第五章 酶的化学修饰
合集下载
酶工程 第五章
第—节 金属离子置换修饰
用于酶分子修饰的金属离子，往往是二价金属离子。例如 Ca 2 , Mg 2 , Mn2 , Zn2 , Co 2 , Cu 2 , Fe2 等等。金属离子置换修饰法只适用于本来 在结构中含有金属离子的酶。 在离子置换修饰的过程中，首先要加入一定量的乙二胺四乙酸 (EDTA)等金属螯合物到酶液中，使酶分子中的金属离子与EDTA形成螯 合物，此时酶成为无活性状态。通过透析或超滤、分于筛层析等方法， 可将EDTA-金属螯合物从酶液中分离除去。然后用不同的金属离子加到 酶液中，酶蛋白与金属离子结合。根据离子种类的不同，经离子置换 后的酶将会出现不同的特性。有些修饰酶活性比原来酶的活性降低， 甚至完全无活性；有些修饰酶的活性比原酶活性提高；有些修饰酶的 稳定性比原酶增加等。所以只要选择到适宜的金属离子作修饰剂，去 置换原来的金属离子，就有可能提高酶活力，增加酶稳定性。
第二节
大分子结合修饰
一、通过修饰提高酶活力
酶的催化能力受诸多因素的影响。本质上是由其特定 的空间结构，特别是由其活性中心的特定构象所决定的。 水溶性大分子通过共价键与酶分子结合后，可使酶的 空间结构发生某些改变，使酶的活性中心更有利于和底物 结合，并形成准确的催化部位，从而使酶活力得以提高。 例如：每分子核糖核酸酶与6.5分子的右旋糖酐结合，可 使该酶的活力提高到原有的活力的2.25倍；用右旋糖酐修 饰胰凝乳蛋白酶，当每分子酶与11分子右旋糖酐结合时， 修饰酶的活力达到原有的活力的5.1倍；每分子胰蛋白酶 用11分子的右旋糖肝修饰后，酶活力可提高30％等。
第二节 大分子结合修饰
利用水溶性大分子与酶结合，使酶的空间结构发生某 些精细的改变，从而改变酶的特性与功能的方法称为大分 子结合修饰法。简称为大分子结合法。 通常使用的水溶性大分子修饰剂有：有旋糖酐、聚乙 二醇、肝素、蔗糖聚合物(Ficoll)、聚氨基酸等。这些大 分子在使用前一般需经过活化，然后在一定条件下与酶分 子以共价键结合。对酶分子进行修饰。例如：右旋糖酐先 经高碘酸(HIO4)活化，然后与酶分于的氨基共价结合。
酶工程 第五章酶分子修饰 第四节酶蛋白侧链基团修饰
酶蛋白侧链基团修饰一般采用化学手段，故属于化学 修饰法。所采用的各种小分子化合物称为侧链基团修饰剂。 不同的侧链基团所使用的修饰剂各不相同，可根据需要加 以选择。现将几种常用的小分子侧链基因修饰剂介绍如下：
一、氨基修饰剂
凡能使酶蛋白侧链上的氨基发生改变的化台物，称为 氨基修饰剂。主要的有：二硝基氟苯、醋酸酐、琥珀酸酐、 二硫化碳、亚硝酸、乙亚腔甲酯、O-甲基异脲、顺丁烯二 酸酐等。这些修饰剂作用于酶蛋白侧键上的氨基或产生脱 氨基作用，或与氨是共价结合将氨基屏蔽起来，使氨基原 有的副链改变，从而改变酶蛋白的构象。
酶蛋白侧链基团的修饰可以使用各种小分子物质，也 可使用各种大分子物质。其中使用水溶性大分子与侧链基 团结合的属大分子结合修饰，已在本章第二节阐述。使用 不溶性大分子与酶侧链基团结合的属于结合固定化方法， 将在下一章介绍。本节主要介绍各种小分子化合物与酶蛋 白侧极基团相互作用的修饰方法。
第四节 酶蛋白侧链基团修饰
第四节 酶蛋白侧链基团修饰
已知大肠杆菌的苹果酸酶可催化下列4种生化反应：
该酶的巯基用乙基马来酰亚胺修饰后，其催化 主反应A的功能消失，同时也失去催化反应B的能力， 然而催化反应C和D的酶活性却提高10倍以上。
第四节 酶蛋白侧链基团修饰
酶经侧链基团修饰后，对于酶的活性、稳定性或抗原 性都有显著影响，往往可提高其使用价值。例如：用O-甲 基异脲修饰溶菌酶，使赖氨酸残基的ε-氨基与之结合， 修饰后酶活力保持不变，但稳定性提高，且很容易结晶析 出；用亚硝酸修饰天门冬酰胺酶，使其氨基末端的亮氨酸 和肽链中的赖氨酸的氨基脱去变成羟基，经修饰后，该酶 的稳定性大大提高，在体内的半衰期可延长2倍，显著提 高治疗效果；枯草杆菌蛋白酶的第l 04位酪氨酸可特异地 被碘化、硝化和琥珀酰化，经修饰后的酶，由于负电荷能 引入，而增加了对带正电荷底物的结合力；葡萄糖异构酶 经琥珀酰化修饰后，其最适pH值下降0.5单位，并增加酶 的稳定性，这对果葡糖的生产有利。
一、氨基修饰剂
