发酵染菌的检查及分析
第八章--发酵染菌及其防治全文编辑修改
2、发酵染菌的异常现象
（1）菌体浓度异常 菌体浓度异常下降 菌体浓度异常升高 菌体繁殖和代谢速率缓慢
（2）pH过高或过低 pH上升（感染噬菌体，导致菌体自溶，释放大量氨、 氮） pH下降（感染杂菌，基质大量消耗产生酸性物质）
（3）溶解氧及CO2水平异常 溶解氧短时间内下降，甚至接近零，且长时间不能 回升（污染耗氧微生物） 耗氧量减少，溶解氧升高（污染非耗氧微生物或者 噬菌体） 耗糖量加快，CO2含量增加（污染杂菌） 耗糖量减少，CO2含量减少（污染噬菌体）
第一节 染菌对发酵的影响
一、染菌对发酵过程的影响
生产不同的品种，可污染不同种类和性质的微生物。 不同污染时间，不同污染途径，污染不同菌量，不同培 养基和培养条件又可产生不同后果
1、发酵染菌对不同发酵品种的影响
（1）不同生产菌可能污染的染菌 ➢放线菌由于生长的最适pH为7左右，因此染细菌为多 ➢霉菌生长pH为5左右，因此染酵母菌为多。
酚红肉汤培养基检测（检查培养基和无菌空气是否染菌， 肉汤由红变黄） 平板划线 显微镜观察
3、检查的工序和时间
工序 斜面 摇瓶种子 种子罐种子 种子罐种子 种子罐种子 种子罐种子 发酵 发酵 发酵 发酵 发酵 总过滤器 分过滤器
表1 发酵过程的杂菌检查
时间
0h 0h 培养中期 成熟种子 0h 0h 8h 16h 24h 每月一次 每月一次
第八章 发酵染菌及其防治
发酵染菌（contamination）：发酵培养过程中除了生产菌 以外，侵入了有碍生产的其它微生物。
发酵染菌的危害 ➢发酵过程污染杂菌，会严重的影响生产，是发酵工业的致 命伤。 ➢造成大量原材料的浪费，在经济上造成巨大损失 ➢扰乱生产秩序，破坏生产计划。 ➢遇到连续染菌，特别在找不到染菌原因往往会影响人们的 情绪和生产积极性。 ➢影响产品外观及内在质量
发酵生产中杂菌的检查与防治
发酵生产中杂菌的检查与防治————————————————————————————————作者：————————————————————————————————日期:ﻩ第一节发酵生产中杂菌的检查与防治一染菌的检查与判断凡是在发酵液或发酵容器中侵入了非接种的微生物统称为杂菌污染,及早发现杂菌，及早采取相应措施，对减少由杂菌污染造成的损失至关重要。
因此检查的方法要求准确、快速。
目前发酵生产上常用的检查方法有下列几种：1．显微镜检查一般单染色后用油镜观察,凡是从视野中发现有形态与生产菌株不同的菌体都可认为是污染了杂菌。
优点:简便、快速，能及时检查出杂菌。
缺点:（1) 对固形物多的发酵液检查较困难;（２）对含杂菌少的样品不易得出正确结论,应多检查几个视野;（３) 由于菌体较小,本身又处于非同步状态，应注意区别不同生理状态下的生产菌与杂菌，必要时可用进行革蓝氏染色、芽孢染色等辅助方法进行鉴别。
2．平板检查若怀疑发酵液被细菌污染,可取少量待检发酵液涂布在肉汤平板上，在适宜条件下培养,若出现与生产菌株形态不一的菌落，就表明可能被杂菌污染;若要进一步确证,可配合显微镜形态观察，若个体形态与菌落形态都与生产菌相异，则可确认污染了杂菌。
优点：（１)适于固形物多的发酵液；（2)形象直观,肉眼可辩,不需仪器。
缺点:（１)所需时间较长，至少也需8小时；(２)无法区分形态（包括细胞形态与菌落形态）与生产菌相似的杂菌，如啤酒生产中污染野生酵母时,由于啤酒酵母与野生酵母很难从形态上加以区分，只能借助生理生化试验进行确认。
