免疫组化的判断
免疫组化结果判断及常见问题的分析
非特异性染色
总结词
非特异性染色是由于抗体与非目标组织成分的交叉反应导致的。
详细描述
非特异性染色是免疫组化实验中常见的问题，通常是由于抗体与组织中非目标成分的交叉反应。为了减少非特异 性染色，可以尝试降低抗体浓度、增加洗涤步骤或使用阻断剂等方法。
背景染色
总结词
背景染色是由于组织中其他成分的非特异性染色或由于抗体与组织中其他成分的交叉反应导致的。
免疫组化结果判断及常见问题 的分析
目
CONTENCT
录
• 免疫组化基本概念 • 免疫组化结果解读 • 常见问题及解决方法 • 免疫组化在临床上的应用 • 免疫组化技术新进展
01
免疫组化基本概念
定义与原理
定义
免疫组化是一种利用抗原-抗体反应原理，通过标记的抗体在组织 或细胞中检测特定抗原的方法。
免疫组化可以与其他技术如原位杂交、原位PCR等联合应用，以同时检测抗原和 相关基因的表达，提供更全面的分子信息，有助于深入了解疾病的发生发展机制 。
联合应用多种技术可以相互补充，提高检测的敏感性和特异性，为临床诊断和治 疗提供更可靠的依据。
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数字免疫组化技术
数字免疫组化技术是一种基于数字图像分析的免疫组化技术 ，通过高分辨率数字成像系统获取组织切片图像，利用计算 机软件进行图像分析和处理。
数字免疫组化技术能够实现自动化、高通量的组织切片分析 ，提高检测效率，减少人为误差，特别适合大规模临床筛查 和流行病学研究。
免疫组化与其他技术的联合应用
04
免疫组化在临床上的应用
肿瘤诊断与鉴别诊断
肿瘤诊断
免疫组化技术可以检测肿瘤组织中特定抗原 的表达，从而确定肿瘤的性质和来源。通过 对不同肿瘤标志物的检测，有助于医生对肿 瘤进行准确的诊断。
免疫组化结果判断标准
免疫组化结果判断标准免疫组化（Immunohistochemistry，IHC）是一种通过使用特定的抗体来检测组织样本中特定蛋白质的方法。
通过对免疫组化结果进行判断和分析，可以为临床医生提供重要的诊断和预后信息。
在免疫组化结果的判断中，常见的标准有阳性标记、定量分析、判定阴性、强度评分等。
免疫组化结果按照阳性标记分为阴性和阳性。
阳性结果表示目标蛋白质的表达存在，而阴性结果表示目标蛋白质的表达不存在。
在判断免疫组化结果时，需要注意结果的可靠性和准确性。
一般来说，阳性结果需要出现明显的染色反应，在组织样本中产生特定的颜色变化，而阴性结果则需要获得几乎无染色反应的结果。
除了阳性标记外，还可以通过定量分析来判断免疫组化结果。
定量分析可以通过使用计算机软件或图像分析系统，对免疫组化结果图像中的染色强度和染色面积进行计算和量化。
通过定量分析，可以量化目标蛋白质的表达水平，并与其他样本进行比较和分析，从而得出更加客观和可靠的结果。
在免疫组化结果的判断中，还有一种常见的标准是判定阴性。
判定阴性是指使用阴性对照和负对照来确定免疫组化染色的结果是否是阴性。
阴性对照是指在免疫组化实验中使用无目标蛋白质的组织样本或细胞，负对照是指在免疫组化实验中使用无抗体的组织样本或细胞。
通过对阴性对照和负对照的染色结果进行比较和分析，可以确定是否存在非特异性染色或假阳性结果。
除了以上几种标准外，免疫组化结果的判断还可以通过强度评分进行。
强度评分是根据染色的强烈程度对结果进行判断和评分的方法。
