纸层析法分离氨基酸
纸层析法分离氨基酸
纸层析法分离氨基酸一、前言1、分离氨基酸的主要方法：(1) 离子交换法，根据氨基酸是两性电解质这一特征,以及目的氨基酸与杂质氨基酸pK、pI值的差异,利用离子交换树脂对各种氨基酸吸附能力的不同对氨基酸进行分离纯化。
离子交换法的分离步骤主要包括树脂的处理、装柱、平衡、加样、洗脱等步骤. 离子交换法也有自身的局限性，由于离子交换法是利用氨基酸等电点的不同，所以当两个或者多个氨基酸的等电点相近时，便无法分离，另外，氨基酸在树脂当中扩散速度较快，就要求料液的流速也相对较慢，这样自然造成了分离的缓慢，离子交换本身的生产原理也决定了反应难以连续还进行，这给工厂自动化生产带来影响，难以大规模地推广。
(2) 沉淀法，沉淀法是历史最悠久的分离纯化方法，目前仍在工业上发挥着重大的作用。
氨基酸工业中常用沉淀法有等电点沉淀法，特殊试剂沉淀法和有机溶剂沉淀法。
沉淀法原理是根据某些氨基酸可以与某些有机或者无机化合物结合而形成沉淀，可以利用这种性质向溶液中加入特定的沉淀剂，使目标氨基酸沉淀，与其他氨基酸分离，在分离后再将氨基酸与沉淀剂分离即可。
现在较为成熟的分离方法有精氨酸与苯甲醛在低温条件下，缩合成溶解度小的苯亚甲基精氨酸，从而析出沉淀，析出的沉淀用盐酸处理即可分离得到目标氨基酸精氨酸的盐酸盐；亮氨酸与邻-二甲苯-4-磺酸反应，可生成亮氨酸的磺酸盐。
沉淀法的优点是方法简单，选择性强，但是缺点同样明显，沉淀剂回收困难，造成废液排放污染加剧。
(3) 萃取法，萃取法主要包括反应萃取法、溶剂萃取法、反向微胶团萃取、液膜萃取法等。
其中，反应萃取法是选择适当的萃取剂，使萃取剂解离出来的离子与氨基酸解离出来的离子发生反应，生成可以溶于有机相的物质，从而使氨基酸从水相进入有机相，进而分离氨基酸。
溶剂萃取法，由于氨基酸是离子型化合物，氨基酸在物理萃取时难以高效提取的，因此常用化学发来萃取氨基酸。
(5) 电透析，由于氨基酸拥有不同的等电点，故可以通过控制溶液的PH值，使氨基酸带有正负电荷，即当PH大于等电点时，带有负电荷，将氨基酸放置在电场中，会带上负电，并且移向正极，相反，PH值小于等电点时，则带上正电荷，氨基酸向负极移动。
(2023)纸层析法分离氨基酸实验报告(一)
(2023)纸层析法分离氨基酸实验报告(一)实验报告：纸层析法分离氨基酸实验目的通过纸层析法分离并鉴定氨基酸的类型及其浓度。
实验原理纸层析法是一种简单的分离技术，它的分离原理就是根据溶液成分在固定相上的不同运移速度而分离出各种化合物的方法。
氨基酸属于碱性氨基酸、酸性氨基酸和非极性氨基酸三类，它们在纸层析上的运移速度不同，可以通过将样品施加到起始线处，用溶剂上升将样品分离成单独的氨基酸，从而鉴定氨基酸的类型和浓度。
实验步骤1.准备好样品；2.准备纸层析板和移层溶剂；3.在纸层析板上留下起始线处，将样品点于起始线上；4.将纸层析板浸泡在移层溶剂中，注意不要使样品触及移层溶剂；5.待溶剂上升至足够高处后将纸层析板取出晾干；6.可选择用氨基酸定性试剂对氨基酸进行鉴定。
实验结果经过实验，分离出了6种氨基酸，它们是： 1. 苯丙氨酸 2. 丝氨酸3. 脯氨酸4. 缬氨酸5. 赖氨酸6. 天冬氨酸结论纸层析法是一种常用的分离技术，适用于分离和鉴定氨基酸等化合物。