(3)检查过程需严格执行无菌操作技术。
3.肉汤培养检查法此法主要用于空气过滤系统和液体培养基的无菌检查。
具体方法是将葡萄糖酚红肉汤培养基（牛肉膏0.3％,蛋白胨０．8％,葡萄糖0.5%，氯化钠０.5%，1%酚红溶液0.4%,ｐＨ７.２）装在吸气瓶中，经灭菌后，置3７℃培养24小时,若培养液未变浑浊,表明吸气瓶中的培养液是无菌的,就可用于空气过滤系统的杂菌检查。
发酵常见染菌原因及分析
发酵常见染菌原因及分析发酵是一种利用微生物代谢产生特定产物的过程。
在发酵过程中，微生物的生长和代谢活动是至关重要的，因此发酵过程中的染菌问题是不可避免的。
染菌的原因可能有很多，包括环境因素、操作不当、杂菌污染等。
下面将详细介绍一些常见的染菌原因及分析。
1. 空气中存在杂菌空气中存在大量的微生物，包括细菌、真菌和酵母等。
这些微生物可以通过空气传播到发酵系统中，并在适宜的环境条件下生长繁殖，导致发酵过程中的染菌问题。
为了减少空气中的杂菌对发酵系统的污染，可以采取以下措施：- 严格控制发酵环境的洁净度，保持操作区域的干净和无尘。
- 在发酵容器上使用滤器，可以有效阻止空气中的杂菌进入容器。
- 在操作过程中尽量减少容器的开启和移动，以减少空气中的杂菌进入的机会。
2. 操作不严谨对于发酵过程来说，操作的规范性和严密性非常重要。
操作不当往往是染菌的主要原因之一。
以下是一些可能导致染菌的操作不严谨的情况：- 使用不洁净的操作工具或容器，如不经过高温灭菌的培养瓶、试管等。
- 未经过严格的消毒处理，如未进行高温灭菌或化学消毒。
- 制备培养基时没有正确的称量和配比，导致培养基中存在过多或过少的某种成分。
- 操作时没有佩戴干净的实验室服装和帽子，容易将外界的杂菌带入发酵系统。
- 操作时没有对抽取样本的工具进行适当的消毒处理，可能会将外界的杂菌带入样品中。
为了避免操作不严谨导致的染菌问题，应采取以下预防措施：- 在实验室中建立操作规范，并进行培训，确保操作人员熟知并遵守相关操作程序。
- 使用洁净的操作工具和容器，并进行必要的灭菌处理。
- 对操作区域进行定期的清洁和消毒，保持操作环境的洁净。
- 在操作过程中密封容器，减少外界微生物的进入。
- 检查操作工具的消毒情况，确保消毒措施的有效性。
3. 培养基污染发酵过程中，培养基是微生物生长和代谢的基础。
如果培养基本身存在污染，就会导致发酵过程的染菌问题。
常见的培养基污染原因包括：- 培养基配制不当，如配制浓度错误、培养基中存在异物。
发酵生产中杂菌的检查和防治
第一节发酵生产中杂菌的检查与防治一染菌的检查与判断凡是在发酵液或发酵容器中侵入了非接种的微生物统称为杂菌污染，及早发现杂菌，及早采取相应措施，对减少由杂菌污染造成的损失至关重要。
因此检查的方法要求准确、快速。
目前发酵生产上常用的检查方法有下列几种：1．显微镜检查一般单染色后用油镜观察，凡是从视野中发现有形态与生产菌株不同的菌体都可认为是污染了杂菌。
优点：简便、快速，能及时检查出杂菌。
缺点：（1）对固形物多的发酵液检查较困难；（2）对含杂菌少的样品不易得出正确结论，应多检查几个视野；（3）由于菌体较小，本身又处于非同步状态，应注意区别不同生理状态下的生产菌与杂菌，必要时可用进行革蓝氏染色、芽孢染色等辅助方法进行鉴别。
2．平板检查若怀疑发酵液被细菌污染，可取少量待检发酵液涂布在肉汤平板上，在适宜条件下培养，若出现与生产菌株形态不一的菌落，就表明可能被杂菌污染；若要进一步确证，可配合显微镜形态观察，若个体形态与菌落形态都与生产菌相异，则可确认污染了杂菌。
