免疫组化非特异性染色消除方法

免疫组化非特异性染色消除方法
一、非特异性染色的主要因素
组织的非特异性染色的机理很简单，其产生的缘由主要可分为以
下几点：
（1）一部分荧光素未与蛋白质结合，形成了聚合物和衍化物，而
不能被透析除去。

（2）抗体以外的血清蛋白与荧光素结合形成荧光素脲蛋白，可与
组织成分结合。

（3）除去检查的抗原以外，组织中还可能存在类属抗原（如Forssman氏抗原），可与组织中特异性抗原以外之之相应抗体结合。

（4）从组织中难于提纯抗原性物质，所以制备的免疫血清中往往
混杂一些抗其他组织成分的抗体，以致简单混淆。

（5）抗体分子上标记的荧光素分子太多，这种过量标记的抗体分
子带过多的阴离子，可吸附于正常组织上而呈现非特异性染色。

（6）荧光素不纯，标本固定不当等。

二、消退非特异性染色的方法
消退荧光抗体非特异性染色的方法应依据产生的缘由实行适当的
方法，常用的方法有以下几种：
（一）动物脏器粉末汲取法
常用肝粉（猪、大白鼠或小白鼠），其次是骨髓粉、鼠脑粉和鸡
胚粉等。

每毫升荧光抗体中加入肝粉50~100mg，在离心管中充分混匀，在室温中振动2h，4℃中过夜，再搅拌10min，高速离心
（3000~15000r/min）30min，1~2次后，即可使用其上清液。

汲取
一般应在临用前进行，汲取后之荧光抗体保存冰箱中勿超过2周。

染色应作汲取前后之比较，汲取时可先用缓冲盐水将组织干粉浸湿，离心（3000~15000r/min）30min，除去上清液，再加入荧光抗体进
行汲取，以免消耗过多的抗体。

肝粉或新奇细胞汲取是一种非特异性的消退方法，对荧光抗体的
荧光色素和蛋白都有吸附作用。

如检查组织中的病毒抗原时，也可
用相同的组织干粉或匀浆沉淀物汲取之。

用脏器肝粉汲取对荧光抗体损失较多，假如依据Hiramotos氏等
的方法将组织的20%生理盐水匀浆液，用生理盐水洗2~3次，
12000r/min。

10min离心沉淀，用其沉淀物汲取其荧光抗体即能完全达到目的，京极方久氏认为这样汲取对荧光抗体几乎没有损失，他们常用此法，效果甚佳，汲取后放置一周左右，用时有必要再汲取一次。

肝粉的制法：
（1）将若干只小白鼠或大白鼠放血杀死，取出肝脏，用生理盐水
洗2~3次，除去血液，剥掉表面的结缔组织的脂肪。

（2）剪碎，用生理盐水反复洗涤至无血色止，然后再加生理盐水
少许，用组织捣碎机或匀浆器作成匀浆。

（3）将肝匀浆装入离心管内（1/3左右），交换地用2~3倍量生
理盐水和丙酮反复洗涤各三次，至上清无血色止，每次完毕先用
2000r/min离心沉淀15 min后，再除去上清液。

（4）最终用丙酮洗涤肝浆，再用布氏漏斗过滤，或离心沉淀，将
沉淀物平铺在干净的玻璃板上，37℃烤干（过夜）。

（5）在乳钵中充分研磨，用120目铜筛筛选过后，分装，密封，
低温干燥保存。

（二）透析法
荧光素如FITC分子可以通过半透膜，而蛋白质大分子不能透过，
可将未与蛋白结合的荧光素透析除去。

（1）将标记完毕的荧光蛋白液装入一透析袋或玻璃纸袋内，液面
稍留空隙，紧扎。

（2）浸入0.02mol/pH。

7.1~7.4的PBS中（悬于大于标记物体积约50~100倍的PBS内），在4℃中透析，每日更换3~4次PBS，约5~7天，透析液中无荧即可（在荧光光源照耀下）。

（三）葡聚糖凝胶G-50柱层析法
除游离荧光素可用246cm柱层析法，具体方法参阅其次章。

加入
荧光抗体15~18ml（按床体积的5%~10%加样），使其缓慢渗入柱内，待即将全部入柱时，加入PBS少许，关闭下口，停留30~40min ，
使游离荧光充分进入细筛孔中，然后再接通洗脱瓶开头滴入洗脱液。

加入洗脱液肯定量后，荧光抗体即向下移行，渐渐与存留于上端的
游离荧光素之间拉开明显的界线，随着大量洗脱液的不断加入，二
者分别距离越来越大，荧光抗体最先流出，分前、中、后三部分收集，测F/P比值，合格者合并，浓缩，分装。

