氨基酸的分离鉴定--纸层析法
氨基酸的鉴定(纸层析法)
氨基酸的鉴定(纸层析法)1、掌握纸层析法的基本原理2、通过对氨基酸的分离，掌握纸层析的操作方法并学会分析未知样品中的氨基酸组分。
实验原理：1、层析法又称色谱法(Chromatography)，是一种物理的分离方法。
利用混合物中各组分物理化学性质的差异(如吸附办、分子形状及大小、分子亲和力、分配系数等)，使各组分以不同程度分布在固定相和流动相两相中，并使各组分以不同速度移动，从而得到有效的分离。
操作方式: 纸层析、薄层层析、柱层析等。
分离机理: 分配层析、吸附层析、离子交换层析、凝胶层析、亲和层析等。
2、纸层析法是用滤纸作为情性支持物的分配层析法，展层溶剂由有机溶剂和水组成。
滤纸纤维上的羟基具有亲水性，在滤纸上水就被吸附在纤维素的纤维之间形成固定相。
当有机溶剂(流动相)沿纸流动经过层析点时，层析点上溶质就在水相和有机相之间不断进行分配。
由于溶质中各组分的分配系数不同，移动速率也不同，因而可以彼此分开。
物质被分离后在纸层析图谱上的移动速率用Rf值来表示：3、在一定条件下，物质的Rf值是常数。
Rf值的大小与物质的结构、性质、溶剂系统、层析滤纸的质量和层析温度等因素有关。
4、本实验利用纸层析法分离氨基酸，利用茚三酮反应将氨基酸层析点显色来鉴定氨基酸的种类。
试剂：1、酸性展层剂正丁醇：88%甲酸:水=15:3:2<V/V>2、显色储备液：0、4mol/L茚三酮-异丙醇:甲酸:水=20:1:5<V/V>3、标准氨基酸溶液(6mg/ml,苯丙氨酸Phe、甘氨酸Gly、脯氨酸Pro、组氨酸His)4、未知样品液：上述4种氨基酸中的一种或几种混合液(每组任选一个样品)实验器材：1、滤纸2、烧杯3、剪刀4、毛细管5、层析缸6、微量注射器7、电吹风8、保鲜膜操作方法：1、点样1、量取30ml层析溶剂、1ml显色贮备液于层析缸中，混匀密闭，静置。
（展层缸洗净后应除去多余的水，否则会影响展层溶剂的比例而影响展层）2、戴好手套，在桌上铺好一层保鲜膜。
氨基酸的分离鉴定纸层析法
氨基酸的分离鉴定纸层析法引言：氨基酸是构成蛋白质的基本组成单元，对于生物体的正常生理功能至关重要。
因此，准确地分离鉴定氨基酸成分对于研究蛋白质结构和功能具有重要意义。
纸层析法是一种简单而有效的分离和鉴定氨基酸的方法。
本文将介绍氨基酸的分离鉴定纸层析法并探讨其应用。
一、纸层析法的原理纸层析法是利用气相平衡原理进行物质分离的一种方法，其原理是根据物质在纸上各组分的相对亲疏性，通过运动距离的差异来分离物质。
在氨基酸的分离鉴定中，纸层析法通过将待测氨基酸溶液滴于纸上，然后将纸立起来，将纸的下端浸入相应的溶剂中，使得溶剂上升，通过毛细作用将氨基酸上提，最终实现氨基酸的分离和鉴定。
二、纸层析法的步骤1. 准备工作：制备纸层析板和显色剂。
2. 样品处理：将待测氨基酸溶解于适量的溶剂中，使其浓度适宜，然后滴于纸层析板上。
3. 运行纸层析：将纸层析板立起，纸的下端浸入相应的溶剂中，待溶剂上升到一定高度后，取出纸层析板。
4. 显色：将纸层析板放置于显色剂中，通过氨基酸与显色剂的反应，使得氨基酸在纸上显色。
5. 结果鉴定：根据显色的位置、颜色和强度等特征，对氨基酸进行鉴定和定量分析。
三、纸层析法的应用1. 氨基酸组成分析：纸层析法可用于分析蛋白质中氨基酸的组成，从而揭示蛋白质的结构和功能。
2. 质量控制：纸层析法可用于对食品、药品等中氨基酸含量的快速检测，保证产品质量和安全性。
3. 生物体内氨基酸代谢研究：纸层析法可用于研究生物体内氨基酸的代谢途径和代谢产物。
