纸层析法分离氨基酸剖析
氨基酸的分离鉴定―纸层析法
操 作
（单向上行层析法）
1平衡 将盛有平衡溶剂的小烧杯置于密闭的层析缸中。（单相可不做）
2准备滤纸 取层析滤纸(长22 cm、宽14 cm)一张。纸的窄边朝下，距下 端2 cm处用铅笔划一条与底边平行的直线，在此直线上每间隔2cm作 一记号（×）。
3点样 用毛细管将各氨基酸样品分别点在中间5个记号（×）上，吹干后 再点一次。每点在纸上扩散的直径，最大不超过5 mm。 4扩展 用线将滤纸缝成筒状，纸的两边不能接触。用胶带粘住两边。将 盛有约20 mL扩展剂的培养皿迅速置于密闭的层析缸中，并将滤纸直 立于培养皿中(点样的一端在下，扩展剂的液面需低于点样线1 cm)。 待溶剂前沿上升15―20 cm时即取出滤纸，铅笔描出溶剂前沿界线， 自然干燥或用吹风机热风吹干。 5显色 用喷雾器均匀喷上0.1％茚三酮正丁醇溶液，然后置烘箱中烘烤5 分钟(80℃)或用热风吹干即可显出各层析斑点。 6计算各种氨基酸的Rf值。
氨基酸的分离鉴定―纸层析法
目 的
通过氨基酸的分离，学习纸层析法的基本原理及操作方法。
原 理
纸层析法是用滤纸作为惰性支持物的分配层析法。以水（被 滤纸纤维结合）作为固定相，以有机溶剂为流动相，样品 点在滤纸上进行展层，氨基酸在两相中不断分配，因为分 配系数不同，故样品随流动相移动的速率不同，从而被分 开，形成距原点距离不等的层析点。 氨基酸被分离后在纸层析图谱上的位置是用Rf值(比移)来表 示的： Rf = 原点到层析中心的距离 / 原点到溶剂前沿的距离
在一定的条件下某种物质的Rf值是常数。Rf值的大小与物质的结 构、性质、溶剂系统、层析滤纸的质量和层析温度等因素有关。 本实验利用纸层析法分离氨基酸。
器 材
1、层析缸 2、毛细管 3、喷雾器 4、培养皿 5、层析滤纸(新华一号) 6、烘箱 7、铅笔（直尺） 8、裁纸刀 9、胶带 10、分液漏怎样制备扩展剂? 层析缸中 平衡溶剂的作用是什么? 2、何谓Rf值? 影响Rf值的主要因素是什么? 3、分配系数？ 4、讨论AA极性与Rf的关系
实验一纸层析法分离鉴定氨基酸
【三、器材与试剂】
【三、器材与试剂】 器材： 1、层析缸 2、毛细管 3、喷雾器 4、培养皿 5、层析滤纸(新华一号) 试剂： 1、扩展剂 （正丁醇：水：冰醋酸= 4：3：1） 2、显色剂 0.1％茚三酮正丁醇溶液。 3、氨基酸溶液 0.5％的赖氨酸、脯氨酸、缬氨酸、亮氨酸溶液 及它们的混合液
显色： 用喷雾器均匀喷上0。1％茚三酮正丁醇溶液，然后置烘箱中烘烤5分钟(100℃)或用热风吹干即可显出各层析斑点。
计算Rf值
【五、实验结果与分析】
【六、注意事项】
【七、思考题】
1、实验中作为固定相和流动相的物质分别是什么？ 2、Rf值的含义、影响因素？
下次实验 ： 实验二 蛋白质和氨基酸的颜色反应
值 日 生 值 日
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小实验
当滤纸接触到溶剂时，溶液将上升。 滤纸上的小圆点是4种不同的氨基酸的混合物。 看看接下来会发生什么事情…
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可以看出1号氨基酸上升的最高，在滤纸上跑得最快。 而4号氨基酸与滤纸的结合最紧，因此跑的速度比其他的氨基酸慢。
这就是纸色谱法。 对照上图，可知道1-4号的各代表什么氨基酸。 纸色谱法是分离鉴定蛋白质的氨基酸组成的重要工具。
实验一 纸层析法分离鉴定氨基酸
【一、实验目的】
【二、实验原理】
层析技术 是利用混合物中各组分的物理化学性质的差别，使各组分以不同程度分布在两相中，其中一相为固定相，另一相流过此相称作流动相，并使各组分以不同速度移动，从而达到分离的目的。 可分离物质 糖类、有机酸、氨基酸、核苷等