一般来说，免疫组化结果的强度可以分为负（0）、弱（1+）、中（2+）和强（3+）四个等级。
这种评分方法可以为临床医生提供蛋白质表达的定量信息，并帮助他们作出更加准确和可靠的诊断和预后判断。
总之，免疫组化结果的判断标准包括阳性标记、定量分析、判定阴性和强度评分等。
通过合理地应用这些标准，可以为临床医生提供重要的蛋白质表达信息，从而指导临床诊断和治疗决策。
免疫组化结果判断标准
免疫组化结果判断标准免疫组化结果判断标准指的是在免疫组化检测中，根据染色结果和特定的标准对检测样本进行判断和解读的规则。
免疫组化是一种常用的实验方法，用于检测组织切片或细胞中特定的蛋白质表达情况。
在免疫组化实验中，通常使用标记有特异性抗体的试剂与目标抗原结合，形成颜色沉积或荧光信号。
免疫组化结果根据检测物的染色程度、强度和分布模式来判断。
以下是一些常见的免疫组化结果判断标准：1. 阳性（Positive）：表示目标抗原在组织或细胞中存在。
阳性结果通常可以观察到明显的染色和强度，其分布模式可能是全细胞膜、核、细胞质等。
2. 阴性（Negative）：表示目标抗原在组织或细胞中不存在。
阴性结果通常观察不到染色或染色非常弱，且不符合阳性的染色模式。
3. 弱阳性（Weak Positive）：染色结果显示为弱的阳性信号，通常比阳性样本的染色强度要低。
4. 血管内内皮细胞阳性（Vascular Endothelial Cell Positive）：此结果表示目标抗原在血管内皮细胞中存在。
5. 炎症细胞阳性（Inflammatory Cell Positive）：表示目标抗原在炎症细胞中存在。
6. 异常强阳性（Aberrantly Strong Positive）：表示目标抗原在组织或细胞中出现异常高的染色强度，超过了正常表达水平。
每种免疫组化实验都具有独特的结果判断标准，这些标准通常由经验丰富的病理学家或专业领域的专家制定和解读。
此外，合适的对照实验和质量控制也是确保免疫组化结果可靠性的重要因素。
总之，免疫组化结果判断标准对于准确解读免疫组化实验结果至关重要。
了解并遵循这些标准可以确保免疫组化实验结果的准确性和可靠性，从而对研究和临床诊断产生重要的参考价值。
met表达 ihc判断标准
met表达 ihc判断标准
c-MET蛋白的过表达情况，主要是通过IHC（免疫组化）来检测。
主流的判断方法分为两种，即H-评分法和临床评分法（即Metmab标准）。
1. H-评分法：根据样本的染色强度（分为0～4分）以及阳性肿瘤细胞所占细胞总数的比例（0～100%）。
二者的乘积为H-评分，其范围为0-400。
H-评分的判断标准是大于200，便可判定为阳性。
2. 临床评分法（Metmab标准）：将肿瘤细胞分为MET高表达和低表达两类。
具体的判断标准如下：
3+：≥50%的肿瘤细胞呈强阳性（即染色强度强，阳性细胞数多）。
2+：≥50%肿瘤细胞呈阳性/弱阳性，且＜50%肿瘤细胞呈强阳性。
1+：≥50%的肿瘤细胞呈弱阳性，且阳性细胞数＜50%。
0：无染色或任何强度的肿瘤细胞数均＜50%。
2+或3+被定义为高表达。
IHC检测c-MET的有效性可能较FISH法能更敏感地筛选出合适靶向治疗的人。
以上信息仅供参考，如有疑问或需要专业检测建议咨询专业医生。
免疫组化的判读标准
免疫组化的判读标准
免疫组化的判定标准如下：
1、做免疫组化之前会设定一个阳性对照，比如ER、PR、HER-2，如果阳性对照阳性、肿瘤阴性，表明肿瘤是真阴性；如果阳性对照阴性，表明检测操作方法可能有误，需要重新检测；