凡能使酶蛋白侧链上的氨基发生改变的化台物，称为 氨基修饰剂。主要的有：二硝基氟苯、醋酸酐、琥珀酸酐、 二硫化碳、亚硝酸、乙亚腔甲酯、O-甲基异脲、顺丁烯二 酸酐等。这些修饰剂作用于酶蛋白侧键上的氨基或产生脱 氨基作用，或与氨是共价结合将氨基屏蔽起来，使氨基原 有的副链改变，从而改变酶蛋白的构象。
酶蛋白侧链基团的修饰可以使用各种小分子物质，也 可使用各种大分子物质。其中使用水溶性大分子与侧链基 团结合的属大分子结合修饰，已在本章第二节阐述。使用 不溶性大分子与酶侧链基团结合的属于结合固定化方法， 将在下一章介绍。本节主要介绍各种小分子化合物与酶蛋 白侧极基团相互作用的修饰方法。
第四节 酶蛋白侧链基团修饰
第四节 酶蛋白侧链基团修饰
已知大肠杆菌的苹果酸酶可催化下列4种生化反应：
该酶的巯基用乙基马来酰亚胺修饰后，其催化 主反应A的功能消失，同时也失去催化反应B的能力， 然而催化反应C和D的酶活性却提高10倍以上。
第四节 酶蛋白侧链基团修饰
酶经侧链基团修饰后，对于酶的活性、稳定性或抗原 性都有显著影响，往往可提高其使用价值。例如：用O-甲 基异脲修饰溶菌酶，使赖氨酸残基的ε-氨基与之结合， 修饰后酶活力保持不变，但稳定性提高，且很容易结晶析 出；用亚硝酸修饰天门冬酰胺酶，使其氨基末端的亮氨酸 和肽链中的赖氨酸的氨基脱去变成羟基，经修饰后，该酶 的稳定性大大提高，在体内的半衰期可延长2倍，显著提 高治疗效果；枯草杆菌蛋白酶的第l 04位酪氨酸可特异地 被碘化、硝化和琥珀酰化，经修饰后的酶，由于负电荷能 引入，而增加了对带正电荷底物的结合力；葡萄糖异构酶 经琥珀酰化修饰后，其最适pH值下降0.5单位，并增加酶 的稳定性，这对果葡糖的生产有利。
第五章 酶分子的修饰
3、加入置换离子 加入一定量的另一种金属离子，酶蛋白与新加入的 金属离子结合后，除去多余的置换离子。
三、金属离子置换修饰酶的作用
1、阐明金属离子对酶催化作用的影响： 了解各种金属离子在酶催化过程中的作用，从而
有利于阐明酶的催化作用机制。
2、提高酶活力： 一般α—淀粉酶是杂离子型，即分子中大多数含
有Ca2+，有些分子中则含有Zn2+、Mg2+或其他离子， 如果将其他杂离子都换成Ca2+，则可以提高酶活力， 并显著提高酶的稳定性。
来源：Cys
修饰反应:烷基化 修饰剂：碘乙酸(IAA)
碘乙酰胺(IAM)
• E-SH + R-X －> E-SR +HX
N-乙基马来酰亚胺（NEM）（常用的专一修饰巯基试 剂）
•E－SH ＋
四、咪唑基的化学修饰
来源：His 修饰反应:酰基化与烷基化
酰基化修饰剂: 常用焦碳酸二乙酯（diethyl paracarbonate）
一、氨基修饰
来源：Lys, Arg, His, Gln 修饰反应：酰基化与烷基化 修饰剂:
三硝基苯磺酸（TNBS）、丹磺酰氯（DNS）、 2，4－二硝基氟苯（DNFB）、碘乙酸、碘乙酰
胺、 2，4，6－三硝基苯磺酸、亚硝酸等
①乙酸酐修饰 ② 2，4，6—三硝基苯磺酸修饰
③2，4—二硝基氟苯修饰(Sanger反应)
二、选择酶分子修饰剂 特性： (1)能选择性地与一个aa残基反应 。 (2)反应在保证酶蛋白不变性的条件下进行 。 (3) 被标记的残基在肽中稳定，容易通过降解分离 出来并鉴定。 (4)反应程度能用简单的技术测定
修饰剂的要求：相对分子量较大；生物相容性和水溶性好； 表面反应活性基团较多；修饰后酶活的半衰期较长；
三、金属离子置换修饰酶的作用
1、阐明金属离子对酶催化作用的影响： 了解各种金属离子在酶催化过程中的作用，从而
有利于阐明酶的催化作用机制。
2、提高酶活力： 一般α—淀粉酶是杂离子型，即分子中大多数含
有Ca2+，有些分子中则含有Zn2+、Mg2+或其他离子， 如果将其他杂离子都换成Ca2+，则可以提高酶活力， 并显著提高酶的稳定性。
来源：Cys
修饰反应:烷基化 修饰剂：碘乙酸(IAA)
碘乙酰胺(IAM)
• E-SH + R-X －> E-SR +HX
N-乙基马来酰亚胺（NEM）（常用的专一修饰巯基试 剂）
•E－SH ＋
四、咪唑基的化学修饰
来源：His 修饰反应:酰基化与烷基化
酰基化修饰剂: 常用焦碳酸二乙酯（diethyl paracarbonate）
一、氨基修饰
来源：Lys, Arg, His, Gln 修饰反应：酰基化与烷基化 修饰剂:
三硝基苯磺酸（TNBS）、丹磺酰氯（DNS）、 2，4－二硝基氟苯（DNFB）、碘乙酸、碘乙酰
胺、 2，4，6－三硝基苯磺酸、亚硝酸等