通过本次实验，我们了解了氨基酸在纸层析上的运移规律，并成功地分离出了样品中的6种氨基酸。
实验分析在实验中，我们使用纸层析法分离鉴定了氨基酸。
纸层析法是一种简便易行的分离方法，常用于生物学和化学研究中。
它的原理是利用固定相吸附和液态相洗脱分离成分，从而实现混合物分离和提纯的过程。
氨基酸是构成蛋白质的基本单位，其种类丰富，具有重要的生物学和化学意义。
氨基酸的分离和鉴定对于深入研究生命科学和化学领域的相关问题具有十分重要的意义。
在实验中，我们采用纸层析法将溶液中的氨基酸分离开来。
由于氨基酸的不同极性和分子大小不同，它们在纸层析中的运移速度存在较大差异，可以通过纸层析进行分离。
在实验中，我们通过将氨基酸样品点于纸层析板上的起始线处，并将其浸泡于移层溶剂中，利用溶剂的上升，将氨基酸分离开来。
实验不足与改进在实验过程中，我们虽然成功地分离出了样品中的氨基酸，但存在一定的不足。
氨基酸的分离鉴定 纸层析法实验报告
氨基酸的分离鉴定纸层析法实验报告氨基酸的分离鉴定纸层析法实验报告引言：氨基酸是构成蛋白质的基本组成单元，对于研究生物化学和生物学具有重要意义。
而氨基酸的分离鉴定是了解其性质和结构的关键步骤之一。
本实验旨在通过纸层析法对混合氨基酸溶液进行分离和鉴定，以探究纸层析法在氨基酸分析中的应用。
实验步骤：1. 实验前准备：准备好混合氨基酸溶液、纸层析纸、色谱槽和色谱溶液。
2. 制备纸层析纸：将纸层析纸剪成适当大小的长方形，用铅笔在距离底部1.5cm处画一条水平线，再在该线上距离左边1cm处画一个小点。
3. 装置纸层析槽：将纸层析纸的底端浸入色谱槽中，确保纸层析纸上方的溶液不超过纸层析纸的底端。
4. 样品加载：用微量吸管将混合氨基酸溶液滴在纸层析纸上的小点上，尽量避免溶液滴到纸层析纸以下的溶液中。
5. 开始分离：将色谱槽盖好，待溶液上升至纸层析纸的顶端时，取出纸层析纸，迅速标记各个斑点的位置。
6. 斑点分析：将纸层析纸放入紫外灯下观察，记录各个斑点的颜色和位置。
结果与讨论：通过纸层析法，我们成功地将混合氨基酸溶液进行了分离和鉴定。
在紫外灯下观察，我们可以清晰地看到在纸层析纸上出现了多个斑点。
根据斑点的颜色和位置，我们可以初步判断其中的化合物。
在本次实验中，我们使用的混合氨基酸溶液包含了苏氨酸、甘氨酸和丙氨酸三种氨基酸。
根据实验结果，我们可以看到在纸层析纸上出现了三个主要的斑点。
根据颜色和位置的初步判断，我们可以推测第一个斑点为苏氨酸，第二个斑点为甘氨酸，第三个斑点为丙氨酸。
然而，仅凭颜色和位置的初步判断还不足以确定化合物的身份。
为了进一步确认各个斑点的化合物，我们可以利用已知标准物质进行对照。
通过比较已知标准物质的斑点与实验样品的斑点，我们可以准确地鉴定各个斑点所代表的氨基酸。
结论：通过纸层析法，我们成功地对混合氨基酸溶液进行了分离和鉴定。
根据初步判断，我们可以推测出混合溶液中的苏氨酸、甘氨酸和丙氨酸的存在。
氨基酸的分离鉴定纸层析法
氨基酸的分离鉴定纸层析法引言：氨基酸是构成蛋白质的基本组成单元，对于生物体的正常生理功能至关重要。
因此，准确地分离鉴定氨基酸成分对于研究蛋白质结构和功能具有重要意义。
纸层析法是一种简单而有效的分离和鉴定氨基酸的方法。
本文将介绍氨基酸的分离鉴定纸层析法并探讨其应用。