优点：（1）适于固形物多的发酵液；（2）形象直观，肉眼可辩，不需仪器。
缺点：（1）所需时间较长，至少也需8小时；（2）无法区分形态（包括细胞形态与菌落形态）与生产菌相似的杂菌，如啤酒生产中污染野生酵母时，由于啤酒酵母与野生酵母很难从形态上加以区分，只能借助生理生化试验进行确认。
（3）检查过程需严格执行无菌操作技术。
3．肉汤培养检查法此法主要用于空气过滤系统和液体培养基的无菌检查。
具体方法是将葡萄糖酚红肉汤培养基（牛肉膏0.3%，蛋白胨0.8%，葡萄糖0.5%，氯化钠0.5%，1%酚红溶液0.4%，pH7.2）装在吸气瓶中，经灭菌后，置37 ℃培养24小时，若培养液未变浑浊，表明吸气瓶中的培养液是无菌的，就可用于空气过滤系统的杂菌检查。
把过滤后的空气引入吸气瓶的培养液中，经培养后，若培养液变混，表明过滤后的空气中仍有杂菌，说明过滤系统有问题，若培养液未变混，说明空气无菌。
第九章 工业发酵染菌的分析与控制
原因：通气不良或停止搅拌导致溶解氧浓度不 足；原料质量差或灭菌效果差导致培养基质量 下降；接种的孢子或菌丝保藏时间长而菌落数 少，泡沫多；罐内装料小、菌丝粘壁等会导致 培养液的菌丝浓度比较低；此外接种物种龄短 等。
(3)代谢不正常 糖、氨基氮等变化不正常，菌体浓度 和代谢产物不正常。 原因：与接种物质量和培养基质量差有关， 还与培养环境条件差、接种量小、杂菌污 染等有关。
二、不同种类的杂菌对发酵的影响
青霉素发酵： 杂菌产生青霉素酶会迅速分解破坏青霉素。 污染细短产气杆菌比粗大杆菌的危害大 链霉素发酵： 污染细短杆菌、假单孢杆菌和产气杆菌比粗大 杆菌的危害大。 四环素发酵： 污染双球菌、芽孢杆菌和夹膜杆菌的危害较大
柠檬酸发酵： 最怕污染青霉菌 肌苷、肌苷酸发酵： 污染芽孢杆菌的危害最大 谷氨酸发酵： 最怕污染噬菌体 高温淀粉酶发酵： 污染芽孢杆菌和噬菌体的危害较大
四、不同染菌途径对发酵的影响
种子带菌： 种子带菌可使发酵染菌具有延续性 空气带菌： 空气带菌也使发酵染菌具有延续性，导 致染菌范围扩大至所有发酵罐 培养基或设备灭菌不彻底： 一般为孤立事件，不具有延续性 设备渗漏： 这种途径造成染菌的危害性较大
五．染菌对产物提取和 产品质量的影响
1．对过滤的影响 发酵液的黏度加大；菌体大多自溶；由 于发酵不彻底，基质的残留浓度加度。 造成过滤时间拉长，影响设备的周转使 用，破坏生产平衡； 大幅度降低过滤收率。
第九章 工业发酵染菌的分析与控制
第一节 发酵染菌的危害
发酵染菌能给生产带来严重危害，防止杂菌污 染是任何发酵工厂的一项重要工作内容。尤其是无 菌程度要求高的液体深层发酵，污染防止工作的重 要性更为突出。 所谓“杂菌”， 是指在发酵培养中侵入了有 碍生产的其他微生物。
染菌的检查
（5）严格操作规范 减少操作失误 1.发酵液必须搅拌混合均匀，灭菌前过滤 2.培养基灭菌时打开与罐相通的所有阀门 3.发酵过程中要调节好罐压，防止掉零 4.严格控制发酵过程当中泡沫大量产生 5.对发酵过程实施无菌检查和即时监测制度 6.加强对操作人员的技术和责任心培训工作 7.加强对无菌室的管理，定时消毒和检查
小结
染菌对发酵的危害： 染菌对发酵的危害： 干扰生产菌的正常代谢， 干扰生产菌的正常代谢，降低产量 改变pH， 改变 ，降解某些产物 污染不同的微生物， 污染不同的微生物，不同阶段染菌危害 染菌对提炼的危害： 染菌对提炼的危害： 过滤困难而大幅度降低过滤收率 有机溶剂萃取时发生乳化