①乙酸酐修饰 ② 2，4，6—三硝基苯磺酸修饰
③2，4—二硝基氟苯修饰(Sanger反应)
二、选择酶分子修饰剂 特性： (1)能选择性地与一个aa残基反应 。 (2)反应在保证酶蛋白不变性的条件下进行 。 (3) 被标记的残基在肽中稳定，容易通过降解分离 出来并鉴定。 (4)反应程度能用简单的技术测定
修饰剂的要求：相对分子量较大；生物相容性和水溶性好； 表面反应活性基团较多；修饰后酶活的半衰期较长；
酶分子的化学修饰
2、定点突变和化学修饰结合技术
利用定点突变法来改变酶的底物专一性，开发出 了新型的酶制剂。将定点突变所得酶进行化学修饰， 得到一些新颖的酶制剂。利用定点突变技术在酶的关 键活性位点引入一个氨基酸残基，然后利用化学修饰 法对突变的氨基酸残基进行修饰，引入一个小分子化 合物，得到一种化学修饰突变酶。
枯草杆菌蛋白酶化学修饰突变过程
1、交联技术
酶的人工交联可在一条多肽链内形成，是一种作 用于分子间或分子内部的交联方式，能提高酶的稳定 性，防止酶在不良环境中失活。 Fernandez 等提出了一种新颖的分子内交联方式。 实验表明这种方式在酶主要的氨基基团上，戊二醛 （GLU）对其进行了交联修饰（修饰度45% ~ 55%）， 然后把修饰酶在pH 9 和20C 的条件下老化30 min。在 这段时间内酶的活性虽然有所损失，但是稳定性提高 了3 倍。
实验结果分析： 反应pH对PA-PPL活性的影响—— 修饰酶PA-PPL的水解活性明显高于原酶PPL， 且PPL在修饰前后，最适pH范围未发生明显变 化，均为7.0-8.0。
实验结果分析： 反应温度对PA-PPL活性的影响——
在试验温度范围内，修饰酶PA-PPL的水解活性明显高 于原酶PPL，但二者的最适反应温度相同，都为 40℃ ．
刘宏芳,侯瑶,赵新淮;大豆蛋白限制性酶解修饰与产品的溶解性和保 水性变化[J];东北农业大学学报;2009-01,40(1):97-103. 田国贺,郭佳宓,吕团伟等；聚乙二醇对菠萝蛋白酶的化学修饰[J]； 生物技术；2006-02,16(1):35-38.
二、原理、修饰剂及反应
1、化学修饰原理
1）增强酶天然构象的稳定性与耐热性
修饰剂分子存在多个反应基团，可与酶 形成多点交联。使酶的天然构象产生 “刚性”结构。
简述酶的化学修饰调节的特点
简述酶的化学修饰调节的特点
酶的化学修饰调节是指通过酶分子上某些化学基团的改变，从而改变酶的活性或特性的过程。
这种调节方式具有以下特点：
1. 调节效率高：酶的化学修饰调节通常可以在短时间内快速响应细胞内环境的变化，使酶的活性迅速改变，以适应细胞的生理需求。
2. 调节方式多样：酶的化学修饰调节可以通过多种方式进行，如磷酸化、乙酰化、甲基化、腺苷酸化等。
不同的修饰方式可以导致酶的活性、稳定性、特异性等方面的改变。
3. 具有级联放大效应：酶的化学修饰调节可以引发一系列的级联反应，从而对细胞内的信号通路产生放大作用。
这种级联放大效应使得细胞能够对微弱的信号做出快速而强烈的反应。
4. 受多种因素调控：酶的化学修饰调节受到多种因素的调控，如激素、生长因子、细胞因子等。
这些因素可以通过影响酶的修饰酶或修饰底物的活性来调节酶的化学修饰。
5. 可逆性：酶的化学修饰调节通常是可逆的，即修饰后的酶可以通过去修饰酶的作用而恢复到原来的状态。
这种可逆性使得酶的活性可以在需要时快速改变，以适应细胞的生理需求。
总之，酶的化学修饰调节是一种高效、多样、可逆的调节方式，对于细胞内代谢、信号转导等过程的精确调控具有重要意义。
酶的化学修饰
酶化学修饰的基本原理
3．抗蛋白水解酶 酶分子的基本结构是蛋白质，所以易受蛋
白酶的攻击而遭破坏。蛋白酶一般是作用于某 些特定氨基酸残基之间的酰胺键，修饰这些氨 基酸残基，可以阻止蛋白酶对这些酰胺键的攻 击。另外，交联于酶分子上的大分子修饰剂能 产生空间障碍，阻止蛋白酶接近攻击点，起到 “遮盖”敏感键的作用。
三、酶化学修饰方法的设计
酶化学修饰的基本原则都是充分利用修 饰剂所具有的各类化学基团的特性，直接或 经过一定的活化过程后与酶分子上的某种氨 基酸残基产生化学反应。
设计酶化学修饰方法时 的注意事项
a. 对修饰剂的要求 在选择修饰剂时一般要求修饰剂有较大的分子
量，良好的生物相容性和水溶性，修饰剂分子表面 有较多的反应活性基团，与氨基酸残基形成的共价 键稳定，容易鉴定 。