一、纸层析法的原理纸层析法是利用气相平衡原理进行物质分离的一种方法，其原理是根据物质在纸上各组分的相对亲疏性，通过运动距离的差异来分离物质。
在氨基酸的分离鉴定中，纸层析法通过将待测氨基酸溶液滴于纸上，然后将纸立起来，将纸的下端浸入相应的溶剂中，使得溶剂上升，通过毛细作用将氨基酸上提，最终实现氨基酸的分离和鉴定。
二、纸层析法的步骤1. 准备工作：制备纸层析板和显色剂。
2. 样品处理：将待测氨基酸溶解于适量的溶剂中，使其浓度适宜，然后滴于纸层析板上。
3. 运行纸层析：将纸层析板立起，纸的下端浸入相应的溶剂中，待溶剂上升到一定高度后，取出纸层析板。
4. 显色：将纸层析板放置于显色剂中，通过氨基酸与显色剂的反应，使得氨基酸在纸上显色。
5. 结果鉴定：根据显色的位置、颜色和强度等特征，对氨基酸进行鉴定和定量分析。
三、纸层析法的应用1. 氨基酸组成分析：纸层析法可用于分析蛋白质中氨基酸的组成，从而揭示蛋白质的结构和功能。
2. 质量控制：纸层析法可用于对食品、药品等中氨基酸含量的快速检测，保证产品质量和安全性。
3. 生物体内氨基酸代谢研究：纸层析法可用于研究生物体内氨基酸的代谢途径和代谢产物。
四、纸层析法的优缺点纸层析法作为一种常用的分离和鉴定氨基酸的方法，具有以下优点：1. 简单易行：操作简单，不需要复杂的仪器设备，成本低廉。
2. 分离效果好：对于氨基酸的分离效果较好，可以得到较为准确的结果。
3. 易于观察：通过显色剂的反应，可以直观地观察到氨基酸在纸上的分离和鉴定结果。
然而，纸层析法也存在一些缺点：1. 分离效果有限：对于某些结构相似的氨基酸，纸层析法的分离效果不佳，难以实现准确鉴定。
氨基酸纸层析法
氨基酸纸层析法氨基酸纸层析法（paper chromatography of amino acids）是一种常用的分离和鉴定氨基酸的方法。
本文将详细介绍氨基酸纸层析法的原理、步骤、实验条件和数据处理方法等内容，以帮助读者更好地了解并应用这一实验技术。
一、氨基酸纸层析法的原理氨基酸纸层析法是利用氨基酸在纸上的分布系数和溶剂的渗透速度差异进行分离的方法。
其原理是在一根滤纸条上画上水平的线，将待测的氨基酸溶液直接点于纸条上，待溶液中的氨基酸离子在滤纸上沿渗透液前进，不同氨基酸在滤纸上的迁移速度不同，从而实现氨基酸的分离和测定。
二、氨基酸纸层析法的步骤1. 实验前准备（1）准备氨基酸样品，将其溶解在适当的溶剂中，并使用pH 计调节至适当的酸碱度。
（2）准备滤纸条，按照实验需要确定滤纸的宽度和长度。
（3）准备层析槽，将槽中的溶剂预先与上盖采光纸取代，避免有光照射到。
2. 进行层析实验（1）在滤纸条上绘制水平基线，并将标记的点分开，便于后续氨基酸的测定。
（2）将氨基酸溶液直接点于滤纸条上，点的位置要尽量靠近基线，以避免扩散的影响。
（3）将纸条的一端浸入含有适当溶剂的层析槽中，保持溶剂的面平稳。
（4）待溶液中的氨基酸在滤纸上渗透，不同氨基酸迁移的距离不同，最终在纸条上形成清晰的色斑。
（5）将纸条取出，用热风干燥，然后在紫外灯下进行观察和记录。
3. 数据处理将滤纸上的色斑分别用铅笔勾画出来，并测量它们与基线之间的距离。
然后，根据距离之间的比例关系来计算氨基酸在纸上的迁移速度，并与标准曲线进行比较，从而得出待测氨基酸的浓度。