2、抗原表达必须在特定部位，有些免疫组化的定位在细胞膜，有些在细胞质，有些在细胞核，所以在特定部位阳性表明是真正阳性；如果在非特定部位阳性，或者整个切片阴性，都会判定免疫组化是阴性，或者是假阳性；
3、分析其表达强度，临床通常会用1+、2+、3+等来表达阳性强度。
阴性表示没有抗原，细胞里没有这种抗原。
1+、2+、3+分别代表细胞里抗原表达的强弱；
4、免疫组化判定的意义也不能绝对化，要参考实验室条件、每个人的操作方法、标本的前期处理。
免疫组化阴性也不要完全判定其是阴性，要结合其形态学改变，综合判断才能判定免疫组化操作的正确性。
免疫组化实验结果的判定和分析
免疫组化实验结果的判定和分析免疫组化实验是一种广泛应用于生物医学研究领域的分析方法，它用于检测和定量分析细胞或组织中特定分子的表达水平。
该实验主要通过特异性抗体与目标分子结合并产生可视化信号来实现。
在进行免疫组化实验的结果判定和分析时，需要考虑多个因素，如抗体的选择、染色的强度和分布等。
首先，在实验结果的判定和分析时，抗体的选择是非常重要的因素之一、选择合适的抗体可以确保实验结果的准确性和可靠性。
抗体需要具有高度的特异性，能够与目标分子结合形成稳定的抗原-抗体复合物。
此外，抗体还需要具有良好的亲和力和灵敏度，以便能够捕获并检测到目标分子的最低表达水平。
其次，实验结果的判定和分析需要考虑染色的强度和分布。
免疫组化实验中常用的染色方法有荧光染色和酶标染色等。
染色的强度可以反映目标分子在细胞或组织中的表达水平，而染色的分布则可以提示目标分子的亚细胞定位或组织定位。
通过评估染色的强度和分布，可以对目标分子的表达及其在生物学过程中的作用进行初步分析。
另外，实验结果的判定和分析还需要结合负对照和阳性对照组的结果。
负对照组通常是将待测样本中的目标分子结合位点堵塞或与非特异性抗体结合，以排除非特异性染色的可能性。
而阳性对照组则是使用已知表达目标分子的样本进行染色，以验证实验方法的可靠性。
通过与负对照和阳性对照组的比较，可以进一步确定实验结果的准确性和特异性。
此外，实验结果的判定和分析还可以应用定量分析方法。
免疫组化实验通常使用染色强度的定量参数，如光密度或荧光信号强度来评估目标分子的表达水平。
这可以通过计算图像中目标区域的颜色强度来实现。
定量分析可以帮助研究者确定目标分子在不同条件下的变化趋势，并进一步研究其与疾病发生和发展的关联。
最后，实验结果的判定和分析应该结合其他相关的实验数据和研究背景进行综合分析。
免疫组化实验的结果往往只能提供目标分子在组织或细胞中的表达水平，而无法直接确定其功能和作用机制。
因此，需要将实验结果与其他实验手段和研究结果相结合，以获得更全面的分析结果。
免疫组化结果判断及常见问题的分析
三、结果分析
1-day CM
阳性强度 20×10视野下，随机选
取5个视野，测100个阳性 细胞的平均光密度即为此 4-day CM 片的阳性强度。
PCNA
S-P×400 S-P×400
阳性细胞百分比
计数100个瘤细胞，其中 阳性细胞的比例：
＜5%
（－）
5%~30% （＋）
30%~50% （ ＋ ＋ ）
利用仪器按照不同的目的进行图象的修正、变 换、特征提取和测量。 1）“狭义”指消除图象的模糊不清部分，校正 畸变。 2）“广义”包括对图象的结构分析，提取特征 进行测量。
2、图象处理系统组成
图象输入（显微镜、扫描仪） 图象处理运算（病理图文分析软件） 图象、数据输出