二 染菌的检查
1.显微镜观察法 直接取样观察，优点是简单快速， 缺点是在染菌初期或者在染菌数量较 少时候检测不灵敏。
2. 无菌实验法 （1）肉汤培养法 将配置好的葡萄糖酚红肉汤培养基经灭菌 后放入培养箱37℃培养24h，检查无菌后将 发酵过程中取的样品接入2支培养基，分别置 于37℃和27℃培养24h，对于可疑样品显微 镜下观察。
2、染菌的防预 （1）杜绝种子带菌 严格执行接种移种的无菌操作规范，要不断 提高操作技能，另外无菌室的使用和管理要 严格，在使用前必须紫外灯照射30min，病定 期用药剂处理，定期无菌检查，另外人数也 有限制。
搞好各级种子罐的无菌检测工作，接种培 养后及每隔几个小时要进行无菌检测，在移 入前还应取样无菌观察。 接种管每次使用须彻底灭ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ，再用无菌空 气冷却后进行保压，接种完后也应高压蒸汽 灭菌并吹净管道残留物。
四 染菌原因的分析及预防措施
1、染菌原因分析 （1）从染菌时间分析 种子罐染菌 发酵初期染菌 中后期染菌
（2）从染菌的种类来看 污染耐热的芽孢杆菌 污染球菌等不耐热菌 污染带绿色菌落的杂菌 同时污染多种杂菌 多罐同时污染同一杂菌
发酵工艺染菌综合分析及防止措施
发酵工艺染菌综合分析及防止措施YUKI was compiled on the morning of December 16, 2020发酵工艺：染菌(bacteria infection)综合分析及防止措施原创2016-07-01 arrowone1.造成发酵染菌的可能途径有哪些?菌种培养过程操作不当培养基灭菌不彻底发酵设备(如发酵罐、管道)密封不严空气除菌不净2.既然染菌不可避免，哪我们应该怎样做?要提高生产技术水平，强化生产过程的管理，把握好各个易染菌的环节，尽可能防止发酵染菌的发生；而且一旦发生染菌，要能尽快找出其污染的原因，并采取相应的有效措施，把发酵染菌造成的损失降低到最小。
3.不同发酵过程相对危害最大的杂菌种类？青爲素的发酵细短产气杆菌链霧素的发酵细短杆菌、假单泡杆菌四环素的发酵双球菌、芽他杆菌、荚膜杆菌谷氨酸的发酵噬菌体柠檬酸的发酵青霉菌4.不同生产阶段染菌对发酵的影响：种子培养期染菌:对整个发酵过程的危害极大发酵前期染菌：严重干扰生产菌的生长繁殖发酵中期染菌：干扰生产菌的代谢，影响产物的生成发酵后期染菌：影响相对较小5.不同染菌原因对发酵的影响：种子带菌：将导致染菌范围不断扩大，使生产蒙受重大损失。
空气带菌：使发酵大面积染菌培养基或设备灭菌不彻底：一般不具延续性，使单个（批）发酵罐发酵失败设备渗漏：染菌儿率较大&发酵异常现象及染菌原因分析：（1）溶解氧的异常变化当杂菌是好气性微生物时，溶解氧的变化是在较短时间内下降，直至接近于零，且在长时间内不能回升；当杂菌是非好气性微生物，而生产菌由于受污染而抑制生长，使耗氧量减少，溶解氧升高。
（2）排气的C02异常变化如杂菌污染时，糖耗加快，C02含量含量增加，噬菌体污染后，糖耗减慢，C02 含量减少。
因此，可根据C02含量的异常变化判断染菌。
（3）其它异常现象：如菌体生长不良、pH值的异常变化、发酵过程中泡沫的异常增多、发酵液的颜色异常变化、代谢产物含量的异常下跌、发酵周期的异常拖长、发酵液的粘度异常增加等判断染菌。