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固定相 在层析中起分离作用而不随层析过程移动的物质。如纸层析中固定相是滤纸纤维中结合的水。固定相被看成是样品移动的阻力。
纸层析法—氨基酸的分离与鉴定
纸层析法—氨基酸的分离与鉴定纸层析法——氨基酸的分离与鉴定⼀、实验⽬的1、了解纸层析法的使⽤原理。
2、掌握⽤纸层析法分离蛋⽩质的操作步骤。
⼆、实验原理1、纸层析法是以滤纸作为惰性⽀持物的分配层析⽅法，滤纸上的纤维具有羟基，是亲⽔基团，滤纸吸附⽔作为固定相，其上流经的有机溶剂即展层剂作为流动相。
当展层剂流经固定相时，固定相上的样品由于亲⽔、疏⽔能⼒不同，在两相之间不断分配，疏⽔能⼒强的多溶于流动相，随流动相移动距离较远，亲⽔能⼒强的移动距离则较近。
2、所有的氨基酸的α碳上均连接⼀个氢原⼦和两个亲⽔基团羧基（—COOH）与氨基（—NH2），唯⼀的不同则在于R基团。
因此R基团在氨基酸的亲⽔疏⽔能⼒对⽐中起到了决定性的作⽤。
本实验采⽤丙氨酸，苯丙氨酸，天冬氨酸，其R基团分别是—CH3，—CH2—C6H5，—CH2—COOH，其亲⽔疏⽔能⼒迥异，能在滤纸上明显分开。
3、Rf值表⽰原点中⼼⾄显⾊斑点中⼼的距离与原点中⼼⾄流动相前沿的距离⽐。
在⼀定条件下，Rf值为定值，其影响的因素有物质本⾝的性质，溶剂的性质，PH值，温度，滤纸的性质等等，本实验不予探究。
在测量原点中⼼⾄显⾊斑点中⼼的距离时，由于斑点的形状不规范（近似圆形），所以，⼀般取斑点的重⼼，测量出重⼼与起点的距离即可。
4、显⾊原理：茚三酮在弱碱性溶液中与α—氨基酸共热，引起氨基酸氧化脱氧，脱羧反应，最后茚三酮与反应产物——氨和还原茚三酮发⽣作⽤⽣成紫⾊物质。
三、试剂（⼀）提前配制试剂8*10-3mol/L丙氨酸溶液：精确称取0.356g晶体，溶解后定容到500ml。
8*10-3mol/L苯丙氨酸溶液：精确称取0.661g晶体，溶解后定容到500ml。
8*10-3mol/L天冬氨酸溶液：精确称取0.532g晶体，溶解后定容到500ml。
（将上述三种溶液装于⼩瓶中实验时，每两组共⽤⼀组试剂）正丁醇88%甲酸蒸馏⽔茚三酮晶体注：实验时，以上试剂均为每两组同学共⽤⼀组试剂。
氨基酸的分离鉴定——纸层析法
分配系数：一种溶质在两种互不相溶的溶剂中的溶解达到平衡 时，在两种溶剂中所具有的浓度之比。
固定相：水 流动相：有机溶剂
氨基酸与水含茚三酮的显色反应：
O OH OH O O －CO2 O O RCHO + O O H N O O H NH2 O R N CH2 O OH OH O O O O H N O O O H R N CH H2O R CH COOH + NH2 －2H2O O O R N CHCOOH
氨基酸的分离分析
1、按层析原理分类： 吸附层析、分配层析、离子交换层析、凝胶层析、 亲和层析
2、按操作形式不同分类： 柱层析、纸层析、薄层层析、薄膜层析Βιβλιοθήκη 氨基酸的分离鉴定——纸层析法
【实验目的】 1. 学习氨基酸纸层析法的基本原理 2. 掌握氨基酸纸层析的操作技术 【实验原理】 纸层析法分离氨基酸是根据不同氨基酸在 溶剂系统中的分配系数不同而进行分离的，鉴 别氨基酸是根据不同氨基酸在同一溶剂系统的 比移值不同而进行的。
紫色物质，用于α－氨基酸的比色测定和纸层析显色
【试剂】 扩展剂 :是4份水饱和的正丁醇和1份醋酸 的混合物。 氨基酸溶液:0.5％的赖氨酸、脯氨酸、亮 氨酸溶液及它们的混合液。 显色剂: 0.1％水合茚三酮正丁醇溶液。
【实验步骤】 1. 准备滤纸 2.点样
2cm
3.扩展
4.显色:干燥后均匀喷上显色剂，85℃烘
箱10min.