3、图象处理系统功能
几何形态学定量分析 细胞核、浆的大小、面积、核浆比； 细胞分布密度、个数； 血管、 腺体的面积、密度；间质的面积 免疫组织化学分析 按着色灰度分类，计算阳性、阴性细胞的面积含量 DNA倍体分析 计算正常细胞及肿瘤细胞DNA 含量，给出倍体参数、DNA参数分布 直方图 AgNOR分析 颗粒分析：数目、大小、面积、比例
全片着色
Cyclin D1 套细胞淋巴瘤
全片着色
边缘着色
“阴阳脸”着 色
气泡
非特异性着色及其对策
非特异性着色原因 操作过程冲洗不充分 内源性过氧化物酶
内源性生物素 电荷吸附 抗体不纯
切片制片不当 加试剂后切片干燥
对策 每步冲洗3×5min
3％H2O2封闭 使用生物素阻断试剂盒阻断
非免疫动物血清封闭 采用单克隆抗体 改善取材和制片 防止切片干燥
四、免疫组化异常着色及对策
1.非特异性着色及其对策
非特异性着色原因 操作过程冲洗不充分 内源性过氧化物酶
免疫组化实验结果的判定和分析
免疫组化实验结果的判定和分析免疫组化实验结果的判定和分析就实验结果而言，免疫组化技术服务主要涉及抗体实验结果的描述与分析、图片的确定与选取、相关数据的提供，上述工作是免疫组化工作的重点内容。
只有严格的实验设计、标准的实验操作、专业化的结果分析才能满足客户的要求，更好地为客户提供最优质的服务。
免疫组化结果的判定原则：1•必须同时设对照染色。
没有对照染色的免疫组化染色结果是不可信的。
2•抗原表达必须在特定部位。
如LCA应定位在细胞膜上；CK应定位在细胞浆内；PCNA及p53 蛋白应定位在细胞核内；EMA 应定位在细胞膜上等等。
不在抗原所在部位的阳性着色，一概不能视为阳性。
3•阴性结果不能视为抗原不表达。
由于检测方法灵敏度有高低之分，有时可因染色方法灵敏度不够，而导致阴性反应，判断时应注意。
4•尽量避开出血、坏死及切片刀痕和界面边缘细胞的阳性表达，特别是酶免疫标记。
因为这类阳性着色多系内源干扰，或系人为因素所致。
5•对免疫组化标记结果的意义不能绝对化，应结合临床资料、X线等影像学及实验结果综合分析。
对照染色设计：（一）对照染色的目的设对照的目的是为了排除假阴性和假阳性。
假阴性的原因主要有三种：①组织处理不当，抗原丢失过多或被遮蔽；②抗体失活、效价过低或稀释度不合适（主要指一抗，即特异性抗体）；③染色步骤遗漏及差错，或显色剂的选择、缓冲液pH 和离子强度不当等。
假阳性均系由多种因素造成的非特异着色所致，原因主要有：①自发荧光或内源酶等干扰；②抗体试剂不纯（特别是一抗）；③操作失误，如污染、切片干枯或显色剂操作不当等；④Fc 受体的干扰，等等。
（二）对照的种类及其选用目的对照染色大致可分为四类：即阳性组织对照、阴性组织和阴性试剂对照及自身对照。
•阳性组织对照指用已证实含有靶抗原的同源及不同源组织切片或细胞涂片与待检实验切片同时作同样处理和免疫染色的组织对照。
正确的结果应呈现阳性，目的是为了证实所用免疫组化染色流程的有效性，排除假阴性的可能。
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免疫组化的判断良好的免疫组化染色切片是正确判断染色结果的基础和前提。
由于免疫组化染色过程中存在很多步骤或环节，每一个步骤或环节都可能影响到染色的最终结果，因此，要做好一张高质量的免疫组化切片并不是一件非常容易的事。