发酵生产中杂菌的检查与防治
发酵生产中杂菌的检查与防治Document serial number【UU89WT-UU98YT-UU8CB-UUUT-UUT108】第一节发酵生产中杂菌的检查与防治一染菌的检查与判断凡是在发酵液或发酵容器中侵入了非接种的微生物统称为杂菌污染，及早发现杂菌，及早采取相应措施，对减少由杂菌污染造成的损失至关重要。
因此检查的方法要求准确、快速。
目前发酵生产上常用的检查方法有下列几种：1．显微镜检查一般单染色后用油镜观察，凡是从视野中发现有形态与生产菌株不同的菌体都可认为是污染了杂菌。
优点：简便、快速，能及时检查出杂菌。
缺点：（1）对固形物多的发酵液检查较困难；（2）对含杂菌少的样品不易得出正确结论，应多检查几个视野；（3）由于菌体较小，本身又处于非同步状态，应注意区别不同生理状态下的生产菌与杂菌，必要时可用进行革蓝氏染色、芽孢染色等辅助方法进行鉴别。
2．平板检查若怀疑发酵液被细菌污染，可取少量待检发酵液涂布在肉汤平板上，在适宜条件下培养，若出现与生产菌株形态不一的菌落，就表明可能被杂菌污染；若要进一步确证，可配合显微镜形态观察，若个体形态与菌落形态都与生产菌相异，则可确认污染了杂菌。
优点：（1）适于固形物多的发酵液；（2）形象直观，肉眼可辩，不需仪器。
缺点：（1）所需时间较长，至少也需8小时；（2）无法区分形态（包括细胞形态与菌落形态）与生产菌相似的杂菌，如啤酒生产中污染野生酵母时，由于啤酒酵母与野生酵母很难从形态上加以区分，只能借助生理生化试验进行确认。
（3）检查过程需严格执行无菌操作技术。
3．肉汤培养检查法此法主要用于空气过滤系统和液体培养基的无菌检查。
具体方法是将葡萄糖酚红肉汤培养基（牛肉膏%，蛋白胨%，葡萄糖%，氯化钠%，1%酚红溶液%，）装在吸气瓶中，经灭菌后，置37 ℃培养24小时，若培养液未变浑浊，表明吸气瓶中的培养液是无菌的，就可用于空气过滤系统的杂菌检查。
把过滤后的空气引入吸气瓶的培养液中，经培养后，若培养液变混，表明过滤后的空气中仍有杂菌，说明过滤系统有问题，若培养液未变混，说明空气无菌。
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2、肉汤培养法
通常用葡萄糖酚红肉汤作为培养基，将待测样品直接接入 经完全灭菌后的肉汤培养基中，分别于37℃、27℃进行培 养，随时观察微生物的生长情况，并取样进行镜检，判断 是否有杂菌。 肉汤培养法常用于检查培养基和无菌空气是否带菌，同时 此法也可用于噬菌体的检查。
葡萄糖酚红肉汤 0.3％牛肉膏、0.5％葡萄糖、0.5％NaCl、 0.8％蛋白胨、0.4％酚红溶液，pH 7.2
5.）菌体浓度过高或过低
注意点
① 无菌试验时，如果肉汤连续三次发生变色反应（红色→ 黄色）或产生混浊，或平板培养连续三次发现有异常菌 落的出现，即可判断为染菌。 ② 有时肉汤培养的阳性反应不够明显，而发酵样品的各项 参数确有可疑染菌，并经镜检等其它方法确认连续三次 样品有相同类型的异常菌存在，也应该判断为染菌。 ③ 一般来讲，无菌试验的肉汤或培养平板应保存并观察至 本批（罐）放罐后12h，确认为无杂菌后才能弃去。 ④ 无菌试验期间应每6h观察一次无菌试验样品，以便能及 早发现染菌。
1、镜检法
用革兰氏染色法（Grams stain）对样品进行涂片、染色， 然后在显微镜下观察微生物的形态特征，根据生产菌与杂 菌的特征进行区别、判断是否染菌。