溶剂前沿
原点
Lys
Pro Leu 混合
5.测量、计算：分别测量X、Y值，计算各氨基酸的Rf值, 鉴定混合氨基酸中的氨基酸种类。
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实验报告 1、实验目的
2、实验原理
3、器材与试剂
4、实验步骤
5、结果与讨论
生物化学实验二——纸层析法分离氨基酸
生物化学实验二——纸层析法分离氨基酸实验二氨基酸的分离鉴定——纸层析法一、实验目的1、掌握氨基酸纸层析的方法和原理，学会分析待测样品的氨基酸成分。
2、学习用纸层析法分离、鉴定氨基酸二、实验原理⑴纸层析是以滤纸为惰性支持物的分配层析。
滤纸纤维上的羟基具有亲水性，吸附一层水作为固定相，有机溶剂为流动相。
当有机相流经固定相时，物质在两相间不断分配而得到分离。
⑵溶质在滤纸上的移动速度用Rf值表示：⑶Rf=原点到层析斑点中心的距离/原点到溶剂前沿的距离⑷在一定的条件下某种物质的Rf值是常数。
Rf值的大小与物质的结构、性质、溶剂系统、层析滤纸的质量和层析温度等因素有关。
本实验利用纸层析法分离氨基酸。
三、实验器材a)大烧杯（5000mL）：1只/组b)毛细管。
c)喷雾器：公用。
d)培养皿：1只/组。
e)层析滤纸（长22cm、宽14cm的新华一号滤纸）：1张/组。
f)直尺、铅笔：自备。
g)电吹风：1只/组。
h)托盘、针、白线：1套/组。
i)手套：1双/组。
j)塑料薄膜：公用。
k)小烧杯：50mL，1只/组。
四、实验试剂（1）扩展剂：将4体积正丁醇和1体积冰醋酸放入分液漏斗中，与5体积水混合，充分振荡，静置后分层，弃去下层水层。
（2）氨基酸溶液：0.5%的已知氨基酸溶液3种（亮氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸、缬氨酸，脯氨酸氨酸），0.5%的待测氨基酸液1种。
（3）显色剂：0.1%水合茚三酮正丁醇溶液。
五、实验操作检查培养皿是否干燥、洁净；若否，将其洗净并置于干燥箱内120℃烘干。
（1）平衡：剪一大块塑料薄膜铺在桌面上，将层析缸或大烧杯到置于塑料薄膜上，再把盛有约20mL展层溶液的小烧杯置于倒置的层析缸或大烧杯中，用塑料薄膜密封起来，平衡20min。
（2）规划：带上手套，取宽约14cm、高约22cm的层析滤纸一张。
在纸的下端距边缘2cm 处轻轻用铅笔划一条平行于底边的直线A，在直线上做4个记号，记号之间间隔2cm，这就是原点的位置。
试验二氨基酸的分离鉴定——纸层析法
=
原点到层析点中心的距 离 原点到溶剂前沿的距离
Kd↑，则Rf↓ [正向色谱]固定相的极性大于流动相的极性，非极性或极性小的溶质分子移动速度快。
[反向色谱]
小于
，极性大的溶质分子移动速度快。
影响 Rf 值的主要因素： 1. 物质结构的影响。物质极性大小决定其在水和有机溶剂中的分配情况，酸性与碱性AA的极 性大，在水（固定相）中分配多，Rf值低。另—CH2—是疏水基团，—CH2—长则极性降低。 2. 溶质与溶剂间的相互作用。溶质与溶剂间若形成氢键，对分配系数影响大，水大多都能与 溶质形成氢键，对溶质的引力就大。 3. PH 值对 Rf 的影响。PH 值变化影响溶质解离度，极性强的物质在溶剂中偏极性强的一相。 4. 滤纸的影响。 5. 温度的影响。
[分配系数]是指在一定的条件下，某种组分在固定相和流动相中含量（浓度）的比值，常用 K