酶改造的两个水平
基因水平：有目的的改变基因中的核苷酸顺序， 从而改变酶的氨基酸顺序，以期获得化学结构更 为合理的酶蛋白。这是蛋白质工程的研究内容。
蛋白质水平：人们用化学法或酶法对已合的酶 的结构进行改造，一方面是切除部分肽链和置换 某些氨基酸，另一方面是使酶分子中的某些氨基 酸残基与一些化学试剂反应，加上一些特定的基 团，即酶的化学修饰。由于后一方面技术较为简 单，容易见效，所以这方面的工作做得最多。
高碘酸氧化法
由于反应产物A不稳定，所以用四氢硼钠还原成稳定产物B。用四氢硼钠还原 的反应比较激烈，对酶活性影响较大，因此可在酶与右旋糖酐之间加一个手臂来 减少酶的失活，如加一个联苯胺。
四、修饰剂及修饰反应
1．糖及糖的衍生物
（1）右旋糖酐及右旋糖酐硫酸酯 右旋糖酐是由α -葡萄糖通过α -1,6-糖苷键形
成的高分子多糖，具有较好的水溶性和生物相容性， 可用作代血浆。右旋糖酐硫酸酯是右旋糖酐分子中 的羟基与硫酸成酯而得。多糖链上的双羟基结构经 活化后可与酶分子上的自由氨基结合。双羟基的活 化除溴化氰法外，还有高碘酸氧化法。高碘酸能通 过氧化邻双羟基结构而将葡萄糖环打开，形成的高 活性醛基与酶分子上的氨基反应，使右旋糖酐和酶 共价结合。
酶的化学修饰
第五章酶分子的化学修饰主要内容：●酶的活性中心●酶化学修饰的目的●酶化学修饰的原理●酶化学修饰的设计●酶化学修饰的应用第一节酶的活性中心（active site）一、活性中心的概念P12酶的必需基团(essential group): 与酶活性有关的基团酶的活性中心(active center): 由必需基团构成的与酶催化活性有关的特定区域.酶的必需集团在一级结构上并不互相毗邻，往往分散在氨基酸系列中，甚至分布在不同肽链上。
当肽链盘曲、折叠形成空间结构时，互相隔离的必需基团彼此靠近，集中在酶分子表面而形成具有三维结构的特定区域。
该区域能与底物结合并发挥催化作用，故称酶的活性中心(active center)活性部位（active site）。
对于结合酶来说，辅酶或辅基参与酶活性中心的组成。
活性中心的重要化学基团——7种氨基酸出现的频率最高：Lys、Asp、Glu、Cys、His、Tyr和Ser（兰天果拌猪肉丝）。
某些功能基团（氨基、羧基、巯基、羟基和咪唑基）是酶的必需基团。
图释左图：丝氨酸的羟基、半胱氨酸的巯基、组氨酸的咪唑基右图：天冬氨酸和谷氨酸的羧基、赖氨酸的氨基、酪氨酸和丝氨酸的羟基。
二、活性中心的共性P12(1)活性部位只占酶分子很小的一部分（1-2%）。
(2)活性部位是一个三维实体(entity)(3)活性中心位于酶分子表面的疏水性裂缝中。
(4)活性中心构象不是固定不变的（诱导契合）(5)酶与底物通过盐键、氢键、范德华力和疏水作用等次级键结合。
1．The active site takes up a relatively small part of the total volume of an enzyme.左图：肌球蛋白模型。
只显示出α-碳原子，红的为血红素，绿的是两种关键的组氨酸残基。
右图：来自胞质热激蛋白的ATP酶片段的结构图。
ADP（红的）位于两个结构域（黄和蓝的）之间的裂缝中。
05-酶的化学修饰
（二）酶蛋白主链的修饰 ——主要是靠酶法进行修饰，用 蛋白酶对主联进行部分水解，可 以改变酶的催化特性。
（三）催化活性基团的修饰 ——通过选择性修饰催化活性氨 基酸的侧链来实现氨基酸残基的 取代，使一种氨基酸侧链转化为 另一种氨基酸侧链，这种方法又 称为化学突变法。
（四）肽链伸展后的修饰 ——酶蛋白经过脲、盐酸胍处理， 使肽链充分伸展，对酶分子内部 的疏水基团进行修饰，然后在适 当条件下，重新进行折叠。
（三）酶的大分子修饰作用 ——非共价修饰 ——共价修饰
1、大分子非共价修饰
——利用一些大分子试剂通过与酶非共价相互 作用，对酶进行有效的保护 ——例如聚乙二醇、右旋糖苷等通过氢键固定 于酶分子的表面，同时又有效地与外部水相连， 从而保护酶的活力；一些多元醇、多糖、多聚 氨基酸、多胺等能通过调节酶的微环境来保护 酶活力；另外一些蛋白质可以通过相互作用， 排除分子表面的水分子，降低介电常数，使酶 的稳定性增加。
在基础酶学研究上
探测酶活性必需氨基酸的性质和数目 酶蛋白一级结构的测定
酶蛋白的结构变化与运动