四、纸层析法的优缺点纸层析法作为一种常用的分离和鉴定氨基酸的方法，具有以下优点：1. 简单易行：操作简单，不需要复杂的仪器设备，成本低廉。
2. 分离效果好：对于氨基酸的分离效果较好，可以得到较为准确的结果。
3. 易于观察：通过显色剂的反应，可以直观地观察到氨基酸在纸上的分离和鉴定结果。
然而，纸层析法也存在一些缺点：1. 分离效果有限：对于某些结构相似的氨基酸，纸层析法的分离效果不佳，难以实现准确鉴定。
1、氨基酸的分离鉴定--纸层析法
实验一：氨基酸的分离鉴定--纸层析法一、目的：通过氨基酸的分离，学习纸层析法的基本原理及操作方法。
二、原理：层析法也叫色谱法，是一种物理分离方法，它是利用混合物中各组分的物理、化学性质的差异，使各组分以不同的程度分布在两个相中，其中一个相为固定相，另一个相则流过此固定相（称流动相）并使各组分以不同的速度移动从而达到分离。
层析法是近代生物化学最常用的分析方法之一，运用这种方法可以分离性质极为相似而用一般化学方法难以分离的各种化合物。
如各种氨基酸、核苷酸、糖、蛋白质等。
层析法有许多种类，根据分离所依据的理化性质不同，可分为吸附层析、分配层析、离子交换层析等。
纸层析是生物化学上分离、鉴定氨基酸混合物的常用技术，可用于蛋白质的氨基酸成分的定性鉴定和定量测定；也是定性或定量测定多肽、核酸碱基、糖、有机酸、维生素、抗生素等物质的一中分离分析工具。
纸层析属于分配层析法。
分配层析法是一种连续抽提法，利用不同的物质在两个互不相溶的溶剂中的分配系数的不同而得到分离。
纸层析以滤纸作为惰性支持物，滤纸纤维素上的羟基具有亲水性，能吸附一层水，把吸附在滤纸上的水作为固定相，展层用的有机溶剂为流动相。
水被吸附在纤维素的纤维之间形成固定相：由于纤维素上的羟基具有亲水性，和水以氢键相连，使这部分水不易扩散，所以能与跟水混合的溶剂仍然形成类似不相混合的两相。
当有机相沿纸流动经过层析点时，层析点上的溶质就在水相和有机相之间进行分配，有一部分溶质离开原点随有机相而进入无溶质的区域，这时，又重新分配，一部分溶质从有机相进入水相。
当有机相不断流动时，溶质就沿着有机相流动的方向移动，不断分配。
溶质中各组分的分配系数不同，移动速率也不同，因而可以彼此分开。
纸上层析法的一般操作是将混合物点到纸上，干后让溶剂从有样品的一端经毛细作用流到纸的另一端。
在密闭的容器中层析溶剂沿滤纸的一个方向反复抽提，由于混合氨基酸在两相中的分配系数（当把一种物质在两种不相溶的溶剂中振荡时，它将在这两相中不均匀分配。
实验七 氨基酸的分离鉴定
实验七氨基酸的分离鉴定——纸层析法一、目的通过氨基酸的分离，学习纸层析法的基本原理及操作方法。
二、原理纸层析法是用滤纸作为惰性支持物的分配层析法，它是利用不同的氨基酸在展层溶剂中的分配系数不同而得以分离的一种方法。
惰性支持物是新华一号滤纸，其上含有很多的羟基，与水有较强的亲和力因此把它看成是含有静止水相的惰性支持物。
水相因此称为静止相（固定相），有机溶剂称为流动相。
展层溶剂由两个互不相溶的有机溶剂和水组成，它们互相混合时便分成两相：一相是以水饱和了的有机相，另一相是以有机溶剂饱和了的水相。
分配系数(α)＝溶质在固定相的浓度/溶质在流动相的浓度。
当用滤纸进行分配层析时，流动相流经支持物时与固定相之间连续抽提，使氨基酸在两相之间不断分配而得以分离。
不同的氨基酸在一定的条件下，有其一定的Rf值，故可根据Rf值定性鉴定氨基酸，但通常用已知的标准氨基酸层析作对照，本实验就是如此。
●纸层析法是用滤纸作为惰性支持物的分配层析法。
