第6章 灭菌及染菌的防治

连续 灭菌
优点
缺点
1.高温短时灭菌，培养基营 1.设备复杂，操作麻烦,
养成分损失少。
染菌机会多。
2.发酵罐占用时间缩短，利 2.不适合含大量固体物料
37% 2% 0.1%-0.15%
漂白粉
5%
过氧乙酸
0.02%-0.2%
酒精 煤酚皂（来苏尔）
*
75% 1%—5%
焦碳酸二乙酯 0.01%-0.1%
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六、臭氧灭菌
抗生素生产工艺
利用臭氧的氧化作 用杀灭微生物细胞。臭 氧在常温、常压下分子 结构不稳定，很快自行 分 解 成 氧 气 (O2)和 单 个 氧原子(O)，后者具有很 强的活性，对细菌有极 强的氧化作用。
绝大多数工业发酵都是利用好气性微生物进 行纯种培养，因此，所使用的培养基、各种 设备和附件以及通入罐内的空气均须彻底除 菌，这是防止发酵过程染菌、确保正常生产 的关键。
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抗生素生产工艺
目录
灭菌概述 培养基灭菌 发酵罐的灭菌 空气的除菌 染菌的防治
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抗生素生产工艺
第一节 灭菌概述
灭菌是指利用化学或物理方法杀 灭或去除物料及设备中一切生命物质 的技术或工艺过程。
蒸汽具有很强的穿透能力，而且在冷凝时会 放出大量的冷凝热，很容易使蛋白质凝固而 杀死各种微生物。
灭菌条件 灭菌优点
121℃，30min。
蒸汽来源容易，操作费用低，本身无毒；蒸汽 有强的穿透力，灭菌易于彻底；蒸汽有很大的 潜热；操作方便，易管理。
灭菌缺点
同时会破坏培养基中的营养成分，甚至产 生不利于菌体生长的物质。
室等环境灭菌，空间的消毒和溶氧电极等器具 的消毒。 不适合用于培养基的灭菌。
常用的灭菌剂：如甲醛、苯酚、高锰酸钾、
洁尔灭、氯化汞等。
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抗生素生产工艺
常用的灭菌剂
化学物质名称
有效浓度
化学物质名称 有效浓度
新洁尔灭(苯扎溴铵) 杜灭芬
高锰酸钾
0.25% 0.25% 0.1%-0.25%
甲醛 戊二醛
苯酚
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特点：温度低、时间短、灭菌效果高
原因： ✓菌体内含水量越高，则凝固温度越低； ✓ 蒸汽冷凝会放出潜热； ✓饱和水蒸汽穿透力强； ✓湿 热 易 破 坏 细 胞 内 蛋 白 质 大 分 子 的 稳 定 性，主要破坏氢键结构。
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抗生素生产工艺
湿热比干热灭菌更好：
✓更易于传递热量； ✓更易破坏保持蛋白质稳定性的氢键等结构；
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抗生素生产工艺
优点
1.不需专门的灭菌设备，设备投资少； 2.灭菌后再次染菌的危险性较小； 3.发酵罐内有搅拌，加热时上下翻腾灭菌较均匀； 4.适于起泡性强、黏度大和含固形物较多的培养 基灭菌。
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缺点
升温 时间
保温 时间
抗生素生产工艺
冷却 时间
✓加热和冷却时间长，发酵罐的周转率低，不 能适应大规模连续生产的要求，适于小型发酵 厂生产。 ✓对培养基的营养成份破坏大。 ✓不能采用高温快速灭菌工艺。
是一种机械的作用因素，每秒超过2万次 振动的声波即为超声波。常用的超声波发生器 能产生20-100千赫的声波。可使细菌细胞壁 裂解而死亡。
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五、化学物质灭菌
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原理：许多化学药剂渗透到微生物细胞内进行
氧化、还原、水解等化学作用，引起细胞内蛋 白质变性、酶类失活或细胞溶解而杀灭微生物。
使用范围：器皿、双手和厂房、实验室、无菌
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五、培养基灭菌的方法
抗生素生产工艺
分批灭菌
连续灭菌
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抗生素生产工艺
1.分批灭菌（batch sterilization）
分批灭菌是将配制好的培养基输 入发酵罐内，用直接蒸汽加热，达到 灭菌要求的温度和压力后维持一定时 间，再冷却至发酵要求的温度，这一 工艺过程称为分批灭菌或实罐灭菌。
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抗生素生产工艺
一、培养基灭菌
指从培养基中杀灭有生活能力的细菌营养 体及其孢子，或从中将其除去。
工业规模的液体培养基灭菌，杀灭杂菌比 除去杂菌更为常用。
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二、培养基灭菌的措施
抗生素生产工艺
工业上具体措施包括： ①使用的培养基和设备须经灭菌； ②好氧培养中使用的空气应经除菌处理； ③设备应严密，发酵罐维持正压环境； ④培养过程中加入的物料应经过灭菌； ⑤使用无污染的纯粹种子。
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抗生素生产工艺
由连消塔、维持罐和冷却器组成的连消系统
蒸汽
冷却水
蒸汽
无菌培养基
发酵罐
配料罐
泵
加热塔
维持罐
冷却管
连续灭菌的基本设备一般包括（1）配料预热罐，将配制好的料液预
热到60-70℃，以避免连续灭菌时由于料液与蒸汽温度相差过大而产
生水汽撞击声；（2）连消塔，连消塔的作用主要是使高温蒸汽与料
液 迅 速 接 触 混 和 ， 并 使 料 液 的 温 度 很 快 升 高 到 灭 菌 温 度 （ 126-
