同而分离。前述的基本原理即是CZE 的基本原理。
毛细管胶束电动色谱（MECC）
毛细管胶束电动色谱是电泳技术和色谱技术巧妙结合的分离新技术，也是毛细管电泳中唯 一能同时分离中性物质和离子型物质的分离模式。
简称毛细管电泳（Capillary Electrophoresis，CE），指以高压电场为驱动力，以毛细管为 分离通道，依据样品中各组分之间淌度和（或）分配行为上的差异而实现分离的一种液相分 配技术。CE是经典电泳技术和现代微柱分离技术相结合的产物。
基本装置
CE 的基本装置包括一个高压支流电源、一根毛细管、一个检测器及两个供毛细管两端插入 而又可和电源相连的缓冲液贮瓶。
高效毛细管电泳
高效毛细管电泳相对于经典电泳在技术上采取了两项重要改进： 一是采用了0.05mm内径的毛细管, 二是采用了高达数千伏的电压。 毛细管的采用使产生的热量能够较快散发，大大减小了温度效应，使电场电压可以很高；
电压升高，电场推动力大，又可进一步使柱径变小，柱长增加。
基本理论
在电解质溶液中，带电粒子在电场作用 下，以不同的速度向其所带电荷相反方向迁移。迁 移速度为：
试中Vep为离子电泳迁移速度， μep为电泳淌度，E为电场强度, q为离子电荷量，η为介质粘度， r为离子半径。
Vep=μep ·E=
q
·E 6πηr
基本理论
CE所用的石英毛细管柱，在pH>3时，石英毛细 管壁上的硅醇基(— SiOH）在水溶液中发生电 离，产生的SiOˉ负离子使毛细管壁内表面带负 电，和溶液接触时相应的缓冲液带正电，形成 了双电层。
毛细管电泳法
第一节
（一）原理
毛细管电泳法
毛细管电泳（CE）亦称为高效毛细管电泳法（HPCE），是20 世纪80年代发展起来的一类高效快速的分离分析方法。该法系以弹性
毛细管为分离通道，以高压直流电场为驱动力，依据样品中各组分的
淌度（单位电场强度下的迁移 速度）和分配行为的差异而实
现分离，因此可将其视为经典
电泳技术和现代微柱分离相结 合的产物。
每次进样之前毛细管要用不同的溶液冲洗，选用自动冲洗进样仪器较为
方便。进样方法有压力进样、负压进样、虹吸进样和电动进样等。进样
时通过控制压力、电压或时间来控制进样量。
5.检测器
紫外检测器，荧光检测器，电化学检测器，质谱仪等均可作为CE 的检测器。其中紫外检测器应用最广，它是将毛细管接近出口端的外 层聚合物剥去约2mm一段，使石英管壁裸露，毛细管两侧各放置一 个石英聚光球，使光源聚焦在毛细管上，透过毛细管到达光电池对溶 质进行检测。
2.胶束电动毛细管色谱（MEKC或MECC）
该法系以胶束为假固定相的一种电动色谱。 当操作缓冲液加入大于其临界胶束浓度的离子型表面活性剂如十 二烷基硫酸钠（SDS）或十六烷基三甲基溴化胺（CTAB）、胆酸等， 这时表面活性剂就聚集形成胶束（假固定相），其亲水端朝外，
憎水非极性核朝内，溶质则在水和胶束两相间分配，各溶质因分
其中以色谱为主，但对荷电溶质兼有电泳作用。 该法克服了CE选择性差和分离中性物质困难的缺点，同 时提高了液相色谱的分离效率，形成其独特的高效、微量、 快捷的特点，开辟了高效微柱分离技术的新途径。
二、仪器设备
（一）毛细管电泳仪的基本结构（见下图）
1.电极槽和进样系统 2.清洗系统 3.毛细管 4.检测器 5.铂电极 6.电极槽 7.恒温系统 8.记录和数据处理
毛细管电泳原理及分析策略
第六章 检测器选择
• 小分子检测 • 大分子检测
9
CE检测器种类及性能
• 检测系统
HPCE的种类及性能
检测方式 紫外-可见光吸收
质量检测限(mol) 10-13～10-16
浓度检测限(M)* 10-5～10-8
荧光
10-15～10-17
• 电渗流的波动极大的影 响了迁移时间的重复性
影响电渗流的因素
• pH值 pH越高，电渗流越大
• 离子强度 离子强度越高，电渗流越小
• 缓冲溶液添加剂 离子型表面活性剂、有机溶剂、环糊精
控制电渗流的三个重要手段
1. 采用涂层毛细管，消除电渗流的影响 2. 改变pH，从而调整电渗流的大小。pH<3时电