●层析溶剂由有机溶剂和水组成●物质被分离后在纸层析图谱上的位置是用Rf值（比移值）来表示的：Rf=原点到层析点中心的距离/原点到溶剂前沿的距离在一定的条件下某种物质的Rf值是常数。
Rf值的大小与物质的结构、性质、溶剂系统；层析滤纸的质量和层析温度等因素有关。
本实验利用纸层析法分离氨基酸。
三、材料与方法（1）、材料：层析缸；毛细管；喷雾器；培养皿；层析滤纸；正丁醇；冰醋酸；分液漏斗；烧杯；培养皿；赖氨酸；脯氨酸；氨酸；苯丙氨酸；亮氨酸；茚三酮（2）操作步骤1. 配置层析液置于密闭的层析缸中。
2．准备滤纸：取层析滤纸一张。
在纸的一端距边缘2cm处用铅笔划一直线，在直线上每间隔2cm做一记号，标出5个原点。
3．点样：用毛细管将各氨基酸样品点在5个原点上，用量10～20μl，每点在纸上扩散的直径，最大不超过3 mm，边点样边用电吹风吹干，越小越好。
干后再点一次。
4．扩展用线将滤纸缝成筒状，纸的两边不能接触。
氨基酸纸层析法
氨基酸纸层析法氨基酸纸层析法（paper chromatography of amino acids）是一种常用的分离和鉴定氨基酸的方法。
本文将详细介绍氨基酸纸层析法的原理、步骤、实验条件和数据处理方法等内容，以帮助读者更好地了解并应用这一实验技术。
一、氨基酸纸层析法的原理氨基酸纸层析法是利用氨基酸在纸上的分布系数和溶剂的渗透速度差异进行分离的方法。
其原理是在一根滤纸条上画上水平的线，将待测的氨基酸溶液直接点于纸条上，待溶液中的氨基酸离子在滤纸上沿渗透液前进，不同氨基酸在滤纸上的迁移速度不同，从而实现氨基酸的分离和测定。
二、氨基酸纸层析法的步骤1. 实验前准备（1）准备氨基酸样品，将其溶解在适当的溶剂中，并使用pH 计调节至适当的酸碱度。
（2）准备滤纸条，按照实验需要确定滤纸的宽度和长度。
（3）准备层析槽，将槽中的溶剂预先与上盖采光纸取代，避免有光照射到。
2. 进行层析实验（1）在滤纸条上绘制水平基线，并将标记的点分开，便于后续氨基酸的测定。
（2）将氨基酸溶液直接点于滤纸条上，点的位置要尽量靠近基线，以避免扩散的影响。
（3）将纸条的一端浸入含有适当溶剂的层析槽中，保持溶剂的面平稳。
（4）待溶液中的氨基酸在滤纸上渗透，不同氨基酸迁移的距离不同，最终在纸条上形成清晰的色斑。
（5）将纸条取出，用热风干燥，然后在紫外灯下进行观察和记录。
3. 数据处理将滤纸上的色斑分别用铅笔勾画出来，并测量它们与基线之间的距离。
然后，根据距离之间的比例关系来计算氨基酸在纸上的迁移速度，并与标准曲线进行比较，从而得出待测氨基酸的浓度。
三、氨基酸纸层析法的实验条件1. 溶剂体系常用的溶剂体系有正丙醇/ 乙酸/水 = 4:1:5、正丙醇/氨水/水 = 70:2:25等，需要根据实验需要确定溶剂的组成和比例。
2. 滤纸条的准备常用的滤纸有菱形滤纸和圆形滤纸，需要根据所需分离的氨基酸种类和数量决定滤纸的大小。
3. 实验条件实验应在干燥、通风的环境中进行，避免光照和温度过高。
氨基酸的分离鉴定——纸层析
氨基酸的分离鉴定——纸层析氨基酸是构成蛋白质的基本单元，其在生物体内的作用极为重要。
因此对氨基酸的分离和鉴定具有重要的研究意义。
纸层析是一种常用于分离和鉴定氨基酸的方法。
其原理是利用氨基酸在纸层析板上的运动速度不同，根据氨基酸之间的相互作用，分离出各种氨基酸。
实验步骤：1. 纸层析板的制备将一张高分子量纸，如Whatman No.1滤纸，剪成所需要的大小，并用铅笔在纸上画出氨基酸移行的标线。
2. 氨基酸样品的制备将所需的氨基酸样品溶解在适量的水中，浓度应为0.2-2%。
3. 样品的上样将氨基酸溶液利用微量注射器沿着标线往上移行。
