蛋白类木聚糖酶研究进展

蛋白类木聚糖酶抑制剂研究进展专业：09生物工程班级：09级1班作者:许斌指导老师：龚妍春摘要：木聚糖酶已广泛应用于饲料、食品加工、纸浆漂白等领域, 然而近年研究小麦等谷物中存在一种能抑制木聚糖酶活性的蛋白质性质的成分, 称为木聚糖酶抑制蛋白。

木聚糖酶抑制蛋白具有多型性, 但不同类型抑制蛋白都只作用于外源木聚糖酶,而对谷物内源性木聚糖酶没有抑制作用。

这就对木聚糖酶应用领域中酶功效的发挥提出了挑战: 抑制蛋白的存在是否影响外加木聚糖酶的作用? 本文综述了三类木聚糖酶抑制蛋白的分子结构抑制特性，阐明蛋白类抑制剂与木聚糖酶之间的互作机理, 为最大限度的发挥木聚糖酶功效奠定理论基础。

简要介绍了木聚糖酶抑制蛋白对谷物的影响作用。

关键词:木聚糖酶;木聚糖酶抑制蛋白;抑制特性1.引言木聚糖作为植物中的一种主要的非淀粉多糖，含量仅次于纤维素，是自然界中第二大丰富的多聚糖。

木聚糖是植物细胞壁多糖中半纤维素的主要成分，主链由D- 吡喃型木糖残基通过B-1, 4-糖苷键连接而成，主链上一般还带有少量的乙酰基、葡萄糖醛酸基、阿拉伯糖基等侧链取代基[1]。

内切B-1-4木聚糖酶(EC3.2.1.2，简称木聚糖酶) 是专一性水解木聚糖主链的酶，将大分子木聚糖降解成低聚木糖、木二糖及少量的木糖，木聚糖酶主要由微生物产生，但一些藻类、原生动物、甲壳类动物和植物等也能产生木聚糖酶。

根据催化结构域氨基酸的同源性和疏水簇分析法，木聚糖酶可分为GH10家族（包括植物酶类、真菌酶类和细菌酶类等）和GH11家族（包括真菌酶类和细菌酶类）2个家族。

已知的禾谷类所产的木聚糖酶都属于GH10 家族，而微生物产生的木聚糖酶则属于F10 或G11 两个家族[2]。

木聚糖除了在饲料工业中应用之外，在造纸制浆、食品加工等领域均有涉及。

然而, 近年的研究发现微生物木聚糖酶的活性在体外试验中会被来自小麦等谷物的一种蛋白质性质的成分所抑制, 这种成分即木聚糖酶抑制蛋白。

由于实验室应用试验所加木聚糖酶的量总是大于实际应用过程中的酶用量, 因此可以推测实际应用中外加的木聚糖酶也会受到基质中抑制蛋白的抑制作用, 从而影响用酶工艺过程[3]。

许多有益微生物产生的木聚糖酶已经广泛应用于饲料面包焙制淀粉加工纸浆生物漂白等领域，而植物病原菌的木聚糖酶有方面作用:一方面，能分解植物细胞壁而可能促进病原菌的侵染，另一方面，还可能作为诱发子诱发植物的抗病防御系统因此植物病原菌的木聚糖酶在植物与病原菌互作机制研究和植物抗病防御领域中备受关注植物体为保护其自身免受病原菌木聚糖酶的侵害，也进化出用以对抗病原菌所分泌木聚糖酶的抑制蛋白这些抑制蛋白可能通过种方式抵抗病原菌的侵害，一种是降低病原菌细胞壁降解酶的活性，另一种是确保植物产生具有防御激发子活性的多糖片段，以防这些多糖片段在无抑制蛋白存在的情况下被降解[4]。

2.木聚糖酶抑制剂木聚糖酶抑制蛋白最早在小麦中发现, 1997年, Debyser等发现小麦粗蛋白质提取物中有能抑制木聚糖酶活性的蛋白组分存在, 并从小麦全粉中纯化出第1种木聚糖酶抑制蛋白, 命名为TAXI( Triticum aestivum xylanase inhibitor); 1999年, McLauchlan等在小麦粉中发现第2种木聚糖酶抑制蛋白, 其结构和抑制特异性都与TAXI型不一样, 命名为XIP( xylanase inhibitor protein);2007年, Fierens等又在小麦中发现一种结构上属于甜蛋白家族的木聚糖酶抑制蛋白, 命名为TLXI( thaumatin-like xylanase inhibitor)。