第一步，尽可能多地了解分离样品的类型、来源、组成 及其性质；
第二步，根据样品的可能性质和来源，选择分离模式， 若无样品信息可先选CZE；
10
条件选择流程
第三步，根据样品性质确定检测方法，一般先选直接 紫外吸收；
第四步，确定样品处理方式，包括衍生方案以及离心 过滤除蛋白等；
第 五 步 ， 根 据 样 品 解 离 常 数 计 算 最 佳 pH ， 或 利 用 75µmID毛细管和磷酸缓冲体系确定pH范围;
电流。 那些被称为生物“优良缓冲液”的，如Tris, borate, CAPS 等特别有用，因为这些缓冲溶液中的离子一般较大， 能够在较高浓度下使用而不会产生大的电流，但一个 潜在的缺点是这些大的缓冲离子有强的紫外吸收。
3
常用的CE缓冲体系
• 磷酸钠体系 宽缓冲范围 • 硼酸钠体系 高pH范围 • Tris-HCl体系 低pH范围 • 醋酸-醋酸铵体系 CE/MS常用体系
毛细管电色谱的方法原理与应用
既能分离带电物质，也能分离中性 物质；
Fig.3. CEC combines the strengths of two powerful analytical techniques —— CE and µHPLC
历
史
回
顾
和
毛
研
细 管
究
电 色
现
谱 研
状
究 进
展
进 [10] Rathore,A,S, Horvath,C. J Chromatogr, 1996,743:231
展
CEC 的保留机制：
CEC= µHPLC+CE
依靠电渗流(EOF)或电渗流结合压力 流推动流动相，使中性和带电荷的样 品分子根据它们在色谱固定相和流动 相间吸附、分配平衡常数的不同和电 泳速率不同而达到分离分析；
2．紫外-可见检测器 开启电源后，经过短暂的时间，氘灯点亮，波长显示为 254 nm。(不一定是254nm，而是上次关机时使用的波 长)，按FUNC/BACK键到改波长处，输入实验需要的波 长值， ENTER确认，检测器一般30-60min的预热，然后 按ZERO基线调零后，基线稳定后，可以进样。
色 [2] Mould,D,L, Synge,R.L.M. Analyst. 1952, 77:963-968
谱 [3] Pretorius.V, et al. J. Chromatogr., 1974, 99:23-30
研 [4] Otsuka.S ,et al. Anal.Biochem., 1980,102:419-422
和 研 究 现 状
直到1980年Otsuka[4]才又发表了一篇有关CEC的文章。
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毛细管胶束电动色谱分离原理概述在电泳缓冲液中加入离子表面活性剂，当溶液中表面活性剂浓度超过临界胶束浓度时，表面活性剂的单体就结合在一起，形成一个球体，称为胶束。
胶束一般是由10--50个碳原子单位的长链分子组成，具有头部(或外层)亲水、尾部(或内层)疏水的特性。
在溶液中，头部露在外面，尾部包在胶束中。
这种胶束的形成是疏水效应的结果，能使系统的自由能减少。
胶束可分为正相胶束和反相胶束两类，以前者应用较多。
反相胶束则是指在有机溶剂中形成的胶束，尚未作系统研究。
用来作为表面活性剂的化合物很多，大体有四类:阴离子、阳离子、两性离子和非离子表面活性剂，其典型化合物及主要性质如表4.1所示。
应用最多的是前两类，且尤以十二烷基硫酸钠(SDS)等使用最为普遍。
图4.1是SDS胶束的结构示意，里面有一个疏水内核，外面布满了.S03ˉ离子。
在MECC系统中，实际上存在着类似于色谱的两相，一是流动的水相，另一是起到固定相作用的胶束相，溶质在这两相之间分配，由其在胶束中不同的保留能力而产生不同的保留值。
与毛细管区带电泳一样，由于缓冲液在靠近管壁处形成的正电，使其显示出强烈的电渗流而向阴极移动。
对于SDS胶束来说，由于其外壳带很大的负电荷，本应以较大的淌度朝阳极迁移，但由于在一般情况下电渗流的速度大于胶束的迁移速度，这就迫使胶束最终以较低的速度向阴极移动，如图4.2所示。