在上样后，将纸层析板放在带有盖子的玻璃罩中，罩中放置一些饱和度为70%的异丙醇-水溶液，保持相对湿度为70%，使其充分展开。
5. 鉴定氨基酸将经过分离的氨基酸溶液阴性反应的氨基酸用二乙酰胺-丙酮混合溶液鉴定。
将0.2ml 二乙酰胺-丙酮混合溶液加入几滴氨基酸样品中，加热60℃-80℃，5分钟。
加入0.1ml氯仿，振荡混合，分离出上清液，上清液加入干燥瓶中，用喷雾器喷洒Ninhydrin试剂，加热于热水中1分钟，在冷水中快速降温附着氨基酸的部位呈现紫色。
注：二乙酰胺-丙酮混合溶液的组成为45%二乙酰胺，45％丙酮和10%水。
6. 结果的解释根据氨基酸在纸层析板上的运动速度和比色反应的颜色，确定样品中的氨基酸种类及含量。
优点：纸层析方法简便易行，无需昂贵的仪器设备，适用于小样品分析，能分离不同种类的氨基酸，并且结果清晰，操作简单。
限制：纸层析分离结果受到氢键作用和酸碱度等因素的影响，需要控制好上样的数量和浓度。
此外，纸层析无法分离胶原氨基酸和类似结构的氨基酸，且鉴定结果在颜色和色谱图谱方面有些模糊。
纸层析法—氨基酸的分离与鉴定
纸层析法—氨基酸的分离与鉴定纸层析法——氨基酸的分离与鉴定⼀、实验⽬的1、了解纸层析法的使⽤原理。
2、掌握⽤纸层析法分离蛋⽩质的操作步骤。
⼆、实验原理1、纸层析法是以滤纸作为惰性⽀持物的分配层析⽅法，滤纸上的纤维具有羟基，是亲⽔基团，滤纸吸附⽔作为固定相，其上流经的有机溶剂即展层剂作为流动相。
当展层剂流经固定相时，固定相上的样品由于亲⽔、疏⽔能⼒不同，在两相之间不断分配，疏⽔能⼒强的多溶于流动相，随流动相移动距离较远，亲⽔能⼒强的移动距离则较近。
2、所有的氨基酸的α碳上均连接⼀个氢原⼦和两个亲⽔基团羧基（—COOH）与氨基（—NH2），唯⼀的不同则在于R基团。
因此R基团在氨基酸的亲⽔疏⽔能⼒对⽐中起到了决定性的作⽤。
本实验采⽤丙氨酸，苯丙氨酸，天冬氨酸，其R基团分别是—CH3，—CH2—C6H5，—CH2—COOH，其亲⽔疏⽔能⼒迥异，能在滤纸上明显分开。
3、Rf值表⽰原点中⼼⾄显⾊斑点中⼼的距离与原点中⼼⾄流动相前沿的距离⽐。
在⼀定条件下，Rf值为定值，其影响的因素有物质本⾝的性质，溶剂的性质，PH值，温度，滤纸的性质等等，本实验不予探究。
在测量原点中⼼⾄显⾊斑点中⼼的距离时，由于斑点的形状不规范（近似圆形），所以，⼀般取斑点的重⼼，测量出重⼼与起点的距离即可。
4、显⾊原理：茚三酮在弱碱性溶液中与α—氨基酸共热，引起氨基酸氧化脱氧，脱羧反应，最后茚三酮与反应产物——氨和还原茚三酮发⽣作⽤⽣成紫⾊物质。
三、试剂（⼀）提前配制试剂8*10-3mol/L丙氨酸溶液：精确称取0.356g晶体，溶解后定容到500ml。
8*10-3mol/L苯丙氨酸溶液：精确称取0.661g晶体，溶解后定容到500ml。
8*10-3mol/L天冬氨酸溶液：精确称取0.532g晶体，溶解后定容到500ml。
（将上述三种溶液装于⼩瓶中实验时，每两组共⽤⼀组试剂）正丁醇88%甲酸蒸馏⽔茚三酮晶体注：实验时，以上试剂均为每两组同学共⽤⼀组试剂。
氨基酸的分离鉴定——纸层析法
分配系数：一种溶质在两种互不相溶的溶剂中的溶解达到平衡 时，在两种溶剂中所具有的浓度之比。
固定相：水 流动相：有机溶剂
氨基酸与水含茚三酮的显色反应：
O OH OH O O －CO2 O O RCHO + O O H N O O H NH2 O R N CH2 O OH OH O O O O H N O O O H R N CH H2O R CH COOH + NH2 －2H2O O O R N CHCOOH
氨基酸的分离分析