洗脱液用20%磺基水
杨酸测定蛋白（发生沉淀反应），连续洗脱，游离荧光素则相继被
洗脱下来，至洗脱液中无蛋白和荧光素后，此层析柱即可再用。

若用以除去荧光抗体中的游离荧光素和硫酸铵等盐类，可先在过
柱前透析一夜，否则，太浓NH4+，在蛋白未完全洗脱时即消失NH4+，因而影响提纯与回收蛋白，一般待洗脱液消失蛋白时，即进行收集，之后消失SO4++（用1%BaCl2检查发生白色沉淀）。

最终是NH4+，（用纳氏试剂检查呈黄棕色沉淀），待洗脱液无SO4++及NH4+后可
再用。

如仅用小量荧光抗体，可用120cm的柱层析柱，取2g Sephadex
G-50装柱，即可过滤2~3.5ml荧光抗体。

（四）DEAE纤维素柱层析法
标记过多或过少荧光素的抗体分子可用DEAE-纤维素柱层析法除去。

方法如下： DEAE-纤维素柱的装柱，洗脱、再生方法等与提纯
IgG方法相同。

装柱所需DEAE-纤维素量以干重每克交换20~50mg标记蛋白量为宜。

常用梯度洗脱法如下：
（1）层析柱用0.01mol/L、pH7.2PB平衡，标记物上柱后，先用0.01mol/L、pH7.2PB洗脱，洗出无色或淡绿色液体，洗脱液量（依据床体积大小每梯度乘3），然后依下列各种离子强度洗脱液，
分别洗脱和收集：
0.01mol/L、pH7.2PBS（0.05mol/L NaCl）洗脱部分1。

0.01mol/L、pH7.2PBS（0.01mol/L NaCl）洗脱部分2。

0.01mol/L、pH7.2PBS（0.02mol/L NaCl）洗脱部分3。

将此三部分收集液（每管5ml）分别测定其F/P比值，0.05mol/L NaCl pH7.2PB洗脱液280nm光密度高峰管合并，浓缩保存备用。

因这部分非特异性染色荧光最少，是比较好的荧光抗体。

其他两部分可以废弃。

（2）柱上吸附的过度标记蛋白可连续增加NaCl的浓度至
2.0mol/L洗脱完。

经过DEAE-纤维素层析后的标记抗体，其抗体量一般约损失50%，
因此有些要求不太高的抗体，如抗细菌荧光抗体，不肯定要这样处理，可用染色效价测定的稀释法除去非特异性染色。

（五）荧光抗体稀释法
先测定荧光抗体特异性染色与非特异性染色的效价，若二者效价
相差较大，则可将荧光抗体稀释至一临界浓度，使特异性染色呈阳性，而使非特异性染色保持阴性，稀释方法和染色效价测定方法相同。

（六）纯化抗原法
用各种方法提纯单一成分的抗原是产生单价特异性抗体的最主要
条件。

近代免疫化学技术（免疫汲取法）和柱层析法等供应了很大
的可能性，可参考有关专著。

（七）纯化抗体法免疫汲取法
例如抗IgA血清的纯化方法---免疫汲取法。

如分泌型IgA（SIgA）抗原纯度不高，所制的抗血清常与IgG呈交叉反应，为此需要汲取，常采纳纯化的人IgG戊二醛聚合物加以汲取纯化。

方法如下：
1、人IgG聚合物的制备在5ml含40mg/ml人IgG的0.1mol/L pH7.0磷酸缓冲溶液中，加入2.5%戊二醛溶液1ml，边加边搅，
5min即消失混浊，逐现大块胶块，放置30min后，用研钵将凝胶磨细，继用 1.0mol/L pH7.0磷酸缓冲溶液反复洗涤3次，末次加蒸馏水至20ml，即为人IgG聚合物悬液。

2、免疫汲取法将待汲取的抗SIgG血清加入待量IgG聚合物悬液，置室温搅拌60min，离心沉淀，上清液即稀释1倍的纯化抗SIgA血清。

如用IgG聚合物作少量分次汲取，其效果更好。

（八）伊文氏蓝（Evans blue）衬染法
用0.01%伊文氏蓝的0.01mol/L pH7.2PBS稀释荧光抗体，可将背景细胞和组织染色，呈红色荧光，与特异性黄绿色荧光形成鲜亮的对比，削减了非特异性荧光，宜作常规应用。

伊文氏蓝一般先配成1%溶液，保存于4℃，用前再稀释至0.01%用以稀释荧光抗体。

此外，还可以用胰酶消化组织切片或用10%牛血清蛋白封闭法等消退非特异性染色，提高特异性染色。