来表示。分配系数是层析中分离纯化物质的主要依据。
kd
=
Cs Cm
Cs：固定相中的浓度；Cm：流动相中的浓度。
[迁移率]（或比移值）是指在一定条件下，在相同的时间内某一组分在固定相移动的距离与流
动相本身移动的距离之比值。常用 Rf 来表示。 R f
层析法各种各样，但基本原理是一致的。它是利用混合物中各组分理化性质（分子形状和大小、 带电状态、溶解度、吸附能力、分配系数、分子极性以及分子的亲和力等）的差别，使各组分以不 同程度分布在两相中，其中一相为固定的（称为固定相），另一相则流过此固定相（称为流动相）， 造成流动相对固定相作单向相对运动，流动相推动样品中各组分经固定相向前迁移，使各组分迁移 速度不同，而对物质进行分离的方法。固定相可以是固体、液体或一种固体和一种液体的混合物， 而流动相可以是一种液体或一种气体。
氨基酸的纸层析实验报告
氨基酸的纸层析实验报告氨基酸的纸层析实验报告引言：氨基酸是构成蛋白质的基本组成单元，对于研究蛋白质结构和功能具有重要意义。
纸层析是一种简单而有效的分离技术，可用于分离和鉴定氨基酸。
本实验旨在通过纸层析技术对氨基酸进行分离和鉴定，进一步了解氨基酸的性质和特点。
实验材料和方法：材料：苯酚、丙酮、氨基酸溶液（酪氨酸、赖氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丝氨酸）方法：1. 准备纸层析板：在纸层析板的一端绘制一个起点线，距离底部约2 cm。
2. 在起点线上分别滴加不同氨基酸溶液，每个溶液滴加约1 cm。
3. 将纸层析板放入含有苯酚和丙酮的密闭容器中，使其与溶剂接触，但不要浸泡。
4. 等待溶剂前进至纸层析板的顶端，取出纸层析板并迅速标记出溶剂前进的距离。
5. 用紫外灯照射纸层析板，观察各氨基酸的色谱带。
结果与讨论：通过实验，我们成功地进行了氨基酸的纸层析分离和鉴定。
根据实验结果，不同氨基酸在纸层析板上产生了不同的色谱带，表明它们在溶剂中的迁移速度和亲和性不同。
首先，酪氨酸的色谱带位于起点线上方最高位置，表明酪氨酸与溶剂的亲和性最低，迁移速度最慢。
这可能是由于酪氨酸分子结构中的芳香环和羟基团导致了其与溶剂的较弱相互作用。
其次，赖氨酸和谷氨酸的色谱带位于起点线上方，但位置较低。
这表明赖氨酸和谷氨酸与溶剂的亲和性较高，迁移速度较快。
赖氨酸和谷氨酸分子中的带正电荷的氨基团可能与溶剂中的负电荷相互作用，加快了它们的迁移速度。
甘氨酸和丝氨酸的色谱带位于起点线以下，迁移速度最快。
这表明甘氨酸和丝氨酸与溶剂的亲和性最高，迁移速度最快。
甘氨酸和丝氨酸分子中的带负电荷的羧基可能与溶剂中的正电荷相互作用，加快了它们的迁移速度。
总结：通过纸层析实验，我们成功地分离和鉴定了不同氨基酸。
实验结果表明，氨基酸的迁移速度和亲和性与其分子结构密切相关。
进一步研究氨基酸的纸层析技术可以帮助我们更好地了解蛋白质的结构和功能，对于生物化学和生物医学领域的研究具有重要意义。
纸层析法分离氨基酸实验报告(1)
纸层析法分离氨基酸实验报告(1)纸层析法是一种快速、便捷、经济的分离和鉴定化合物的方法。
在这里，我们将介绍纸层析法在氨基酸分离中的应用，同时，提出实验过程中需要注意的细节。
实验目的1. 了解和掌握纸层析法在氨基酸分析中的应用。
2. 学习氨基酸的色谱鉴定。
实验原理纸层析法是一种基于物质在不同极性溶液中移动速度不同而实现分离的方法。
纸层析的原理是将待分离样品沿贴在纸上的渗透材料上上升，该渗透材料通常是纤维素。
