实验六 氨基酸的纸层析法

氨基酸的纸层析法
一．目的
了解并掌握氨基酸纸层析的原理和方法。

二、原理
以滤纸为支持物的层析法，称为纸层析法。

纸层析所用展层剂大多由水和有机溶剂组成。

展层时，水为静止相，他与滤纸纤维亲和力强；有机溶剂为流动相，它与滤纸纤维亲和力弱。

有机溶剂在滤纸上又下向上移动的，称为上行法；有上向下移动的，称为下行法。

将样品在滤纸上确定的原点处展层，由于样品中各种氨基酸在两相中不断进行分配，且他们的分离系数各不相同，所以不同的氨基酸随流动相移动的速率也不相同，于是各种氨基酸在滤纸上就相互分离出来，形成距原点不等的层析点。

在一定条件下（室温、展层剂的组成、滤纸的质量、PH值等不变），不同的氨基酸有固定的移动速率（Rf值）Rf=原点到层析点中心的距离/原点到溶剂前沿的距离。

用混合氨基酸做样品时，如果只用一种溶剂展层，由于某些氨基酸的移动速率相同或相近，就不能将它们分开，为此，当用一种溶剂展层后，可将滤纸旋转90度，以第一次所的层析点为原点，在用另一溶剂展层，从而达到分离的目的。

这种方法称为双向层析法。

本试验主要介绍的是单向层析法。

其中混合氨基酸有精氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸组成。

三、实验仪器
1、新华滤纸
2、层析缸
3、细线
4、点样管
5、橡皮筋
6、电吹风
7、喷雾器
四、实验试剂
1、混合氨基酸（精氨酸，酪氨酸，苯丙氨酸）
2、展层剂：正丁醇：12%氨水：95%乙醇：蒸馏水=13：3：3：1（v:v）
3、0.5%茚三酮—无水丙酮溶液：0.5g茚三酮溶于100ml无水丙酮，贮于棕色瓶中
五、实验步骤
1、取滤纸剪成20×10厘米的滤纸条一张，在一端打孔，系一根细线，在另一端2~3cm处用铅笔画一横线，中间画一圆点（原点）。

2、取毛细管一支(回收)，吸取氨基酸混合液，在原点处点样，样点直径不宜超过5mm,每点一次用吹风机吹干，点2~3次为佳。

3、点样后将滤纸放入层析缸中展层，注意点样线要高于层析液面，滤纸不要贴在层析缸璧上，当展层至另一端1~2cm处时，停止展层（大约2~3小时）。

4、取出滤纸，用铅笔记下溶剂前沿，然后用热风吹干（或烘箱60℃）烘干。

5、均匀喷上茚三酮—无水丙酮液，注意使溶液不倒流，不间断。

6、用吹风机吹干，观察层析点，确定其几何中心。

7、量取数值，计算各自的Rf值，与表中标准氨基酸Rf值比较，确定样品氨基酸种类。

（书上图谱横着看）
六．实验结果
从左到右依次为H、H1、H2、H3、H4。

H1=1.0cm H2=4.4cm H3=5.0cm H4=0.99cm H=11.7cm 由此可得
Rf1=0.08547
Rf2=0.37607
Rf3=0.42735
Rf4=0.08461
据此可知，混合氨基酸是由甘氨酸（Gly）和苯丙氨酸（Phy）组成。

七．实验分析
实验中出现了拖尾的现象。

拖尾现象是指展层，显色后在层析分配图上，所看到的某一种氨基酸的分子位移，不是如标准图谱所示的那样，完整地显示在某一位置上，而是形成象笤帚似的那样，前端粗圆而逐渐细小下来，宛如拖着一个尾巴。

其图所呈颜色也是由浓渐淡。

图象的出现，是在实验中对影响Rf值的主要因素要求，掌握不够所致。

诸如，物质结构与极性对Rf值的影响，层析溶剂对Rf值的影响，PH对Rf值的影响(溶剂、滤纸和样品的PH值)，温度对Rf值的影响，滤纸的质地是否均匀，薄厚是否适当，纤维的松紧度是否适中等对Rf值的影响，展层的方式(上行、下行)对Rf值的影响。

然而在多次实验过程中无论怎佯严格遵循其影响Rf值的主要因素的要求，都仍不可避免地要出现拖尾现象。

此时，这就需要从具体操作规范方面，诸如样品的处理，点样、展层、显色等几个操作程序去考虑思索，经仔细分析，样品的处理是为除去杂质纯化样品，达到层析分配某氨基酸的情晰显色图像；展层过程是在上述影响Rf值的主要因
素要求下进行，使样品达到一个适当的位移，便于在显色后从图象上，区分不同样品的氨基酸；显色是在用配制好的，与水不相混合，并挥发性较快喷雾后迅速吹干的。

更何况显色剂又是含水量极低，不会影响洋品的斑点扩散，那么问题就集中在点样这个操作程序上了。

点样是将被层析分配的几种氨基酸混合液，和为了对照实验结果，而分别配制的几种氨基酸的溶液，用微量点样管或毛细管，或血球计数器将5一j5微升的样品，点在以滤纸为惰性支持物的层析纸上设计好的多点位置中去。