三、氨基酸纸层析法的实验条件1. 溶剂体系常用的溶剂体系有正丙醇/ 乙酸/水 = 4:1:5、正丙醇/氨水/水 = 70:2:25等，需要根据实验需要确定溶剂的组成和比例。
2. 滤纸条的准备常用的滤纸有菱形滤纸和圆形滤纸，需要根据所需分离的氨基酸种类和数量决定滤纸的大小。
3. 实验条件实验应在干燥、通风的环境中进行，避免光照和温度过高。
实验一纸层析法分离鉴定氨基酸
【三、器材与试剂】
【三、器材与试剂】 器材： 1、层析缸 2、毛细管 3、喷雾器 4、培养皿 5、层析滤纸(新华一号) 试剂： 1、扩展剂 （正丁醇：水：冰醋酸= 4：3：1） 2、显色剂 0.1％茚三酮正丁醇溶液。 3、氨基酸溶液 0.5％的赖氨酸、脯氨酸、缬氨酸、亮氨酸溶液 及它们的混合液
显色： 用喷雾器均匀喷上0。1％茚三酮正丁醇溶液，然后置烘箱中烘烤5分钟(100℃)或用热风吹干即可显出各层析斑点。
计算Rf值
【五、实验结果与分析】
【六、注意事项】
【七、思考题】
1、实验中作为固定相和流动相的物质分别是什么？ 2、Rf值的含义、影响因素？
下次实验 ： 实验二 蛋白质和氨基酸的颜色反应
值 日 生 值 日
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小实验
当滤纸接触到溶剂时，溶液将上升。 滤纸上的小圆点是4种不同的氨基酸的混合物。 看看接下来会发生什么事情…
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可以看出1号氨基酸上升的最高，在滤纸上跑得最快。 而4号氨基酸与滤纸的结合最紧，因此跑的速度比其他的氨基酸慢。
这就是纸色谱法。 对照上图，可知道1-4号的各代表什么氨基酸。 纸色谱法是分离鉴定蛋白质的氨基酸组成的重要工具。
实验一 纸层析法分离鉴定氨基酸
【一、实验目的】
【二、实验原理】
层析技术 是利用混合物中各组分的物理化学性质的差别，使各组分以不同程度分布在两相中，其中一相为固定相，另一相流过此相称作流动相，并使各组分以不同速度移动，从而达到分离的目的。 可分离物质 糖类、有机酸、氨基酸、核苷等
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固定相 在层析中起分离作用而不随层析过程移动的物质。如纸层析中固定相是滤纸纤维中结合的水。固定相被看成是样品移动的阻力。
氨基酸的分离鉴定——纸层析
氨基酸的分离鉴定——纸层析氨基酸是构成蛋白质的基本单元，其在生物体内的作用极为重要。
因此对氨基酸的分离和鉴定具有重要的研究意义。
纸层析是一种常用于分离和鉴定氨基酸的方法。
其原理是利用氨基酸在纸层析板上的运动速度不同，根据氨基酸之间的相互作用，分离出各种氨基酸。
实验步骤：1. 纸层析板的制备将一张高分子量纸，如Whatman No.1滤纸，剪成所需要的大小，并用铅笔在纸上画出氨基酸移行的标线。
2. 氨基酸样品的制备将所需的氨基酸样品溶解在适量的水中，浓度应为0.2-2%。
3. 样品的上样将氨基酸溶液利用微量注射器沿着标线往上移行。
在上样后，将纸层析板放在带有盖子的玻璃罩中，罩中放置一些饱和度为70%的异丙醇-水溶液，保持相对湿度为70%，使其充分展开。
5. 鉴定氨基酸将经过分离的氨基酸溶液阴性反应的氨基酸用二乙酰胺-丙酮混合溶液鉴定。