1、按层析原理分类： 吸附层析、分配层析、离子交换层析、凝胶层析、 亲和层析
2、按操作形式不同分类： 柱层析、纸层析、薄层层析、薄膜层析Βιβλιοθήκη 氨基酸的分离鉴定——纸层析法
【实验目的】 1. 学习氨基酸纸层析法的基本原理 2. 掌握氨基酸纸层析的操作技术 【实验原理】 纸层析法分离氨基酸是根据不同氨基酸在 溶剂系统中的分配系数不同而进行分离的，鉴 别氨基酸是根据不同氨基酸在同一溶剂系统的 比移值不同而进行的。
紫色物质，用于α－氨基酸的比色测定和纸层析显色
【试剂】 扩展剂 :是4份水饱和的正丁醇和1份醋酸 的混合物。 氨基酸溶液:0.5％的赖氨酸、脯氨酸、亮 氨酸溶液及它们的混合液。 显色剂: 0.1％水合茚三酮正丁醇溶液。
【实验步骤】 1. 准备滤纸 2.点样
2cm
3.扩展
4.显色:干燥后均匀喷上显色剂，85℃烘
箱10min.
溶剂前沿
原点
Lys
Pro Leu 混合
5.测量、计算：分别测量X、Y值，计算各氨基酸的Rf值, 鉴定混合氨基酸中的氨基酸种类。
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实验报告 1、实验目的
2、实验原理
3、器材与试剂
4、实验步骤
5、结果与讨论
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实验一：氨基酸的分离鉴定--纸层析法
一、目的：
通过氨基酸的分离，学习纸层析法的基本原理及操作方法。
二、原理：
层析法也叫色谱法，是一种物理分离方法，它是利用混合物中各组分的物理、化学性质的差异，使各组分以不同的程度分布在两个相中，其中一个相为固定相，另一个相则流过此固定相（称流动相）并使各组分以不同的速度移动从而达到分离。
层析法是近代生物化学最常用的分析方法之一，运用这种方法可以分离性质极为相似而用一般化学方法难以分离的各种化合物。
如各种氨基酸、核苷酸、糖、蛋白质等。
层析法有许多种类，根据分离所依据的理化性质不同，可分为吸附层析、分配层析、离子交换层析等。
纸层析是生物化学上分离、鉴定氨基酸混合物的常用技术，可用于蛋白质的氨基酸成分的定性鉴定和定量测定；也是定性或定量测定多肽、核酸碱基、糖、有机酸、维生素、抗生素等物质的一中分离分析工具。
纸层析属于分配层析法。
分配层析法是一种连续抽提法，利用不同的物质在两个互不相溶的溶剂中的分配系数的不同而得到分离。
纸层析以滤纸作为惰性支持物，滤纸纤维素上的羟基具有亲水性，能吸附一层水，把吸附在滤纸上的水作为固定相，展层用的有机溶剂为流动相。
水被吸附在纤维素的纤维之间形成固定相：由于纤维素上的羟基具有亲水性，和水以氢键相连，使这部分水不易扩散，所以能与跟水混合的溶剂仍然形成类似不相混合的两相。
当有机相沿纸流动经过层析点时，层析点上的溶质就在水相和有机相之间进行分配，有一部分溶质离开原点随有机相而进入无溶质的区域，这时，又重新分配，一部分溶质从有机相进入水相。
当有机相不断流动时，溶质就沿着有机相流动的方向移动，不断分配。
溶质中各组分的分配系数不同，移动速率也不同，因而可以彼此分开。
纸上层析法的一般操作是将混合物点到纸上，干后让溶剂从有样品的一端经毛细作用流到纸的另一端。
在密闭的容器中层析溶剂沿滤纸的一个方向反复抽提，由于混合氨基酸在两相中的分配系数（当把一种物质在两种不相溶的溶剂中振荡时，它将在这两相中不均匀分配。
达到平衡时，这种物质在两种溶剂中的浓度之比为一个常数，即所谓的分配常数，用ａ表示）不同，使不同的氨基酸分布在滤纸的不同位置上而得到分离。
一种物质在两种溶剂中的浓度之比是一个常数，也就是分配系数（?）。