点样后要自然风干，或冷风吹干。

最好不要用加热装置，如吹风机，灯泡之类的热源将其样品点加速干燥。

因为加热装置在学生操作时，一但注意不够，掌握不好，则温度升高势必要使样品破坏，更会使佯品点干的太燥。

正是由于这样，样品点太干燥，使其样品物的分子，牢固地吸牢在层析纸的纤维上。

所以在展层过程中，样品点的每个物质分子，不能在层析纸上同时起步，而是形成了有先有后，鱼贯而上行或下行的状况，最终使洋品物质的分子，不能同时都集中到达一个位置。

致使在显色后，实验结果的图象上，观察到的不是一个完整的斑点，而是一个拖着尾巴的斑点。

这就是上述所说的拖尾现象。

纸上分配层析所出现的拖尾现象，究其原因很简单，就是在点样品后，样品点吹的太干燥所致。

样品点不要吹的太干燥，否则，样品物质的分子，会牢吸在层析纸的纤维上，出现拖尾现象”。

影响 Rf值的主要因素
1.物质结构对于Rf值的影响：“物以类聚”，极性物质易溶于极性溶剂(水)中，非极性物质易溶于非极性溶剂(有机溶剂)中。

所以物质的极性大小决定了物质在水和有机溶剂之间的分配情况。

例如酸性和碱性氨基酸极性大于中性氨基酸。

所以前者在水(固定相)中分配较多，因此Rf值低于后者。

2.溶质与溶剂间的相互作用对Rf值的影响：这种影响是由溶质与溶剂间的相互作用与分配系数的关系所决定的。

溶质与溶剂之间若能形成氢键，对分配系数的影响就很大。

例如酚、三甲基吡啶、氨等和水混合后都能很好地与溶质形成氢键。

某些溶剂(例如酚，正丁醇等)是质子的供给体，而水既是质子的供给体又是质子的接受体。

当溶质结构中增加能接受质子的基团(例如NH ２ )时，因酚与水都能给 NH ２基提供质子，所以酚和水两相对接受质子的基团的引力，基本上是一致的，因此当溶质结构中增加氨基时，该物质与酚和水的作用对其在酚和水两相间的分配影响不大，对Rf值影响较小。

又例如当有机溶剂是质子的接受体(如三甲基吡啶，NH 3 等)，而溶质也是质子的接受体(如-NH ２基)，这时有机溶剂对-NH ２没有引力，而水却有引力，于是水的引力就大于有机溶剂，因此溶质就被水拉向水相，对Rf值的影响就大。

3.pH对Rf值的影响：这种影响主要是由pH与分配系数的关系所决定的。

弱酸与弱碱的解离度受pH影响很大，解离度越大，极性越强，极性强的物质在两相溶剂中分配时，偏向于极性强的
一相，这样，改变pH就会同时改变分配系数，从而使Rf也会相应变化。

在氨基酸的层析法中，改变溶剂的pH，使酸性和碱性氨基酸的Rf值变动较大，而中性氨基酸的Rf值变动较小。

在正丁醇中加甲酸，可使酸性氨基酸的极性降低，从而使Rf值变大，而使碱性氨基酸的Rf变小。

反之，如在正丁醇中加氨，可使天冬氨酸和谷氨酸的Rf值变小，而使赖氨酸、精氨酸等碱性氨基酸的Rf值变大。

4. 滤纸对Rf值的影响：滤纸本身的pH及含水量对Rf值的影响很大，所以不同的滤纸得到不同的Rf值及不同的斑点形状。

纸上含水量的多少随溶剂与纸对水的亲和力的大小而异，质地不均一的滤纸常使溶剂扩展不一致，随着纤维的纹理流动紊乱，另一方面纸的含水量不均一，也不能得到理想的分离效果。

5.温度对 Rf值的影响： Rf值的重现性与恒温情况的好坏有密切关系。

温度对Rf 值的影响主要是因为溶质在固体相与流动相之间的分配随温度的变化而不同。

随各溶剂组分的粘度和表面张力的不同其蒸发能力也不同，因此有些溶剂系统对温度的敏感程度强些，有些则差些。

敏感程度强的对温度的要求就严格，敏感程度差的对温度的要求就不太严格。

温度改变使溶剂系统中的溶解度改变，所以 Rf值也改变。

一般层析展层是在恒温室中进行的，室温可在20℃至40℃，温度改变不超过±0.5℃。

无色物质的层析图谱可用光谱法 (如核苷酸类物质用紫外光照射)或显色法鉴定。

氨基酸纸上层析图谱常用的显色剂有茚三酮、
吲哚醌。

本实验采用茚三酮为显色剂。

茚三酮显色反应受温度、pH，时间影响较大。

如果要使结果重复，必须严格控制上述条件。

样品中如含有大量盐酸会使氨基酸不显出颜色。

样品中含大量盐时显色点上会出现白斑，空气中其它的杂质如氨，硫化氢或酚等皆会影响显色结果。

铜离子可以与氨基酸-茚三酮显色物形成络合物，颜色较稳定，用硫酸铜乙醇溶液洗脱层析后的显色斑点，可以通过比色法定量测定氨基酸含量。

由于纸上层析设备条件较简单，操作比较简便，并可以分离微量样品，因此纸层析方法已成为生化分析和研究的主要方法之一，广泛应用于氨基酸、肽、核苷酸，糖、维生素以及脂肪酸等的分离鉴定。