当样品上升时，发生两种类型的分离：1）酸、碱、盐等物质与渗透剂发生物理吸附力，进而移动; 2）不同的物质在材料和溶液之间的相互作用下以不同的速度前进。
氨基酸是由天然界普遍存在的氨基酸和其他异构体的混合物组成的，这些异构体具有不同的极性特性，氨基酸的分离需要一种特定的方法，这就是纸层析法。
在纸层析法中，要利用恰当的溶剂来增加各种氨基酸分子之间的区别，从而分离它们并定性/定量分析。
实验装置实验物品包括升华氨基酸、滤纸、碱性氨基酸标准溶液、质谱仪。
实验步骤1. 制备样品：对待分离氨基酸进行粉化，加入几滴蒸馏水，制成粉末状。
2. 制备纸层析用的渗透剂：将纸条浸泡在渗透剂中，然后切割和剥离一小块以浸泡的材料，留一侧作为上升的起点。
3. 制备样品溶液：在碱性氨基酸标准溶液中加入少量样品，将其混合均匀。
4. 在纸的距下端约2.5cm处用笔记下起点，并轻轻地在此处涂上约1ml的样品溶液。
5. 将纸置于相对湿度为30%，温度为25°C的巢式箱中，进行分离过程。
6. 分离后，用视觉方法透过质谱仪观察和记录样品的颜色和位置。
7. 在纸条上标记出不同的氨基酸，用质谱仪确认分离结果。
实验结果分析由于各种氨基酸分别具有独特的极性、结构和分析性质，它们在健康纸上的上升率是不同的，因此可以通过观察它们在纸上的移动位置来确定它们的相似性或差异性。
同时，我们可以观察到样品的颜色变化，以进一步确定其成分。
实验注意事项1. 实验中使用的纸条应该是均匀的，没有细节的瑕疵、撕裂或沾污。
氨基酸的分离纸层析法
增加实验次数
综合多种方法
通过增加实验次数，可以降低实验误差， 提高分离效果的可靠性。
可以结合其他分离方法如电泳、高效液相 色谱等，以提高氨基酸的分离效果。
05 结论
纸层析法在氨基酸分离中的应用价值
高效分离
纸层析法能够将氨基酸 进行高效分离，具有操 作简便、分离效果好的
优点。
成本低廉
纸层析法所需材料成本 较低，适合大规模分离 操作，降低了生产成本。
定型方法
选择适当的定型方法，如自然晾干、 加热或使用定型剂等，以固定氨基酸 的位置并保持其稳定性。
04 实验结果分析
分离效果的评价
分离度
通过比较不同氨基酸的迁移距离，可以评估分离效果。分 离度越大，说明氨基酸之间的分离越完全。
分辨率
分辨率是评价纸层析分离效果的重要参数，它反映了氨基 酸在层析图谱中的清晰程度。分辨率越高，层析图谱越清 晰。
02 纸层析法的基本原理
纸层析法的分离原理
纸层析法是一种基于不同物质在固定相和流动相之间分配系数差异的分离技术。 在纸层析法中，固定相是纸上的纤维素，流动相是展开剂。当流动相携带待分离 物质通过固定相时，由于分配系数不同，不同物质在固定相和流动相之间发生分 离。
氨基酸在纸层析法中的分离是基于它们的极性、相对分子质量和其它物理化学性 质的差异。极性较弱的氨基酸在流动相中的溶解度较大，移动较快；极性较强的 氨基酸在固定相中的溶解度较大，移动较慢。
疾病诊断和治疗
某些氨基酸的缺乏或过量与某些 疾病有关，检测氨基酸水平有助 于疾病的诊断和治疗。
纸层析法的简介
定义
应用
纸层析法是一种基于滤纸的层析技术， 用于分离和鉴定混合物中的组分。
纸层析法广泛应用于生物、化学和医 学领域，用于分离和鉴定各种化合物， 如氨基酸、糖类、脂类等。
氨基酸纸层析法
氨基酸纸层析法
氨基酸纸层析法是一种常用的氨基酸分析方法，它基于氨基酸在纸上迁移的速度差异实现氨基酸的分离和定量。
操作步骤如下：