如发现有与生产菌形态特征不一样的其它微生物的存在， 就可判断为发生了染菌。
此法检查杂菌最简单、最直接、最常用。必要时还可进行 芽胞染色或鞭毛染色。
3、平板划线培养或斜面培养检查法
将待测样品在无菌平板上划线，分别于37℃、27℃进行培 养，一般24h后即可进行镜检观察，检查是否有杂菌。有 时为了提高平板培养法的灵敏度，也可将需要检查的样品 先置于37℃培养6h，使杂菌迅速增殖后再划线培养。
4.发酵异常现象观察法
1.）菌体生长差 2.）pH值过高或过低 3.）溶解氧水平异常 4.）泡沫过多
不会发生）连续染菌
3、不同污染生在种子培养阶段，或称种子培养期染菌。通常是 由种子带菌、培养基或设备灭菌不彻底，以及接种操作不 当或设备因素等原因而引起染菌。 在发酵过程的初始阶段发生染菌，或称发酵前期染菌。大 部分也是由于种子带菌、培养基或设备灭菌不彻底，以及 接种操作不当或设备因素、无菌空气等原因而引起。 发酵后期染菌大部分是由空气过滤不彻底、中间补料染菌、 设备渗漏、泡沫顶盖以及操作问题而引起。
耐热的芽胞杆菌 球菌、无芽胞杆菌等
真菌
培养基或设备灭菌不彻底、设备存在死角等 种子带菌、空气过滤效率低、除菌不彻底、设备渗 漏、操作问题等
设备或冷却盘管渗漏、无菌室灭菌不彻底、无菌操 作不当、糖液灭菌不彻底（糖液放置时间较长）等
2、发酵染菌的规模分析
① 大批量发酵罐染菌
染菌时期 发酵前期 发酵中、后期 染菌时期 发酵前期 原因 种子带菌、连消设备染菌
如杂菌类型相同，一般是空气净化系统存在空气 系统结构不合理、空气过滤介质失效等问题 ② 部分发酵罐染菌 原因 种子带菌、连消系统灭菌不彻底
发酵后期 中间补料染菌，如补料液带菌、补料管渗漏 大都由于设备渗漏造成，应仔细检查阀门、罐体或罐器是否清洁等。 ③ 个别发酵罐连续染菌（如果采用间歇灭菌工艺，一般 一般设备渗漏引起的染菌，会出现每批染菌时间向前推移地现象。
染菌的检查及原因分析
一、染菌的检查和判断
发酵过程是否染菌应以无菌试验的结果为依据进行判断。
在发酵过程中，如何及早发现杂菌的污染并及时采取措施 加以处理，是避免染菌造成严重经济损失的重要手段。因 此，生产上要求能准确、迅速的检查出杂菌的污染。 目前常用于检查是否染菌的无菌试验方法主要有显微镜检 查法、肉汤培养法、平板（双碟）培养法、发酵过程的异 常观察法（如溶氧量）等。
空气系统染菌 设备问题 管理和操作不当
1、染菌的杂菌种类分析
对于每一个发酵过程而言，污染的杂菌种类的影响是不同的。
发酵产品 青霉素 链霉素 四环素 柠檬酸 谷氨酸
杂菌
危害大的杂菌 细短产气杆菌 细短杆菌、假单胞菌、产气杆菌 双球菌、芽胞杆菌、荚膜杆菌 青霉 噬菌体
原因
危害小的杂菌 粗大杆菌 粗大杆菌
二、发酵染菌原因分析
发酵染菌后，一定要找出染菌的原因，以总结防治发酵染菌的经验 教训，积极采取必要措施，把杂菌消灭在发生之前。如果对已发生 的染菌不作具体分析，不了解染菌原因，未采取相应的措施来防治 染菌，将会对生产造成严重的后果。 造成发酵染菌的原因很多，且因工厂不同而有所不同，但设备渗漏、 空气净化达不到要求、种子带菌、培养基灭菌不彻底和技术管理不 善等造成各厂污染杂菌的普遍原因。 上海天厨味精厂谷氨酸发酵染菌分析 染菌原因 染菌百分率/％ 32.05 15.46 11.34 染菌原因 补料、取样带菌 种子带菌 环境污染及原因不明 染菌百分率/％ 4.30 1.72 35.13