将0.2ml 二乙酰胺-丙酮混合溶液加入几滴氨基酸样品中，加热60℃-80℃，5分钟。
加入0.1ml氯仿，振荡混合，分离出上清液，上清液加入干燥瓶中，用喷雾器喷洒Ninhydrin试剂，加热于热水中1分钟，在冷水中快速降温附着氨基酸的部位呈现紫色。
注：二乙酰胺-丙酮混合溶液的组成为45%二乙酰胺，45％丙酮和10%水。
6. 结果的解释根据氨基酸在纸层析板上的运动速度和比色反应的颜色，确定样品中的氨基酸种类及含量。
优点：纸层析方法简便易行，无需昂贵的仪器设备，适用于小样品分析，能分离不同种类的氨基酸，并且结果清晰，操作简单。
限制：纸层析分离结果受到氢键作用和酸碱度等因素的影响，需要控制好上样的数量和浓度。
此外，纸层析无法分离胶原氨基酸和类似结构的氨基酸，且鉴定结果在颜色和色谱图谱方面有些模糊。
纸层析法—氨基酸的分离与鉴定
纸层析法—氨基酸的分离与鉴定纸层析法——氨基酸的分离与鉴定⼀、实验⽬的1、了解纸层析法的使⽤原理。
2、掌握⽤纸层析法分离蛋⽩质的操作步骤。
⼆、实验原理1、纸层析法是以滤纸作为惰性⽀持物的分配层析⽅法，滤纸上的纤维具有羟基，是亲⽔基团，滤纸吸附⽔作为固定相，其上流经的有机溶剂即展层剂作为流动相。
当展层剂流经固定相时，固定相上的样品由于亲⽔、疏⽔能⼒不同，在两相之间不断分配，疏⽔能⼒强的多溶于流动相，随流动相移动距离较远，亲⽔能⼒强的移动距离则较近。
2、所有的氨基酸的α碳上均连接⼀个氢原⼦和两个亲⽔基团羧基（—COOH）与氨基（—NH2），唯⼀的不同则在于R基团。
因此R基团在氨基酸的亲⽔疏⽔能⼒对⽐中起到了决定性的作⽤。
本实验采⽤丙氨酸，苯丙氨酸，天冬氨酸，其R基团分别是—CH3，—CH2—C6H5，—CH2—COOH，其亲⽔疏⽔能⼒迥异，能在滤纸上明显分开。
3、Rf值表⽰原点中⼼⾄显⾊斑点中⼼的距离与原点中⼼⾄流动相前沿的距离⽐。
在⼀定条件下，Rf值为定值，其影响的因素有物质本⾝的性质，溶剂的性质，PH值，温度，滤纸的性质等等，本实验不予探究。
在测量原点中⼼⾄显⾊斑点中⼼的距离时，由于斑点的形状不规范（近似圆形），所以，⼀般取斑点的重⼼，测量出重⼼与起点的距离即可。
4、显⾊原理：茚三酮在弱碱性溶液中与α—氨基酸共热，引起氨基酸氧化脱氧，脱羧反应，最后茚三酮与反应产物——氨和还原茚三酮发⽣作⽤⽣成紫⾊物质。
三、试剂（⼀）提前配制试剂8*10-3mol/L丙氨酸溶液：精确称取0.356g晶体，溶解后定容到500ml。
8*10-3mol/L苯丙氨酸溶液：精确称取0.661g晶体，溶解后定容到500ml。
8*10-3mol/L天冬氨酸溶液：精确称取0.532g晶体，溶解后定容到500ml。
（将上述三种溶液装于⼩瓶中实验时，每两组共⽤⼀组试剂）正丁醇88%甲酸蒸馏⽔茚三酮晶体注：实验时，以上试剂均为每两组同学共⽤⼀组试剂。
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纸层析法分离氨基酸目的和要求掌握分配层析的原理，学习氨基酸纸层析法的操作技术(包括点样、平衡、展层、显色、鉴定及定量)。
学习未知样品的氨基酸成分(水解、层析及鉴定)分析的方法。
原理层析法亦称色层分离法、色谱分析法或色谱法。