酶蛋白部分区域的构象状态 酶的作用机理与催化反应历程 酶分子的拓扑学以及寡聚酶的亚基结合状态 酶的固定化技术 酶纯度的分析与检测
在疾病治疗上
—克服酶在体内的不稳定性
—消除或降低酶的抗原性 —有助于酶分子到达并集中于病灶细胞 在工业上的应用
第五章
酶分子的化学修饰
酶分子化学修饰
——在分子水平上对酶进行改造，以达 到改变结构和改性的目的。在体外将酶 分子通过人工的方法与一些化学物质， 特别是一些有生物相容性的物质进行共 价连接，从而改变酶的结构和性质。这 些化学物质称为修饰试剂，酶化学修饰 主要用于基础酶学的研究和疾病治疗。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
用专一性化学修饰剂修饰酶活性中心的某一 氨基酸残基的侧链基团。 氨基酸残基的侧链基团。
3)亲和标记（位点专一性修饰） 3)亲和标记（位点专一性修饰） 亲和标记
采用的修饰试剂是根据底物的化学结构设计 合成的含有活泼反应基团的底物类似物。 合成的含有活泼反应基团的底物类似物。 作用机制： 作用机制：利用酶对底物的特殊亲和力将酶 加以修饰标记。 加以修饰标记。
赖氨酸的氨基 天冬氨酸和谷氨酸的羧基 半胱氨酸的巯基 组氨酸的咪唑基 酪氨酸和丝氨酸的羟基
食品与生物工程学院 张海晖
二、活性中心的共性
(1)活性部位只占酶分子很小的一部分（ 2%）。 (1)活性部位只占酶分子很小的一部分（1-2%）。 活性部位只占酶分子很小的一部分 (2)活性部位是一个三维实体。 (2)活性部位是一个三维实体。 活性部位是一个三维实体 (3)活性中心位于酶分子表面的疏水性裂缝中。 (3)活性中心位于酶分子表面的疏水性裂缝中。 活性中心位于酶分子表面的疏水性裂缝中 (4)活性中心构象不是固定不变的（诱导契合）。 (4)活性中心构象不是固定不变的（诱导契合）。 活性中心构象不是固定不变的 (5)酶与底物通过盐键、氢键、范德华力和疏水作用 (5)酶与底物通过盐键、氢键、 酶与底物通过盐键 等次级键结合。 等次级键结合。
食品与生物工程学院 张海晖
差别标记： 差别标记：
化学修饰 底物或抑制剂存在 含同位素标记 去除底物或抑制剂 的同样试剂 原来被保护的基团带同位素标记 活性基团不与修饰剂作用
可直接得到蛋白质发挥功能作用的必需基团。 可直接得到蛋白质发挥功能作用的必需基团。
食品与生物工程学院 张海晖
2)专一性化学修饰（基团专一性修饰） 2)专一性化学修饰（基团专一性修饰） 专一性化学修饰
破坏了抗原决定簇——抗原性降低乃至消除 破坏了抗原决定簇 抗原性降低乃至消除 阻碍抗原、 “遮盖”了抗原决定簇——阻碍抗原、抗体结合 遮盖”了抗原决定簇 阻碍抗原
2.大分子修饰剂本身是多聚电荷体， 2.大分子修饰剂本身是多聚电荷体，能在酶分子表面形成 大分子修饰剂本身是多聚电荷体 “缓冲外壳”，抵御外界环境的极性变化，维持酶活性部 缓冲外壳” 抵御外界环境的极性变化， 位微环境相对稳定。 位微环境相对稳定。
食品与生物工程学院 张海晖
活性中心基团的鉴定标准
失活程度与修饰剂浓度成一定比例关系。 ①失活程度与修饰剂浓度成一定比例关系。 可逆抑制剂有保护作用 活性中心）。 有保护作用（ ②S或可逆抑制剂有保护作用（活性中心）。 先加S或竞Ⅰ 先加S或竞Ⅰ 除去S或竞Ⅰ 除去S或竞Ⅰ 加共价修饰剂 活性不丧失 透析
食品与生物工程学院 张海晖
修饰剂： 2. 修饰剂：
聚乙二醇（PEG）、右旋糖酐（dextran）、 聚乙二醇（PEG）、右旋糖酐（dextran）、 ）、右旋糖酐 肝素（heparin）、蔗糖聚合物（Ficoll）等。 肝素（heparin）、蔗糖聚合物（Ficoll） ）、蔗糖聚合物 修饰方法：修饰前活化，然后在一定条件下 修饰方法：修饰前活化， 与酶分子共价结合。 与酶分子共价结合。
用非专一性的修饰试剂与氨基酸侧链基团作用。 用非专一性的修饰试剂与氨基酸侧链基团作用。
若某基团修后： 若某基团修后：
(1)酶活性不变 (1)酶活性不变——该基团可能不是酶的必需基团 酶活性不变 该基团可能不是酶的必需基团 (2)酶活性降低或丧失 该基团可能是酶的必需基团, (2)酶活性降低或丧失——该基团可能是酶的必需基团,但 酶活性降低或丧失 该基团可能是酶的必需基团 同活性中心内的必需基团结合 不能确定化学试剂是同活性中心内的必需基团结合。 不能确定化学试剂是同活性中心内的必需基团结合。