由此可见，毛细管胶束电动色谱有别于普通色谱的一个重要特性为它的“固定相”是移动的，这种移动的“固定相”又被称之为“准固定相’。
在毛细管胶束电动色谱中，中性粒子由于本身疏水性的不同而得以分离.具有不同疏水性的粒子与胶束的相互作用不同，疏水性强的作用力就大，其留在胶束相中的时间就长。
由于胶束相的绝对速度很小，组分的保留时间就长;反之组分较多地停留在缓冲液中按电渗的速度移动，保留时间就较短。
以上所述为使用阴离子表面活性剂的情况，如果使用阳离子表面活性别，则清况相反。
机理前己述及MECC中存在有两相，一相是以胶束形式存在的准固定相，另一相是作为载体的液相，又称流动相。
试样中的组分在MECC中的分离，从本质上来说，是由它们的分子和胶束相及流动相分子之间的相互作用的差异造成的，尽管对不同的胶束相互作用的形式不同，但是它们所反映的问题本质是一样的。
具体来说，溶质在毛细管柱内受到两种力，一是胶束对它的作用力，二是流动相的溶解力，即溶质处于两个作用力场的平衡之中，作用力强，溶解力差时，溶质有较大的保留;反之，则较早流出毛细管柱，见图4.3.也就是说，不同组分分子和胶束相与流动相分子相互作用的不同，最终将导致它们在两相中的浓度比不同，或者说分配系数不同。
设X物质因相互作用较大，而在胶束相中的浓度较大，Y物质因相互作用较小而浓度较小，则X的分配系数大于Y的分配系数（分配系数K=溶质在胶束相的浓度/溶质在流动相的浓度），在这一MECC系统中，X在Y的后面流出。
综上所述，不同组分在毛细管胶束电动色谱中的分离，从根本上来说是由于它们的分子与胶束和流动相分子相互作用的差异造成的，而这种相互作用的差异通过分配系数的差异来反映，分配系数和上述一系列微观参量都有明确的定量关系。
问题的另一方面是，既然分配系数及其差异是引起组分在MECC中分离的根本原因，那么，必然地也会同MECC中可测宏观参量之间存在着某种定量关系，事实上，MECC中通常采用容量因子K’的概念来间接地描绘分配系数。
容量因子的定义为:k'=组分在胶束相中的量/组分在流动相中的量序言高效毛细管电泳(High Performance Capillary Electrophoresis，简称 HPCE )是70-80年代迅速发展起来的一类新型的电泳和色谱相结合的分离分析技术，具有分离效率高、分析速度快、样品用量少、应用范围广等特点，已成为90年代重要的高效分离手段，在生物、化学、医药、环保、食品等领域等领域有很好的应用前景。
毛细管电泳和高效液相色谱(HPLC)都是液相分离技术，由于它们遵循不同的分离机理，除了具有自己的特点外两者在很大程度上可以互为补充。
但是无论从效率、速度、样品用量和成本来说，毛细管电泳都显示了一定的优势。
与HPLC相比，毛细管电泳的柱效更高一些，速度更快一些；同时它的用量仅为HPLC的千分之一，且溶剂消耗量极小，又没有泵输运系统，因此成本相对较低。
毛细管电泳具备许多分离模式，通过改变其缓冲液成分、添加剂和柱型，毛细管电泳有很大的选择性，可以根据不同的分子性质(诸如大小、电荷数、手性、疏水性等)对极广泛的对象进行有效的分离。
相比之下，为达到类似的目的，HPLC要消耗许多价格昂贵的柱子和溶剂，而且现在常用的HPLC方法存在分析时间长，分离效率低及柱子易污染等缺点，因此毛细管电泳方法在这个领域的应用越来越受到人们的关注。
毛细管电泳的结构很简单：通常包括一个高压源，一根毛细管，一个检测器以及两个供毛细管两端插入且又可和电源两端相连的缓冲液贮槽，输出信号和记录装置。
装置的示意图如下所示：毛细管电泳示意图毛细管电泳的原理也并不复杂，其原理如下所述：1. 概述分离原理：高效毛细管电泳(HPCE)是溶液状态的混合物以相对较窄的区带引入到毛细管中并在电场作用下迁移。
由于混合物中各物质所带的电荷和大小不同而具有不同的电泳淌度，因此迁移速度存在差异而实现分离。
定量原理：根据朗伯-比尔定律定量。
2. 理论2.1电泳淌度当一带电离子在电场E中时，它受到电场力F e的作用，其大小等于带电粒子的净电荷q与电场强度E的乘积，即F e=q*E一旦带电粒子开始运动，除电场力外，它还受到一个与运动方向相反的阻力作用。