木聚糖酶抑制蛋白不仅在小麦中存在, 而且在黑麦、大麦、玉米、燕麦、水稻等谷物中都有发现, 但不同谷物中抑制蛋白的类型和它们的比例有所不同, 比如在玉米和水稻中至今只发现有XIP型抑制蛋白的存在, 而没有TAXI型抑制蛋白。

木聚糖酶抑制蛋白具有多样性, 从结构上划分的上述3型抑制蛋白又都以多同源物的家族形式出现, 如TAXI型抑制蛋白已知有TAXI-I、TAXI-II、TAXI-III、TAXI-IV4种同源物[3]。

不同抑制蛋白的分子量、等电点不同, 对不同来源的木聚糖酶的抑制特异性也有差异, 但有一点是共同的, 即三种抑制蛋白都只作用于外源木聚糖酶, 而对小麦内源性的木聚糖酶没有抑制作用。

推测谷物中木聚糖酶抑制蛋白的存在并非植物本身代谢调节所需, 而是植物防御病原菌入侵的一种机制。

植物通过产生特定的木聚糖酶抑制蛋白, 以识别病原菌所分泌的木聚糖酶, 从而削弱病原菌对植物细胞壁的降解, 避免其在植物上的定殖。

因此木聚糖酶抑制蛋白也被归为植物防御相关蛋白[5]。

在已知存在有木聚糖酶抑制蛋白的谷物中,以小麦中木聚糖酶抑制蛋白含量为最高。

在小麦的整个生育阶段, 包括根茎在内的任何部位都存在木聚糖酶抑制蛋白, 抑制蛋白在不同组织中的含量差异明显, 其中以成熟籽粒中含量最高, 而根和叶中含量较低[5]。

对大田种植小麦的木聚糖酶抑制活性的研究也表明, 叶中抑制活性随小麦不同生育期而变化, 总体呈现先增加后下降的趋势, 而籽粒中的抑制活性则随籽粒的逐渐成熟而持续升高[6]。

木聚糖酶抑制蛋白的含量还因小麦品种不同而不同,并且会受到不同农艺栽培措施的影响, 如生育期是否采用杀真菌剂处理以及不同氮肥施入量等因素都会影响到小麦籽粒中抑制蛋白的水平, 表明木聚糖酶抑制蛋白是与小麦生理状态紧密相关的一种组分[7]。

3.木聚糖酶抑制蛋白的抑制特性3.1.1木聚糖酶TAXI 型抑制剂的一般抑制特性通常来说，同一种木聚糖酶抑制剂对不同来源的木聚糖酶抑制程度有所不同。

TAXI型抑制剂作用于GH11家族真菌来源的木聚糖酶，而对GH10家族真菌木聚糖酶则没有抑制作用。

TAXI型抑制剂的一般抑制特性抑制剂对木聚糖酶的抑制活性主要决定于木聚糖酶的属性, XIP 型抑制剂只对真菌木聚糖酶有抑制作用, 而对细菌木聚糖酶没有抑制效应( Flat-man等, 2002 )。

TAXI 型抑制剂对真菌和细菌木聚糖酶均具有抑制作用, 但仅限于G/11家族木聚糖酶( Goesaert 等, 2003 ; Gebruers 等, 2002 )。

Gebruers 等(2001) 从小麦中纯化出TAXI -Ⅰ和TAXI-Ⅱ2 个亚型, 2个亚型具有相似的结构和N 端氨基酸序列,不存在糖基化位点, 分子质量大约为40 ku, 这些表明它们之间可能存在较近的进化关系; 它们的等电点( PI ) 有所不同, 分别在pH 8.8 和9.3 左右, 其抑制特性也有所差异。

如果按照等电点来分可将木聚糖酶分为高等电点( P≥6.0 ) 和低等电点( PI ≤6.0 ) 2 种。

等电点较低( acidic , PI ≤6.0 ) 的4 种木聚糖酶中, 3 种木聚糖酶不会被TAXI- Ⅱ抑制或抑制力很低, 但却能被TAXI - Ⅰ强烈抑制, 只有P.funiculosum( PI 3.7 )被2 个亚型同时抑制; 而对于等电点较高( PI ≥6.0 ) 的几种木聚糖酶, 其活性则均可被2 个亚型强烈抑制( Furniss 等, 2002 )3.1.2木聚糖酶T AX I 型抑制剂的耐热性及耐酸碱性Gebruers ( 2002 ) 报道, TAXI-Ⅰ和TAXI -Ⅱ对黑曲霉和枯草芽孢杆菌木聚糖酶活性的最适抑制条件分别是pH4.5~6.0、温度20 ~40℃。