需要病理技术员和病理医生密切配合、相互协调、共同努力才能保证做出合格的免疫组化切片。
虽然免疫组化染色可以存在各种各样的问题，但从染色的结果看，一般可分为两类：无色片（即无阳性信号）和“杂音”染色片（有阳性信号）。
一、无色片染色结束后，切片中见不到任何阳性信号。
这是常规工作中比较常见的现象，出现这种现象，有两种可能：1、真阴性结果：整个染色过程没有出现问题，组织或细胞确实不表达与抗体相关的抗原。
2、假阴性结果：即此阴性结果不是真实的反映。
假阴性结果又可分为两种情况：（1）、切片中根本就不包含所预期检查的组织或细胞。
出现这种情况，要麽是病理医生选择错了切片或抗体选错了，要麽是技术员选错了蜡块。
获得正确的切片进行染色是获得正确结果的前提。
由此表明：制作出合格的免疫组化切片不仅仅是技术员的事，病理医生也起着不可缺少的作用。
（2）、染色过程中的某一或某些环节出了问题。
比如，组织未进行抗原修复，有的组织必须经过抗原修复才能检测抗原表达；或选用了只能用于冰冻组织而不能用于石蜡包埋组织的抗体；或一抗失效，虽然抗体失效在理论上是一个逐渐的过程，但偶尔也遇到突然失效的情况，抗体长期不用和/或已超过有效期是主要的原因。
也可见于染色过程中漏掉了某一环节，如忘记加二抗或三抗，或用了两次二抗而缺少了三抗，或配制DAB时少了过氧化氢。
为了避免这种简单的错误，有一种简单的方法：在三抗孵育结束时，将切片上的三抗甩在一张白纸上，在将配制好的DAB滴一滴在白纸的三抗上，观察是否出现棕色。
如果出现了，证明三抗和DAB的配制过程没有错误。
如果这种DAB再滴到切片上没有出现任何阳性信号，问题一定是出在三抗以前。
如果纸上不出现棕色反应，问题肯定在三抗或DAB或DAB的配制过程。
这种简单方法能迅速的帮助我们查找出现问题可能的原因。
解决阴性染色的问题非常简单，就是设立“阳性对照”。
如果阳性对照有了表达，说明染色的全过程和所有试剂都没有问题。
如果此时测试片仍为阴性，便是真实的阴性，说明组织或细胞没有相应的抗原表达。
反之，如果阳性对照没有着色，表明染色过程中某个或某些步骤出了问题或试剂出了问题。
应一一寻找原因。
阳性对照包括两种，一种称为“自身对照”或“内部对照”，这是指在测试的切片中本身就存在已知的抗原，如正常淋巴结中存在T和B 细胞抗原，CD20或CD3都应该有表达。
自身对照是一种比较理想的对照，对照和测试组织或细胞都在同一张切片中，都处于相同的试验条件下，结果更可靠也更具有可比性。
在选择自身对照片时最好选择既有病变组织同时又有正常组织的部分，这样有利于对比。
另一种称为“外部对照”，有时在测试的切片中不存在已知的抗原，如在胃的标本中怀疑是恶性黑色素瘤，需要用HMB45或Mart-1来检测，在正常的胃组织中本身不存在相关的抗原，如果病变出现阳性反应结果，尚能提示是恶黑，但是如果出现阴性结果，就无法确定是本身组织中不含黑色素瘤抗原，还是技术问题。
因此，应另外设立一个已知的阳性对照。
这种在测试组织之外的阳性对照称为“外部对照”。
在实际工作中需要设立外部对照的情况很多，如果每一种抗体都要选不同的阳性对照，工作量会很大。
为了解决这个问题，目前国内外有单位将多种不同组织集成在一起，制成多组织切片、“腊肠”“春卷”切片、组织芯片等，其连续切片储备待用，需要时取出一张便可作为阳性对照。
另外，比较简单的方法，是采用阑尾作为阳性对照，因为与人体其它组织器官比较阑尾包含的组织种类较多，如有上皮、淋巴组织、平滑肌、间质、神经、血管、间皮等。