X-Y
剂
Y
食品与生物工程学院 张海晖
3.蛋白质工程 3.蛋白质工程
将酶相应的cDNA定点突变， 将酶相应的cDNA定点突变， cDNA定点突变 突变的cDNA只表达一个或几个氨 突变的cDNA只表达一个或几个氨 cDNA 基酸被置换的酶蛋白， 基酸被置换的酶蛋白，测定其活 性可知被置换的氨基酸是否为活 力所必需。 力所必需。
食品与生物工程学院 张海晖
第三节 酶化学修饰的原理
如何增强酶天然构象的稳定性与耐热性 一、如何增强酶天然构象的稳定性与耐热性 修饰剂分子存在多个反应基团， 修饰剂分子存在多个反应基团，可与酶形成多 点交联。使酶的天然构象产生“刚性”结构。 点交联。使酶的天然构象产生“刚性”结构。
如何保护酶活性部位与抗抑制剂 二、如何保护酶活性部位与抗抑制剂 大分子修饰剂与酶结合后， 大分子修饰剂与酶结合后，产生的空间障碍或 静电斥力阻挡抑制剂， 遮盖”了酶的活性部位。 静电斥力阻挡抑制剂，“遮盖”了酶的活性部位。
2. 改变酶特性有两种主要的方法
1)通过分子修饰的方法来改变已分离出来的 1)通过分子修饰的方法来改变已分离出来的 天然酶的活性。 天然酶的活性。 2)通过基因工程方法改变编码酶分子的基因 2)通过基因工程方法改变编码酶分子的基因 而达到改造酶的目的。 而达到改造酶的目的。
食品与生物工程学院 张海晖
一、酶的表面化学修饰
（一）大分子修饰（大分子结合修饰） 大分子修饰（大分子结合修饰）
是目前应用最广的酶分子修饰方法。 是目前应用最广的酶分子修饰方法。 1.定义：利用水溶性大分子与酶结合 水溶性大分子与酶结合， 1.定义：利用水溶性大分子与酶结合，使酶的空间 定义 结构发生某些精细的改变， 结构发生某些精细的改变，从而改变酶的特性与功 能的方法。 能的方法。
食品与生物工程学院 张海晖
第二节 酶化学修饰及修饰目的
一、酶化学修饰 1.限制酶大规模应用的原因 1.限制酶大规模应用的原因 1)细胞外稳定性差； 1)细胞外稳定性差； 细胞外稳定性差 2)酶活性不够高； 2)酶活性不够高； 酶活性不够高 3)具有抗原性。 3)具有抗原性。 具有抗原性
食品与生物工程学院 张海晖
要注意—— 三、反应条件的选择 要注意 反应活性基团）3.修饰剂上反应基团的活化方法与 反应活性基团）3.修饰剂上反应基团的活化方法与
条件
1. 酶与修饰剂的分子比例 反应体系的溶剂性质、盐浓度、pH条件 2. 反应体系的溶剂性质、盐浓度、pH条件 3. 反应温度及时间
食品与生物工程学院 张海晖
第五节 酶化学修饰的种类及应用
食品与生物工程学院 张海晖
三、研究酶活性中心的方法
1.物理学方法 1.物理学方法 用X射线衍射法直接检测底物或其 类似物与酶形成的中间复合物（包括酶 类似物与酶形成的中间复合物（ 和底物）的相对位置。 和底物）的相对位置。
食品与生物工程学院 张海晖
2.化学修饰法 2.化学修饰法
1)非专一性化学修饰 1)非专一性化学修饰
食品与生物工程学院 张海晖
应用： 3. 应用：
如：PEG－超氧化物歧化酶（SOD） PEG－超氧化物歧化酶（SOD） PEG－溶血类蛋白质（链激酶、尿激酶等） PEG－溶血类蛋白质（链激酶、尿激酶等） PEG－天门冬酰胺酶（ASNase） PEG－天门冬酰胺酶（ASNase） • 消除了抗原性 • 延长了酶在体内的半衰期 又如： Dextran修饰α 淀粉酶， β－淀粉酶， 又如：用Dextran修饰α-淀粉酶， β－淀粉酶，胰蛋白 修饰 酶、过氧化氢酶，提高了酶的热稳定性。 过氧化氢酶，提高了酶的热稳定性。
食品与生物工程学院 张海晖
二、酶化学修饰的目的
1. 研究酶的结构与功能的关系。（50年代末） 研究酶的结构与功能的关系。 50年代末） 年代末 人为改变天然酶的某些性质， 2. 人为改变天然酶的某些性质，扩大酶的应用 范围。 70年代末之后） 范围。（70年代末之后） 年代末之后 1）提高酶的生物活性（酶活力）。 提高酶的生物活性（酶活力）。 2）增强酶的稳定性（热稳定性、体内半衰期）。 增强酶的稳定性（热稳定性、体内半衰期）。 3）消除抗原性（针对特异性反应降低生物识别能力）。 消除抗原性（针对特异性反应降低生物识别能力）。 4）产生新的催化能力。 产生新的催化能力。
食品与生物工程学院 张海晖
Y