1. 准备纸层析纸和适量的标准氨基酸溶液。
2. 在纸层析纸上绘制起始线，并标记出各个氨基酸的迁移距离标准曲线。
3. 取一定量的样品溶液，通过滴管或毛细管将其点于起始线上，并尽量避免超出纸张边缘。
4. 将纸张悬挂于合适的溶剂中，使溶剂迅速上升到纸张的边缘，不要让样品接触溶剂。
5. 当溶剂前进到一定高度时，取出纸张，晾干并用紫外灯照射。
6. 观察纸上的条带，根据标准曲线确定各个氨基酸的浓度。
氨基酸在纸层析纸上迁移的速度差异主要由以下因素影响：
1. 氨基酸的物理性质，如分子大小、极性和电荷等。
2. 纸层析纸的性质，如吸附性能和孔径大小等。
3. 溶剂体系的选择，如氨基酸与溶剂之间的亲疏性。
氨基酸纸层析法具有操作简便、成本低廉和分离效果好等优点，但由于纸张吸附作用的限制，对于极性和电荷相似的氨基酸分离效果较差。
在实际应用中，常结合其他分析方法使用，以提高分析的准确性和可靠性。
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分配层析
分配层析法是利用不同的物质在两个互不相溶的溶剂中 的分配情况不同而使之得到分离的方法。
分配层析法中不同溶质的分离取决于其在两相 (固定相
和流动相)间分配系数的不同。
分配系数(K)的定义是：
K=溶质在固定相的浓度(CS)/溶质在流动相的浓度(CL)
二、纸层析
(一) 原理
纸上层析实际上是以滤纸纤维的结合水为固定相， 而以有机溶剂(与水不相混溶或部分混溶)作为流动相。 展开时，有机溶剂在滤纸上流动，样品中各物质在两相 之间不断地进行分配。由于各物质有不同的分配系数， 移动速度因此不同，从而达到分离的目的。
(3) 环行法：又称水平法，样品点于圆形滤纸 距圆心1cm左右的环形线(原线)上。滤纸水平放置， 溶剂由滤纸条引向圆心，然后不断向四周水平方向 流动。由于溶剂向圆周方向扩散，所以展开的图谱 呈弧形。用环行法展开时，最好使用无方向性的特 制滤纸。 （4）双向展开法：如果样品组分较多，用一种 溶剂系统（常为酸性）不能将各组分全部分开时， 可将样品点在方形滤纸的一角，用一种溶剂系统展 开后吹干溶剂，将滤纸转动90o后再用另一种溶剂系 统（常为碱性）展开，这称为“双向展开法”。
1、直尺 2、针线（白线） 3、实验报告纸（完成实验报告） 4、电吹风 5、口罩
注意
使用茚三酮显色法，必须在整个层析操作中避免手直
接接触层析纸，因为手上常常有少量含氮物质。显色时它也
呈现紫色斑点。污染了层析结果，因此操作时应戴橡皮手套 或指套。同时也要防止空气中的氨。
纸层析法分离氨基酸
实验目的
1、掌握分配层析的原理，学习氨基酸纸层析 法的操作技术 (包括点样、平衡、展层、显色、 鉴定及定量)。 2、学习未知样品的氨基酸成分(水解、层析及 鉴定)分析的方法。
实验原理
层析法又叫色层分离法、色谱分析法或色谱法。 1944
年应用滤纸作为固定支持物的“纸层析”诞生以来，层析技 术的发展越来越快，五十年代开始，相继出现了气相色谱和 高压液相层析，其它如薄层层析、亲合层析、凝胶层析等也 迅猛发展。层析分离技术操作简便，样品用量可大可小，既 可用于实验室分离分析，又适用于工业生产中产品的分析制 备。现已成为生物化学、分子生物学、生物工程等学科广泛 应用而又必不可少的分析工具之一。
4.pH值