分配系数不同：
物质在溶剂I中的浓度
???= ———————————
1 / 4
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中的浓度物质在溶剂IIRf值基本上是常数。
某一种物质在特定的溶剂系统、纸、展层方式、温度、pH等条件下的Rf 值的大小与物质的结构、性质、溶剂系统、纸层析纸的质量（新华一号）和层析温度等因素有关。
物质被分离后在纸层析图谱上的位置Rf：值（比移）来表示原点到层析点中心的距离
Rf = —————————————
原点到溶剂前沿的距离
，引起氨基酸氧化脱氧、脱羧反应，最共热：印三酮在弱酸溶液中与印三酮颜色反应 -氨基酸与印三酮物质（后印三酮与反应产物--氨和还原印三酮（NH3hydrindantin）发生作用，生成紫色利用印三酮显色可以定性鉴定应。
反应形成紫色化合物）用纸层析法或柱层析把各种氨基酸分开后，用分光光度法在570nm定量测定各种氨基酸。
，亮黄色化合物NH3，而直接产生两个亚氨基酸，脯氨基酸和羟脯氨基酸与印三酮反应不释放最大光吸收在440nm。
亮氨酸苯丙氨酸
缬氨酸
（黄色）脯氨酸赖氨酸三、器材；、毛细管（药品是两31、层析缸（两人一组，四组共用一个层析缸）；2、培养皿（两人一组）；组共用一套）；4、喷雾器；5、层析滤纸（新华一号）四、试剂（水饱和的正丁醇和乙酸的混4扩展剂：份水饱和的正丁醇和1；份醋酸的混合物（p.123）1、）合物。
其中被滤纸吸附的水为固定相，正丁醇为流动相，乙酸为层析提供酸性环境。
的赖氨酸、脯氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸溶液及它们的混合液（各2、氨基酸溶液: 0.5% 组分均为0.5%）；3、显色剂：0.1%水合印三酮正丁醇溶液操作：五、厘米厚的扩展剂；、平衡：将盛有平衡溶剂的培养皿放入密闭的层析缸中，倒11处用铅笔划一条直线，在号）：在纸的一端距边缘2~3cm滤纸（新华一号或者2、Whatman-1 Rf值计算的原点；作一记号（如书直线上每隔2cmp.123），共6个记号，这个记号是样品为宜，每点一μ3、点样：用毛细管将各氨基酸样品分别点在这6个位置上，点样量以30~40L次样，用吹风机吹干，然后再点一次；重复点样3~4次。
直径最大不超过注意垂直轻轻接触滤纸，一触即止，每个点在纸上扩散的：点样时毛细管。
3mm扩展：用线将滤纸缝成筒状，纸的两边不能接触（避免由于毛细管现象使溶剂沿两边移动、4。
滤纸直立于培养皿中，点样的一端在下，扩展剂过快而造成溶剂前沿不齐，影响Rf值）自然时取出滤纸，1cm的液面需低于点样线。
待溶剂上升15cm用铅笔描出溶剂前沿界线，干燥或吹风机吹干。
，用显色：用喷雾器均匀喷上0.1%印三酮正丁醇溶液（与水不混溶且挥发性较大的溶剂）、5氨基酸与印三10热风吹干（或烘箱0分钟）5℃烘烤显出个层析斑点（为什么这儿要热风？2 / 4
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酮共热反应显色）。
值。
：计算各种氨基酸的Rf六、结果与分析【注意事项】在条件允许的并尽可能少接触滤纸；取滤纸之前要将手洗干净，防止手上的汗渍污染滤纸，1、情况下也可戴一次性手套拿滤纸。
要将滤纸平放在干净的报纸上，千万不要放在实验台上，以防止
污染。
，否则分离效果不好，并且样品用量过大，会造成3mm）的直径不能超过2、点样点（垂直点样。
立即吹干，然后再点“拖尾”现象；点样一次后：平衡剂起到使纸层析上吸附的溶剂达到饱和，使物质在展开剂和纸层析上吸附平衡剂的作用的溶剂中溶解度不同而分离。