1903年俄国化学家茨维特(M. Tswett)发现用挥发油冲洗菊粉柱时，各种颜色的色素在吸附柱上从上到下排列成色谱，故称“色层分离法”。
1931年有人用氧化铝柱分离了胡萝卜素的两种同分异构体，显示了这一分离技术的高度分辩力，从此引起了人们的广泛注意。
自1944年应用滤纸作为固定支持物的“纸层析”诞生以来，层析技术的发展越来越快，五十年代开始，相继出现了气相色谱和高压液相层析，其它如薄层层析、亲合层析、凝胶层析等也迅猛发展。
层析分离技术操作简便，样品用量可大可小，既可用于实验室分离分析，又适用于工业生产中产品的分析制备。
现已成为生物化学、分子生物学、生物工程等学科广泛应用而又必不可少的分析工具之一。
根据所用的支持物及其理化性质不同可将层析法分成三类：1. 用固体吸附剂做支持物的称吸附层析；2. 用吸附了某种溶剂的固体物质(如滤纸)做支持物的称为分配层析；3. 用其表面所含离子能与溶液中的离子进行交换的固体物质做支持物的称为离子交换层析。
纸层析所依据的原理是分配层析，故属于分配层析的范畴。
㈠分配层析分配层析法是利用不同的物质在两个互不相溶的溶剂中的分配系数不同而使之得到分离的方法。
将分配层析法中的一种溶剂设法固定在一个柱内，再用另外一种溶剂来冲洗这个固定柱，同样可达到将不同物质分离的目的。
我们把固定在柱内的液体称为固定相，把用作冲洗的液体叫做流动相。
为了使固定相固定在柱内，需要有一种固体物质把它吸牢，这种固体物质本身对分离无作用，对溶质也几乎没有吸附能力，称为支持物。
进行分离时由于被分离物质的各组分在两相中的分布不同，因此当流动相移动时，不同组分移动的速度也不相同。
易溶于流动相中的组分移动快，在固定相中溶解度大的组分移动就慢，结果得以分离。
显然，分配层析法中不同溶质的分离取决于其在两相(固定相和流动相)间分配系数的不同，分配系数(α)的定义是：α =溶质在固定相的浓度(C S)/溶质在流动相的浓度(C L)滤纸层析法是以滤纸作为惰性支持物的分配层析。
滤纸的成份是纤维素，其–OH基为亲水性基团，可吸附一层水或其它溶剂作为固定相(S)。
通常把有机溶剂作为流动相(L)。
当将溶质样品(被分离物)点在滤纸的一端后，该物质溶解在吸附于支持物上的水分子或其它溶剂分子的固定相中，有机溶剂作为流动相自上而下移动，称为下行层析；反之，使有机溶剂自下而上移动，称为上行层析。
流动相流经支持物时即可与固定相对溶质进行连续的抽提，物质在两相间不断分配的结果即得到分离。
滤纸层析原理还可进一步解释如下：把滤纸看成一个层析柱，后者由多个连续的微板层构成，与溶剂饱和水一道组成固定相；某有机溶剂用作流动相。
当第一层流动相中加入分配系数不同的单位量A、B两物质后，各溶质即可根据一定的分配系数在两相中进行分配，而随着流动相继续向下层移动，各层固定相与新流下的流动相之间会不断进行新一轮的分配。
如此继续抽提下去，A、B两物质就可以完全分开。
显然，各物质分配系数相差越大，则越易分开。
物质分离后在图谱上的位置可用比移值Rf来表示，Rf值的定义是：从溶质层析的起点(原点)到层析斑点中心的垂直距离与从原点到溶剂流动的前沿的垂直距离的比值：Rf = 原点到层析点中心的距离/原点到溶剂前沿的距离两相体积比在同一实验情况下是不变的，所以Rf值的主要决定因素是分配系数(α)。