在不高于70 ℃的条件下处理40 min 或者在pH 3.0~12.0 诱导2 h , 小麦木聚糖酶抑制剂仍有很高的稳定性; 但一旦超出这个范围, 其活性将会大幅下降, 如在100 ℃预处理 3.5 ~4.5 min , 其活性将会下降50 %。

由此可以看出, TAXI 具有较好的热稳定性和耐酸碱性, 在温和的加工工艺条件下, 难以将其灭活。

3.1.3木聚糖酶结构的差异对T AX I 型抑制剂活性的影响Sibbesen 和Sorensen ( 2001 ) 对木聚糖酶活性部位的表面氨基酸残基、碱性氨基酸残基、酸性氨基酸残基、脂肪族氨基酸残基和芳香族氨基酸残基的研究表明, 酶的结构差异对抑制剂的敏感度具有重要影响。

在某些情况下, 单一氨基酸残基( 如Asp11 ) 发生变化后, 抑制活性几乎完全消失。

天冬氨酸的酸性可能对抑制剂活性有重要作用, 因此当该氨基酸残基变异为芳香族氨基酸残基或碱性氨基酸残基后, 木聚糖酶活性就不再被抑制。

但是, 抑制剂和Asp11 残基的反应本质仍然很难推测[1]。

来自不同谷物的TAXI 型抑制剂具有相似的分子结构和N 端氨基酸序列。

TAXI 型抑制剂在温和的酸碱度及温度条件下, 具有最大的抑制活性; 在高达70 ℃的条件下维持40 min 或者在pH在3.0 ～12.0 的条件下反应2 h 也仍具有很高的活性。

因此, 温和的反应条件难以将抑制剂灭活,而木聚糖酶特定氨基酸的突变也能使抑制剂活性迅速下降。

因此, 应从分子结构角度深入研究木聚糖酶抑制剂, 阐明抑制剂与木聚糖酶之间的互作机理, 为最大限度的发挥木聚糖酶功效奠定理论基础。

3.2XIP型木聚糖酶抑制剂McLauhlan[8]等在小麦中分离纯化出XIP-I抑制蛋白，分析表明XIP-I为单体糖基化蛋白pi为8.7-8.9，分子量为29.0kDa ，与伴刀豆球蛋白和几丁质酶完全同源，但无几丁质酶活性。

XIP-I竞争性的抑制属于糖苷水解酶GH10、GH11家族的真菌木聚糖酶，竞争性的抑制GH11家族黑曲霉和绿色木霉分泌的木聚糖酶.XIP-I与GH10黑曲霉作用形成一个手复合体，与青霉菌形成另一手形，表明XIP-I有2个独立的酶结合位点[2]。

3.3TLXI木聚糖酶抑制蛋白Fierens等在小麦面粉中发现第3种木聚糖酶抑制剂TLXI，其结构与XIP、TAXI 型完全不同，和类奇异果甜蛋白有60%以上的相似性，属于一组小的TLps 家族，这类TLps分子内均含有10个半胱氨酸，形成稳定的二硫键，具有抗真菌活性位点。

TLXI蛋白的pI大于9.3，分子量约18KDa，多数有O-糖基化位点且位置可变有独特的抑制专一性，非竞争性抑制一些GH11家族木聚糖酶，属于慢性紧密结合抑制剂基于TLXI对木聚糖酶的专一性及其与TLps的同源性，推测TLXI抑制蛋白在植物防御中起作用[2]。

4.木聚糖酶抑制蛋白的分子结构4.1TAXI型分子结构Gebruer等从小麦种纯化出TAXI-1和TAXI-2个亚型，两个亚型具有相似的结构，均由A和B2部分组成，分子质量都是40kDa，无糖基化位点，结构A由一条多肽链组成，分子内至少有一个二硫键，分子量为40kDa，结构B由2条分别为29和11kDa的多肽链组成，多肽链间二硫键连接。