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三、培养基灭菌的要求
抗生素生产工艺
（1）达到要求的无菌程度（10-3）；
（2）尽量减少营养成分的破坏，在灭菌过程中， 培养基组分的破坏，是由两个基本类型的反应引 起的：
✓培养基中不同营养成分间的相互作用； ✓对热不稳定的组分如氨基酸和维生素等的分解。
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四、 培养基的湿热灭菌
抗生素生产工艺
湿热灭菌原理
➢适 用 ： 耐 高 温 物 品 ， 玻 璃 仪 器、含水或不含水的物品。
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④高压蒸汽灭菌法
抗生素生产工艺
高压蒸汽灭菌的温度越高，微生物死亡越快。
➢方法：121℃维持15-20min。 112℃20-30min。 115℃20-30min。
➢应根据灭菌物品的性质或成分选择灭菌温度 例如：生理盐水、营养琼脂等培养基用121 ℃。
湿热对一般营养体和孢子的杀灭条件：
✓多数细菌和真菌的营养细胞：在60℃左右处理5-10分钟； ✓酵母菌和真菌的孢子：用80℃以上温度处理； ✓细菌的芽孢：121℃处理15分钟以上；
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①巴氏消毒法
抗生素生产工艺
低温维持法：只要在63℃下维持30min
具
体
高温瞬时法：只要在72℃下维持15s
方
法
超高温法：只要在135-150℃下维持2-6s
▪干燥热空气灭菌法(hot-air oven)：将物品放入烘箱
内，然后升温至150℃-170 ℃ ，维持1-2小时。适用于玻璃、 陶瓷和金属物品的灭菌，不适合液体样品，及棉花、纸张、 纤维和橡胶类物质的灭菌。
特点：由于空气传热穿透力差，菌体在脱水状态下不易杀死 ，所以温度高、时间长。
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2. 湿热灭菌
▪其蒸煮过程可杀死微生物的营养体，但不能杀死芽胞，室 温过夜促使残留的芽孢萌发成营养体，再经蒸煮过程可杀 死新的营养体；循环三次以上可保证彻底灭菌的目的。
▪适用于不耐高温的物品灭菌，如不适于高压灭菌的特殊培 养基、药品的灭菌。
▪缺点是麻烦、费时。
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④高压蒸汽灭菌法
抗生素生产工艺
➢利用水的沸点随水蒸气压力的增加而上升，以达 到100℃以上高温灭菌的方法。
间歇灭菌法
高压蒸汽灭菌法
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1. 干热灭菌
抗生素生产工艺
▪焚烧法（incineration）：是将被灭菌物品在火
焰中燃烧，使所有的生物质碳化。简单、彻底，但对被 灭菌物品的破坏极大。适用于无经济价值的物品灭菌， 及不怕烧的实验器具，如接种环、镊子、试管或三角瓶 口的灭菌等。
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1. 干热灭菌
抗生素生产工艺
湿热灭菌的效果，取决于致死温度和致死时间。
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抗生素生产工艺
湿热灭菌中的相关定义：
致死温度：是杀灭微生物的极限温度。 致死时间：是在致死温度下或以上杀灭微生物
所需时间。
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抗生素生产工艺
培养基灭菌温度的选择
用湿热灭菌方法对培养基灭菌时，加热的温 度和时间对微生物死亡和营养成分的破坏均有作 用。
在高压加热的条件下，氨基酸和维生素等生 长因子极易破坏。因而选择一种既能达到灭菌要 求又能减少营养成分被破坏的温度和受热时间， 是研究培养基灭菌质量的重要内容。
不存在任何有毒残留物， 故称无污染消毒剂。臭氧不 但对各种细菌(包括大肠杆菌、 铜绿假单胞菌及杂菌等)有极 强的杀灭能力，而且对杀死 霉菌也很有效。臭氧灭菌是 新近发展起来的一种消毒方 式，具有使用安全、安装灵 活、杀菌作用明显的特点， 主要用于洁净室及净化设备 的消毒。
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抗生素生产工艺
第二节 培养基灭菌
第六章 灭菌及染菌的防治
关海燕
nghaiyan1@
生命科学技术学院
上节回顾
抗生素生产工艺
培养基的基本组成与功能： 碳源、氮源、水、无机盐及微量元素、生长因素 前体、诱导物（刺激物）、抑制剂。
培养基的种类： 按来源、状态、用途等分类。
培养基的制备： 母液的配制与保存 培养基的配制
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抗生素生产工艺
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抗生素生产工艺
2.连续灭菌（continuous sterilization）
又称连消，即培养基在发酵罐外经过一套灭菌 设备连续的加热灭菌，冷却后送入已灭菌的发 酵罐内的工艺过程。
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特点
抗生素生产工艺
可采用高温快速灭菌工艺，营养成分破坏的少； 发酵罐非生产占用时间缩短，容积利用率提高； 热能利用合理，适合实行自动化控制； 不适合用于粘度大或固形物含量高的培养基的 灭菌； 增加一套连续灭菌设备，增多了操作环节，增 加了染菌的几率。
分批灭菌的设计在发酵罐中，进行实罐灭菌，是 典型的分批灭菌。
升温 保温 降温
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抗生素生产工艺
全过程包括升温、保温、降温三个过程。 灭菌时间：t总=t1+t2+t3 灭菌作用：Δ总= Δ加热+ Δ维持+ Δ降温