但其共同点都是将点好样品的滤纸固定，下行和环行。
虽然其方式可以不同，展层方式有上行、
让溶剂扩展，层析缸内保持恒定的蒸气压并保持恒温，减少温度波动使溶剂走的不均匀，从而改变。
下行层析适Rf值。
上行层析是比较常用的方法，它的优点是可以在两个方向上进行（双向
层析）Rf值，而只能与标准参考物相比较。
用于一些Rf值接近的混合物。
此时不能测定Rf 值的因素附：影响、物质结构的影响：极性物质易溶于极性溶剂（水）中，非极性物质
易溶于非极性溶剂（有1酸性和碱性氨机溶剂）中，所以物质的极性大小决定了物质在水和有机溶剂之间的分配情况。
例如氨基酸值低于后者。
前者在水（固定相）中分配较多，因此Rf基酸的极性大于中性氨基酸，所以。
的极性愈大，Rf值愈小—基增加，整个分CH亚甲基）是疏水性基团，如果分子中极性基数不变，则——基（—CH22：甘氨 Rf值子的极性降低，因此易溶于有机溶剂（流动相）中，Rf值也随之增加。
例如氨基酸的谷氨酸。
亮氨酸；二羧基氨基酸中，天门冬氨酸〈酸〈丙氨酸〈 Rf值变化。
极性基团的位置不同也会引起值，因此被分开（可以用双向纸Rf纸层析时，由于各个氨基酸在两个溶剂系统中具有不同的值彼此差距比较大，则在同一溶剂系统进行单向Rf层析法）。
当混合物中所含的氨基酸种类较少，
层析即可。
值不同，选择溶剂系统时应该使被分离物质在适Rf2、溶剂的影响：同一种物质在不同溶剂中 0.05才能彼此分开。
之间），并且不同物质的Rf值至少差别为Rf当值范围内（0.05-0.85值随着Rf溶剂的极性大小也影响物质的Rf值，在用与水互溶的脂肪醇作为溶剂时，氨基酸的溶剂碳原子数目的增加而降低。
会影响物质极性基团的解离形式。
对于酸性氨基酸则在酸性时所pH的影响：溶剂系统的3、pH而碱性氨基酸则值较碱性大。
Rf带电荷愈少亲水性愈小，带净电荷比碱性时少。
因此在酸性溶剂中与此相反。
借此性质用酸相和碱相溶剂进行双向层析，可使酸碱性不同的氨基酸达到分离的目的。
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溶剂的pH还可以影响有机溶剂的含水量，溶剂酸碱度大，则含水量高。
对于极性物质来说Rf
值增加，非极性物质则减少。
若pH值不适合，使同种物质有不同解离形式，其Rf值也略有不同，则此物质层析呈带状图谱。
因此溶剂中的酸或碱的含量必须足够，并且层析缸中用酸或碱气体饱和才可以防止上述现象，使物质得到圆点状图谱。
4、滤纸的影响：层析滤纸必须质地均匀、紧密、有一定机械强度，并且杂质较少，如纸中有2+2+2+等金属离子杂质，可与氨基酸形成络合物使层析图谱出现阴影，可用稀酸洗涤滤纸、CuCa、Mg，若有较多样品需要在纸上分离提号）除去之。
一般分析工作可采用新华1号滤纸（或者Whatman 1号滤纸差。
溶剂顺着纸的号（或Whatman 3号）厚纸，但厚纸的分辨率比1纯时则适合采用新华3 纹道扩展速度快，否则速度慢。
、温度和时间的影响：温度不仅影响物质在溶剂中的分配系数，而且影响溶剂相的组成及纤5控制温度相差不超所以层析时最好在恒温室中进行，维素的水合作用。
温度变化对Rf值影响很大，o RfC过±0.5。
当所有条件相同时，氨基酸层析时间短，值则小。
除上述影响因素外，样品中含有盐份和其它杂质以及点样过多均会影响样品的有效分离。
必要时，使用前可将滤纸用缓冲液浸泡或经乙酰化作用进行化学修饰。
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