溶剂和样品的pH值会影响物质的解离，从而影响物质的 极性和溶解度，使Rf值改变。溶剂的酸碱度增大则流动相的 含水量增高，使极性物质的Rf值增加；反之则降低。 为了避免或减少pH值对Rf值的影响，可将滤纸和溶剂用 缓冲溶液处理，使之保持一定的pH值。
5.温度
温度能影响物质在两相中的溶解度，即影响分配系数； 也影响滤纸纤维的水合作用，即影响固定相的体积.所以温度 的改变使Rf值变化很大，为此，层析必须在恒温条件下进行。
3.平衡
点样以后展开以前先将滤纸与层析缸用配好的溶液
系统的蒸汽来饱和，这个过程称之为“平衡”。若不经
平衡，滤纸和层析缸未被溶剂蒸汽饱和，在层析过程中， 滤纸会从溶剂中吸收水分，溶剂也会从滤纸表面挥发， 从而改变溶剂系统的组成,严重影响层析效果。平衡一 般在密闭的层析缸内进行。
4.展开
平衡结束后，将滤纸靠样品点的一端浸入溶剂中，溶剂液 面距原线距离约1cm，此时即开始展开。当溶剂前沿到达滤纸另 一端0.5-1cm处时，展开结束，取出滤纸，在溶剂前沿处做一标 记，晾干或用冷风吹干。 按溶剂在滤纸上流动的方向不同，展开有上行、下行和环 行三种方式。 (1) 上行法：将滤纸点样的一端向下浸入溶剂中，溶剂因 毛细管引力的作用从下向上流动。 上行法操作简单，重现性好， 是最常用的展开方法，但展开时间较长。 (2) 下行法：在层析缸上部有一盛展开剂的液槽，将滤纸 点样的一端朝上浸入槽中，溶剂主要靠重力作用自上而下流动。 下行法展开速度快，但Rf值的重现性较差，斑点易扩散。
出待测物的含量。
(3) 面积测量法：实验证明，圆形或椭圆形斑点的面 积与物质含量的对数成正比。所以，可用测量斑点面积的 方法求得物质的含量。
实验材料与试剂
实验试剂
1、氨基酸标准液(1mg/mL)
五种氨基酸是丙氨酸、甘氨酸、谷氨酸,脯氨酸分别配 制成一定浓度的溶液。 2、展开剂是：正丁醇：甲酸：水=15:3:2 正丁醇：水：乙酸=4：1：1)
6.展开方式
同一物质在其他层析条件完全相同的情况下，用不同 的展开方式进行层析时，所得到的Rf 值不相同。用下行法展
开时，Rf值较大；用上行法展开时，Rf值较小；用圆形滤纸
层析时，由于内圈较外圈小，限制了溶剂的流动，Rf值也较 小。
7.样品溶液中杂质
样品溶液中存在杂质时，有时对Rf值有所影响。例如： 氯化钠的存在会影响氨基酸的Rf 值。
张约需25mL。
D、显色：待展层基本结束后, ，置65℃鼓风 箱中10-20min，鼓风保温，滤纸上即显出 紫红色/黄色斑点。
E、Rf值的计算：用尺测量显色斑点的中心与 原点(点样中心)之间的距离和原点到溶剂前
沿的距离，求出此值，即得氨基酸的Rf值。
计算出 5种氨基酸在酸系统中的Rf值。
大家需要带的物品
C、展层：将揉成圆筒状的滤纸放入培养皿内 (注意滤纸不要 碰皿壁)，当溶剂展层至距离纸的上沿约1cm时，取出滤
纸，立即用铅笔标出溶剂前沿位置，晾干，使纸上溶剂自
然挥发，直至除净溶剂。 酸溶剂系统：正丁醇： 80%甲酸：水=15:3:2(体积比)，茚三 酮5ml。温度25℃，时间1h。
注意：使用的溶剂系统需新鲜配制，并要摇匀。展层溶剂每
3、0.2%茚三酮丙酮溶液。
4、氨基酸混合液(每种氨基酸500mg/mL)。
实验器材:
1、滤纸。 2、培养皿(直径115mm)。 3、电热鼓风干燥箱。
4、喷雾器及吹风机。
5、点样管及点样架。
6、针、线、尺。
7、烧杯(50mL)。
实验操作
（一）、标准氨基酸纸上层析
1、单向上行层析