阻力F d的大小与其迁移速度(v)成正比，即Fd=f*v其中f为平动摩檫或阻力系数。
当电场力完全被阻力平衡后，粒子以稳态速度迁移，该稳态速度V ss与阻力系数的关系为：Vss=qE/f若将带电粒子的电泳淌度定义为单位电场强度下的稳态速度μ=q/f很明显，粒子的大小和电荷差异都可以引起电泳淌度的差异。
2.2电渗流在毛细管电泳中，由于所用的毛细管多由熔融石英做成，它表面含有硅醇基团(SiOH)，电解质存在时这些硅醇基团可以离子化。
此时，熔融石英毛细管壁和缓冲液间的界面由三层组成：带负电的石英表面(PH>2)，不可移动层和阳离子扩散层。
这三层与石英表面相连，趋向阴极移动。
这种阳离子的迁移导致了整个毛细管内流体向阴极迁移，这种液体在毛细管中的流动称作电渗流。
电渗流的速度与电场强度成正比，故电渗流淌度定义为单位电场强度下得电渗流速度：μeo=V eo/E2.3 检测方法：用于毛细管电泳的检测方法有UV-Vis吸收法、激光光热法、荧光法、间接测定法、电导法、安培法、质谱法、放射法、拉曼光谱法、折射指数法等多种。
也有用CITP/CZE、HPCE/HPLC联用方法进行检测。
但是HPCE进样量小、分离速度快的特点要求检测器具有灵敏度高、空间分辨率高、响应快及在线检测功能。
目前已经商品化的检测器中，光学检测器（紫外、二极管阵列、荧光）较为成熟，电化学检测器及放射性同位素检测器已开始应用。
质谱联用因灵敏度高也得到发展。
利用HPCE时应根据所分析物质的特点选用相应的检测方法，以扬长避短。
本实验选用的检测方法为紫外检测法。
十九世纪初，法国人Derosne, Pelletier和德国人Sertuner 159]等相继从植物和药材中分离出生物碱，并证明它们具有明显的生理作用，推动了植物药材有效成分的研究。
目前，应着重如下研究:研究中草药的种类和资源，寻找新药源;研究中草药的鉴别和化学成分，以鉴定中草药的真伪优劣，保证中药质量;研究药用动植物的遗传因素、生长发育、环境条件与有效成分积累的关系，以及中药在采收、加工、炮制、储藏合理的加工、炮制和贮藏，从而提高药材的产量和质量。
以上几方面都有赖于中药有效成分的分析。
而中药有效成分的分析有其特殊复杂性，首先是中药品种繁多，不同品种间活性成分的含量相差悬殊;其次中药中有效成分还受产地、栽培、生长环境和采收季节等因素的影响。
对于由多种中药组成的复方制剂，情况就更复杂了。
目前用于中药成分分析的方法有薄层色谱法((TLC)、气相色谱法(GC),高效液相色谱法((HPLC)等，其中HPLC法常用，高效液相色谱法，其有诸多的优点，如柱效高，选择性好，适用面广，但将其用于中草药的分析时，有下列几个不利因素。
①由于中草药成分不但复杂且往往不甚清楚，增加了样品前处理的困难，容易造成柱污染，严重地影响柱寿命。
②液相色谱所消耗的溶剂量大，增加了这种方法的成本，且造成环境污染。
③每根柱的柱效实际上不是很高(约几千塔板数)，所需分析时间一般较长。
与高效液相色谱相比，高效毛细管电泳在分析中草药时具有下列几点优越①毛细管柱易于全面清洗，不必担心对柱子的污染而使柱子报废。
②简化对样品前处理的要求。
③柱效高、分析时间一般比HFLC短。
④由于柱效高，有可能使同一个分离条件适合多种样品中多组分的分析。
⑤所用化学试剂量少，分析成本低。
⑥分离模式多，适合于中药中存在的各类物质。
包括酸性、碱性和中性的物质，如有机酸、生物碱、黄酮及其贰类、香豆类素、氨基酸类等化合物的分析。
近十几年来发展很快的高效毛细管电泳(High Performance Capillary Electrophoresis, HPCE)是一种高效分离技术，它具有高效(每米理论塔板数在10，以上)、快速、进样体积小(一般为nL级)、溶剂消耗少和抗污染能力强等特点，不仅广泛用于生物大分子如核酸、多肤和蛋白质等的分析，尤其在中药复杂体系的分析中显示出很大的优势。
本文就是利用毛细管电泳来测中药中的有效组分。