由于每一物质在一定条件下α值是固定的，因此Rf值为其特征常数，可做为定性鉴定的参考数值。
㈡影响Rf值的主要因素1. 物质结构对于Rf值的影响：“物以类聚”，极性物质易溶于极性溶剂(水)中，非极性物质易溶于非极性溶剂(有机溶剂)中。
所以物质的极性大小决定了物质在水和有机溶剂之间的分配情况。
例如酸性和碱性氨基酸极性大于中性氨基酸。
所以前者在水(固定相)中分配较多，因此Rf值低于后者。
2. 溶质与溶剂间的相互作用对Rf值的影响：这种影响是由溶质与溶剂间的相互作用与分配系数的关系所决定的。
溶质与溶剂之间若能形成氢键，对分配系数的影响就很大。
例如酚、三甲基吡啶、氨等和水混合后都能很好地与溶质形成氢键。
某些溶剂(例如酚，正丁醇等)是质子的供体，而水既是质子的供体又是质子的受体。
当溶质结构中增加能接受质子的基团(例如-NH2)时，因酚与水都能给-NH2提供质子，所以酚和水两相对接受质子的基团的引力，基本上是一致的，因此当溶质结构中增加氨基时，该物质与酚和水的作用对其在酚和水两相间的分配影响不大，对Rf值影响较小。
又例如当有机溶剂是质子的受体(如三甲基吡啶等)，而溶质也是质子的受体(如-NH2基)，这时有机溶剂对-NH2没有引力，而水却有引力，于是水的引力就大于有机溶剂，因此溶质就被水拉向水相，对Rf值的影响就大。
3. pH对Rf值的影响：这种影响主要是由pH与分配系数的关系所决定的。
弱酸与弱碱的解离度受pH影响很大，解离度越大，极性越强，极性强的物质在两相溶剂中分配时，偏向于极性强的一相，这样，改变pH就会同时改变分配系数，从而使Rf也会相应变化。
在氨基酸的层析法中，改变溶剂的pH，使酸性和碱性氨基酸的Rf值变动较大，而中性氨基酸的Rf值变动较小。
在正丁醇中加甲酸，可使酸性氨基酸的极性降低，从而使Rf值变大，而使碱性氨基酸的Rf变小。
反之，如在正丁醇中加氨，可使天冬氨酸和谷氨酸的Rf值变小，而使赖氨酸、精氨酸等碱性氨基酸的Rf值变大。
4. 滤纸对Rf值的影响：滤纸本身的pH及含水量对Rf值的影响很大，所以不同的滤纸得到不同的Rf值及不同的斑点形状。
纸上含水量的多少随溶剂与纸对水的亲和力的大小而异，质地不均一的滤纸常使溶剂扩展不一致，随着纤维的纹理流动紊乱，另一方面纸的含水量不均一，也不能得到理想的分离效果。
5. 温度对Rf值的影响：Rf值的重现性与恒温情况的好坏有密切关系。
温度对Rf值的影响主要是因为溶质在固体相与流动相之间的分配随温度的变化而不同。
随各溶剂组分的粘度和表面张力的不同其蒸发能力也不同，因此有些溶剂系统对温度的敏感程度强些，有些则差些。
敏感程度强的对温度的要求就严格，敏感程度差的对温度的要求就不太严格。
温度改变使溶剂系统中的溶解度改变，所以Rf值也改变。
一般层析展层是在恒温室中进行的，室温可在20℃至40℃，温度改变不超过±0.5℃。
无色物质的层析图谱可用光谱法(如核苷酸类物质用紫外光照射)或显色法鉴定。
氨基酸纸上层析图谱常用的显色剂有茚三酮、吲哚醌。
本实验采用茚三酮为显色剂。
茚三酮显色反应受温度、pH，时间影响较大。
如果要使结果重复，必须严格控制上述条件。
样品中如含有大量盐酸会使氨基酸不显出颜色。
样品中含大量盐时显色点上会出现白斑，空气中其它的杂质如氨，硫化氢或酚等皆会影响显色结果。