(1)、氨基酸Rf值的测定 A、滤纸：选用国产滤纸，10cm×20cm，在距纸边 2cm处，用铅笔轻轻划一条线，于线上每隔2cm处 画一小圆圈作为点样处，圈直径不超过0.3cm。
B、点样：点样要合适，样品点的太浓，斑点易扩散或拉长，以致分离不 清，氨基酸的点样量以每种氨基酸含 5～20μg为宜，用点样管(也可用 血色素管代替)吸取氨基酸样品10μg(1μg/μL)，与滤纸垂直方向轻轻碰 触点样处的中心，这时样品就自动流出。点样的扩散直径控制在0.3cm 之内，点样过程中必须在第一滴样品干后再点第二滴，为使样品加速干 燥，可用一加热装置(如吹风机)，但要注意温度不可过高，以免氨基酸 破坏，特别是谷氨酰胺破坏，影响定量结果。 将点好样品的滤纸两侧比齐，用线缝好，揉成筒状。注意缝线处纸 的两边不要接触。避免由于毛细管现象使溶剂沿两边移动特别快而造成 溶剂前沿不齐，影响Rf值。
5.显色
为了显示层析斑点位置，可根据物质的性质不同，采 用显色剂显示或紫外光显示。 (1) 显色剂显示： 被分离物质与显色剂生成有颜色的 化合物，显示斑点位置。常用喷雾法 、浸渍法或涂刷法。 (2) 紫外光显示：有些物质有紫外光吸收性质，如核 苷酸类物质。有些物质受紫外光照射会发出荧光，如维生 素B1、B2等，所以可在紫外光照射下观察到被分离物质的斑 点。
2.滤纸
不同滤纸的厚薄程度和纤维松紧度各不相同，因此结合的 水量不一样，两相的体积比也就不同。所以同一种物质在不同 型号的滤纸上进行层析时，所得到的Rf值也不相同。 此外，滤纸上所含的杂质也会影响Rf值。
3.层析所用的溶剂
同一物质在不同的溶剂系统中进行层析时，Rf值不同。所 以溶剂的配制和使用必须严格，才能使Rf值的重现性好。在好 的溶剂系统中被分离物质的Rf值应在0.05-0.85之间，样品中 被分离组分的Rf之差最好大于0.05。 溶剂系统中的试剂若纯度不够，需经过预处理后才能使 用。处理的方法因溶剂的性质而异。常用的处理方法有：酸、 碱抽提，水洗涤，重蒸馏，脱水干燥等
(三) 操作方法 1.样品处理
用作纸层析的样品，应尽可能除杂纯化。调节到一定 的pH值，浓度太低的可用真空浓缩提高浓度，浓度太高则需 稀释。
2.点样
将滤纸裁成适当大小，用铅笔在距边线2cm左右划一直 线(称为原线)，线上每隔2-3cm划一圆点(称为原点)。然后 用点样器(定性分析可用普通毛细管，定量分析需用微量注 射器)轻轻点在原点上。样品点的直径约0.3-0.5cm。点样的 量应根据纸的长短以及样品的性质来决定，一般每一样品的 量为5-30μg。点样一般采用少量多次，每点一次必须用冷 风吹干，然后再点第二次。每次点样的位置应完全重合，否 则会出现斑点畸形现象。
6.定性分析
层析后的斑点显示出来后，计算出各斑点的Rf值，就 可以对物质进行定性。
7.定量分析
对被分离的物质进行定量的方法很多，常用的有： (1) 剪洗比色法：将斑点剪下，用适当的溶剂洗脱后， 通过分光光度计进行比色定量。 (2) 直接比色法：用特制的分光光度计直接测量滤纸 上斑点颜色的浓度，画出曲线，由曲线所包含的面积可求
溶质在滤纸上移动的速率可用Rf值 表示： Rf= X/ Y 式中X：溶质斑点中心的移动距离
Y：溶剂前沿移动的距离
Rf值决定于分配系数。 不同物质的分配系数不同，Rf值也不相同，由 此可以根据Rf值的大小对物质进行定性分析。
(二) 影响Rf值的主要因素 1.物质的结构和极性
物质的结构和分子极性是影响Rf值的主要因素。极性较大 的物质，在水中的溶解度较大，其Rf值就较小，反之亦然。