一张阑尾切片可以检测大多数常用的抗体。
设立阳性对照是病理医生的任务或责任，而不是技术员的责任。
病理医生观察了HE切片，了解切片中是否有自身对照，如果没有，就应告诉技术员采用阳性对照。
因此，病理医生在免疫组化中的作用是不可忽视的。
抗体未覆盖上测试组织：当多块散开的小组织染色时，可能漏掉某块组织染色。
二、“杂音”染色片免疫组化除正常的真实的阳性信号外常常会遇到不正常的背景着色，这些非正常的着色称为“杂音”染色。
“杂音”染色种类繁多，产生的原因也多种多样，为了便于说明，笔者将其归纳为下面几种。
1、全片着色全片着色是指整个切片全都染上了颜色，着色的强度可深可浅，总之，分不清那些组织是阳性那些组织是阴性。
出现这种现象的原因有：（1）、抗体浓度过高：一抗浓度过高是常见的原因之一。
解决办法是，每次使用新抗体前应当对其工作浓度进行测试，使每一抗体个体化，找到适合自己实验室的理想工作浓度，既使是即用型的抗体也应如此，不能只简单的按说明书进行染色。
（2）、抗体孵育时间过长或温度较高：解决办法是，严格执行操作规程，最好随身佩带报时表或报时钟，及时提醒，避免因遗忘而造成时间延长。
现在流行的二步法（Polymer）敏感性很高，要求一抗孵育的时间不是传统的1小时，而是30分钟，因此，要根据染色结果进行调整。
（3）、DAB变质和显色时间太长：DAB最好现用现配，如有沉渣应进行过滤后再用。
配制好的DAB不应存放时间太长，因为在没有酶的情况下，过氧化氢也会游离出氧原子与DAB产生反应而降低DAB的效力，未用完的DAB存放在冰箱里几天后再用这种似乎节约的办法是不可取的。
DAB的显色最好在显微镜下监控，达到理想的染色程度时立即终止反应。
不过当染色片太多时或用染色机时，这样做似乎不现实，但至少应对一些新的或少用的抗体显色时进行监控，避免显色时间过长。
（4）、组织变干：修复液溢出后未及时补充液体、染色切片太多、动作太慢、忘记滴液、滴液流失等都是造成组织变干的原因。
解决的办法是操作要认真仔细，采用DAKO笔或PAP Pen在组织周围画圈，可以有效的避免液体流失，也能提高操作速度。
（5）、切片在缓冲液或修复液中浸泡时间太长（大于24小时）：原因上不清楚，但现象存在。
有的实验室喜欢前一天将切片脱蜡至修复，第二天加抗体进行免疫组化染色，如果将装有切片和修复液的容器放在4ºC冰箱过夜，对结果无明显影响，如果放在室温，特别是炎热的夏天，会出现背景着色，因此，不可存放时间太长。
（6）、一抗变质、质量差的多克隆抗体：注意抗体的有效期，过期的抗体要麽不显色要麽背景着色。
用新买的抗体时最好设立阳性对照和用使用过的抗体作比较。
2、切片边缘着色切片边缘着色也是一种常见的现象，这种现象称为边缘效应。
产生的原因：（1）、组织边缘与玻片粘贴不牢，边缘组织松脱漂浮在液体中，每次清洗不易将组织下面试剂洗尽所致。
解决办法：制备优质的胶片（APES或多聚赖氨酸），切出尽量薄的组织切片，不厚于4微米，组织的前期处理应规范，尽量避免选用坏死较多的组织。
（2）、切片上滴加的试剂未充分覆盖组织，边缘的试剂容易首先变干，浓度较中心组织高而致染色深。
解决办法：试剂要充分覆盖组织，应超出组织边缘2 mm。
用DAKO笔画圈时，为了避免油剂的影响，画圈应距组织边缘3-4 mm。
如何正确地判断和分析免疫组化的结果？---2(1)首先要确定免疫组化技术是否合格，合格的染色结果应该是背景颜色浅淡或无着色，而阳性标志物清晰和定位明确。