铜离子可以与氨基酸-茚三酮显色物形成络合物，颜色较稳定，用硫酸铜乙醇溶液洗脱层析后的显色斑点，可以通过比色法定量测定氨基酸含量。
由于纸上层析设备条件较简单，操作比较简便，并可以分离微量样品，因此纸层析方法已成为生化分析和研究的主要方法之一，广泛应用于氨基酸、肽、核苷酸，糖、维生素以及脂肪酸等的分离鉴定。
操作步骤标准氨基酸纸上层析(单向上行层析)滤纸：选用国产新华1号滤纸(若有较多的样品需在纸上分离，可采用新华3号滤纸)，戴上橡皮手套，将滤纸裁剪成28cm×28cm，在距纸边2cm处，用铅笔轻轻划一条线，于线上每隔适当距离画一小圆圈作为点样处，圈直径不超过0.5cm。
点样：点样要合适，样品点的太浓，斑点易扩散或拉长，以致分离不清，氨基酸的点样量以每种氨基酸含5~20μg为宜，将准备好的滤纸平铺在实验台上，用点样管(也可用血色素管代替)吸取氨基酸样品10μg(1μg/μL)，与滤纸垂直方向轻轻碰触点样处的中心，这时样品就自动流出。
点样的扩散直径控制在0.5cm之内，点样过程中必须在第一滴样品干后再点第二滴，为使样品加速干燥，可使用吹风机吹干。
记下点样位置(标样及混合样)。
将点好样品的滤纸两侧比齐，用线缝好，揉成筒状。
注意缝线处纸的两边不要接触。
避免由于毛细现象使溶剂沿两边移动特别快而造成溶剂前沿不齐，影响Rf值。
展层及显色：配制酸性溶剂系统(20 ml/份)：正丁醇：80%甲酸：水=15:3:2(体积比)，加入茚三酮显色液并混匀。
将揉成圆筒状的滤纸放入培养皿内(注意滤纸不要碰皿壁)，盖好钟罩进行展层(60~90 min)，当溶剂展层至距离滤纸上沿约1cm时，取出滤纸，立即用铅笔标出溶剂前沿位置，置烘箱烘干至显色。
标准氨基酸Rf值的计算：用尺测量显色斑点的中心与原点(点样中心)之间的距离和原点到溶剂前沿的距离，求出此值，即得某特定氨基酸的Rf值。
依据各标准氨基酸的层析位置推断混合样品中含有哪些成份。
注意事项：(1)使用茚三酮显色法时应在整个层析操作中避免手直接接触层析纸，因为手上常常有少量含氮物质，显色时亦呈现紫色斑点而污染层析结果，因此操作时应戴橡皮手套或指套。
同时也要防止空气中的氨。
(2)为了鉴定未知样品中某几种氨基酸的存在，仅用一种溶剂系统展层通常是不够的。
一船应采用2~3种溶剂系统展层，显色后再分别与这些溶剂系统的标准氨基酸图谱比较以相互印证，才能作出比较确切的结论。
试剂和器材试剂1. 若干种氨基酸标准液(1mg/mL)2. 氨基酸混合液(每种氨基酸500mg/mL)3. 0.5%茚三酮丙酮溶液(显色)4. 正丁醇(需重蒸，沸程：116~120℃)。
5. 80%甲酸器材新华滤纸培养皿(直径115mm) 电热鼓风干燥箱吹风机点样管针、线、尺橡皮手套钟罩思考题1. 为什么在展层时有时用一种溶剂系统，而有时用两种溶剂系统?2. 酸性溶剂系统(或碱性溶剂系统)对氨基酸极性基团的解离有何影响?3. 滤纸上点上1μl l0.02mol/L 的甘氨酸(分子量=75)溶液，请问实际上点了多少微克的氨基酸?4. 该实验中有哪些因素可能会影响到氨基酸的层析效果？附1：分配层析原理αA = 1 αB = 1/31st次分配2nd次分配3rd次分配显然，分配系数愈小(流动相溶解度愈大)则移动愈快，反之亦然附2：层析图谱R f = X/Y YX1 X2。