结构相似， ①与S结构相似，与活性中心的氨基酸残基 结构相似 亲和力大， 亲和力大，而与活性中心以外的氨基酸 残基亲和力小。 残基亲和力小。
亲 和
Y
X
Y
修
Y
饰
②具有活泼的化学基团（如卤素）可 具有活泼的化学基团（如卤素） 与活性中心的基团形成稳定的共价键。 与活性中心的基团形成稳定的共价键。
第五章 酶分子的化学修饰
• 酶的活性中心 • 酶化学修饰的目的 • 酶化学修饰的原理 • 酶化学修饰的设计 • 酶化学修饰的应用
食品与生物工程学院 张海晖
活性中心的重要化学基团
7种氨基酸出现的频率最高
Lys Asp Glu Cys His 兰天果拌猪肉丝） （兰天果拌猪肉丝） Tyr Ser
某些功能基团, 某些功能基团,如（氨基、羧基、巯基、羟基 氨基、羧基、巯基、 和咪唑基）是酶的必需基团。 和咪唑基）是酶的必需基团。
食品与生物工程学院 张海晖
酶蛋白侧链基团修饰） （二）小分子修饰 （酶蛋白侧链基团修饰）
•定义：通过选择性的试剂或亲和标记试剂与酶分子侧链上特 定义： 定义 定的功能基团发生化学反应。 定的功能基团发生化学反应。 •侧链基团：组成蛋白质氨基酸残基上的功能团。 侧链基团：组成蛋白质氨基酸残基上的功能团。 侧链基团 主要有：氨基、羧基、胍基、巯基、酚基、咪唑基。 主要有：氨基、羧基、胍基、巯基、酚基、咪唑基。 •侧链基团修饰剂：采用的各种小分子化合物。 侧链基团修饰剂：采用的各种小分子化合物。 侧链基团修饰剂 20种不同氨基酸的侧链基团中只有极性氨基酸的侧链易被 20种不同氨基酸的侧链基团中只有极性氨基酸的侧链易被 种不同氨基酸的侧链基团中只有极性氨基酸 修饰，它们一般具有亲核性。 修饰，它们一般具有亲核性。
食品与生物工程学院 张海晖
3)亲和标记（位点专一性修饰） 3)亲和标记（位点专一性修饰） 亲和标记
采用的修饰试剂是根据底物的化学结构设计 合成的含有活泼反应基团的底物类似物。 合成的含有活泼反应基团的底物类似物。 作用机制： 作用机制：利用酶对底物的特殊亲和力将酶 加以修饰标记。 加以修饰标记。
赖氨酸的氨基 天冬氨酸和谷氨酸的羧基 半胱氨酸的巯基 组氨酸的咪唑基 酪氨酸和丝氨酸的羟基
食品与生物工程学院 张海晖
二、活性中心的共性
(1)活性部位只占酶分子很小的一部分（ 2%）。 (1)活性部位只占酶分子很小的一部分（1-2%）。 活性部位只占酶分子很小的一部分 (2)活性部位是一个三维实体。 (2)活性部位是一个三维实体。 活性部位是一个三维实体 (3)活性中心位于酶分子表面的疏水性裂缝中。 (3)活性中心位于酶分子表面的疏水性裂缝中。 活性中心位于酶分子表面的疏水性裂缝中 (4)活性中心构象不是固定不变的（诱导契合）。 (4)活性中心构象不是固定不变的（诱导契合）。 活性中心构象不是固定不变的 (5)酶与底物通过盐键、氢键、范德华力和疏水作用 (5)酶与底物通过盐键、氢键、 酶与底物通过盐键 等次级键结合。 等次级键结合。
食品与生物工程学院 张海晖
差别标记： 差别标记：
化学修饰 底物或抑制剂存在 含同位素标记 去除底物或抑制剂 的同样试剂 原来被保护的基团带同位素标记 活性基团不与修饰剂作用
可直接得到蛋白质发挥功能作用的必需基团。 可直接得到蛋白质发挥功能作用的必需基团。
食品与生物工程学院 张海晖
2)专一性化学修饰（基团专一性修饰） 2)专一性化学修饰（基团专一性修饰） 专一性化学修饰
破坏了抗原决定簇——抗原性降低乃至消除 破坏了抗原决定簇 抗原性降低乃至消除 阻碍抗原、 “遮盖”了抗原决定簇——阻碍抗原、抗体结合 遮盖”了抗原决定簇 阻碍抗原
2.大分子修饰剂本身是多聚电荷体， 2.大分子修饰剂本身是多聚电荷体，能在酶分子表面形成 大分子修饰剂本身是多聚电荷体 “缓冲外壳”，抵御外界环境的极性变化，维持酶活性部 缓冲外壳” 抵御外界环境的极性变化， 位微环境相对稳定。 位微环境相对稳定。
食品与生物工程学院 张海晖
活性中心基团的鉴定标准
失活程度与修饰剂浓度成一定比例关系。 ①失活程度与修饰剂浓度成一定比例关系。 可逆抑制剂有保护作用 活性中心）。 有保护作用（ ②S或可逆抑制剂有保护作用（活性中心）。 先加S或竞Ⅰ 先加S或竞Ⅰ 除去S或竞Ⅰ 除去S或竞Ⅰ 加共价修饰剂 活性不丧失 透析
食品与生物工程学院 张海晖
修饰剂： 2. 修饰剂：