切片中的正常组织可以作为最简便的对照来判断染色结果的可靠与否，例如用Vimentin抗体，间质成纤维细胞利血管壁平滑肌细胞胞浆应呈阳性。
肯定为阳性的对照组织却呈阴性，待测组织的染色结果也就不可靠；这现象常是由于抗体失效或过度稀释、组织中抗原严重丢失等。
另一种现象是全片呈非特异性染色，实质细胞、间质细胞和细胞外基质无区别地都呈黄色(以HRP酶标法DAB为底物显色而言)，抗原无明确定位。
造成这种现象的原因很多，如抗体质量问题、组织固定不佳、洗涤不充分、组织中有能作用于底物的内源性酶(如过氧化物酶)、底物变质或显色时间过长等。
上述两种情况都表明染色失败，不能作为判断的依据。
(2)不仅要判断所检组织中有或无阳性标记物，还要注意阳性信号的分布部位和形态特征。
一般说来，阳性信号应与被测抗原所在的部位一致。
此处所说的部位包括组织和细胞的不同区域。
如免疫复合物的Ig和补体可在肾小球毛细血管壁、系膜区或间质血管壁上；细胞表达的抗原可在胞浆内、核内、胞膜上或细胞外基质。
病理医生应对于拟测抗原分布于何处有所了解。
例如Ki—67、PCNA、雌激素受体、孕激素受体、P53蛋白等定位于胞核；EMA、Ki—1、LCA等为胞膜型抗原，但有时也在胞质中。
大部分细胞抗原位于胞质内，其中亦有区别，有的阳性颗粒弥散于整个细胞的胞质，有的则呈斑块状局限于胞浆某处。
还有些抗原同时分布于胞质和胞膜(如胃肠腺癌细胞的EMA)，或核与胞质(如S—100、HMB—45)。
同一种抗原在不同类型的细胞可定位不同，因而分布的特点也有一定的鉴别意义，在此不一一列举。
免疫组化染色结果与预期的不一致时应作具体分析，不要轻易地否定或采用。
病理医生应了解以下几个与判断结果有关的因素。
①细胞内的阳性标志物不一定是该细胞自身表达的抗原，而可能是吞噬或吞饮的抗原物质；如间质中的巨噬细胞可摄入其他细胞释放的抗原物质，因而常呈非特异性的阳性表现；恶性肿瘤细胞侵袭破坏相邻的组织后也可摄入正常细胞的抗原，如恶性纤维组织细胞瘤、恶性黑色素瘤可与邻近的正常上皮呈现相同的上皮细胞抗原；甲状腺内的转移癌细胞可以呈甲状腺球蛋白阳性反应，固而可能被误认为甲状腺原发癌；但肿瘤细胞的吞噬只是近距离的，阳性细胞位于残存的正常组织附近；②肿瘤细胞和其相应的正常细胞在抗原表达的质和量方面都可有所不同；抗原的定位也可偏离一般规律，如正常细胞的膜型抗原在癌细胞却可定位于胞质内。
肿瘤细胞可出现异常的免疫表型，有时表达其它类型细胞的抗原，例如偶尔可见恶性淋巴瘤细胞在T细胞性免疫标志物阳性的同时呈B细胞的标志物SIg+.还可由于基因突变导致其编码蛋白不表达或某些抗原决定簇缺失，可造成代表细胞分化特征的抗原的不表现。
这些现象不少见，使得对肿瘤免疫组化染色结果的解释复杂化。
为解决这问题，可选用多种抗体以增加证实或否定的依据，此外也要求病理医生积累经验和相关的知识；③同一肿瘤中的瘤细胞是异质性的，这也反映在免疫标记阳性细胞在肿瘤内的分布是不均匀的，甚至同一细胞巢中阴性和阳性细胞并存；④同一种抗原的多克隆抗体和单克隆抗体的反应结果可能是不同的。
一般说来多克隆抗体的敏感性较高但特异性较差，而单克降抗体则相反。
这是由于单克隆抗体对抗原决定簇的专一性强；由不同克隆的杂交瘤细胞所产生的抗体，即使都作用于同一种抗原，但所结合的抗原决定簇不同，使用时可能出现不同的反应结果：例如在福尔马林固定的石蜡包埋组织中，部分抗原决定簇被掩蔽，就可能出现用A克隆的单抗结果为阳性而用B克隆的单抗结果为阴性。