聚乙二醇（PEG）、右旋糖酐（dextran）、 聚乙二醇（PEG）、右旋糖酐（dextran）、 ）、右旋糖酐 肝素（heparin）、蔗糖聚合物（Ficoll）等。 肝素（heparin）、蔗糖聚合物（Ficoll） ）、蔗糖聚合物 修饰方法：修饰前活化，然后在一定条件下 修饰方法：修饰前活化， 与酶分子共价结合。 与酶分子共价结合。
用非专一性的修饰试剂与氨基酸侧链基团作用。 用非专一性的修饰试剂与氨基酸侧链基团作用。
若某基团修后： 若某基团修后：
(1)酶活性不变 (1)酶活性不变——该基团可能不是酶的必需基团 酶活性不变 该基团可能不是酶的必需基团 (2)酶活性降低或丧失 该基团可能是酶的必需基团, (2)酶活性降低或丧失——该基团可能是酶的必需基团,但 酶活性降低或丧失 该基团可能是酶的必需基团 同活性中心内的必需基团结合 不能确定化学试剂是同活性中心内的必需基团结合。 不能确定化学试剂是同活性中心内的必需基团结合。
X-Y
剂
Y
食品与生物工程学院 张海晖
3.蛋白质工程 3.蛋白质工程
将酶相应的cDNA定点突变， 将酶相应的cDNA定点突变， cDNA定点突变 突变的cDNA只表达一个或几个氨 突变的cDNA只表达一个或几个氨 cDNA 基酸被置换的酶蛋白， 基酸被置换的酶蛋白，测定其活 性可知被置换的氨基酸是否为活 力所必需。 力所必需。
食品与生物工程学院 张海晖
第三节 酶化学修饰的原理
如何增强酶天然构象的稳定性与耐热性 一、如何增强酶天然构象的稳定性与耐热性 修饰剂分子存在多个反应基团， 修饰剂分子存在多个反应基团，可与酶形成多 点交联。使酶的天然构象产生“刚性”结构。 点交联。使酶的天然构象产生“刚性”结构。
如何保护酶活性部位与抗抑制剂 二、如何保护酶活性部位与抗抑制剂 大分子修饰剂与酶结合后， 大分子修饰剂与酶结合后，产生的空间障碍或 静电斥力阻挡抑制剂， 遮盖”了酶的活性部位。 静电斥力阻挡抑制剂，“遮盖”了酶的活性部位。
2. 改变酶特性有两种主要的方法
1)通过分子修饰的方法来改变已分离出来的 1)通过分子修饰的方法来改变已分离出来的 天然酶的活性。 天然酶的活性。 2)通过基因工程方法改变编码酶分子的基因 2)通过基因工程方法改变编码酶分子的基因 而达到改造酶的目的。 而达到改造酶的目的。
食品与生物工程学院 张海晖
一、酶的表面化学修饰
（一）大分子修饰（大分子结合修饰） 大分子修饰（大分子结合修饰）
是目前应用最广的酶分子修饰方法。 是目前应用最广的酶分子修饰方法。 1.定义：利用水溶性大分子与酶结合 水溶性大分子与酶结合， 1.定义：利用水溶性大分子与酶结合，使酶的空间 定义 结构发生某些精细的改变， 结构发生某些精细的改变，从而改变酶的特性与功 能的方法。 能的方法。
食品与生物工程学院 张海晖
第二节 酶化学修饰及修饰目的
一、酶化学修饰 1.限制酶大规模应用的原因 1.限制酶大规模应用的原因 1)细胞外稳定性差； 1)细胞外稳定性差； 细胞外稳定性差 2)酶活性不够高； 2)酶活性不够高； 酶活性不够高 3)具有抗原性。 3)具有抗原性。 具有抗原性
食品与生物工程学院 张海晖
要注意—— 三、反应条件的选择 要注意 反应活性基团）3.修饰剂上反应基团的活化方法与 反应活性基团）3.修饰剂上反应基团的活化方法与
条件
1. 酶与修饰剂的分子比例 反应体系的溶剂性质、盐浓度、pH条件 2. 反应体系的溶剂性质、盐浓度、pH条件 3. 反应温度及时间
食品与生物工程学院 张海晖
第五节 酶化学修饰的种类及应用
食品与生物工程学院 张海晖
三、研究酶活性中心的方法
1.物理学方法 1.物理学方法 用X射线衍射法直接检测底物或其 类似物与酶形成的中间复合物（包括酶 类似物与酶形成的中间复合物（ 和底物）的相对位置。 和底物）的相对位置。
食品与生物工程学院 张海晖
2.化学修饰法 2.化学修饰法
1)非专一性化学修饰 1)非专一性化学修饰
食品与生物工程学院 张海晖
应用： 3. 应用：
如：PEG－超氧化物歧化酶（SOD） PEG－超氧化物歧化酶（SOD） PEG－溶血类蛋白质（链激酶、尿激酶等） PEG－溶血类蛋白质（链激酶、尿激酶等） PEG－天门冬酰胺酶（ASNase） PEG－天门冬酰胺酶（ASNase） • 消除了抗原性 • 延长了酶在体内的半衰期 又如： Dextran修饰α 淀粉酶， β－淀粉酶， 又如：用Dextran修饰α-淀粉酶， β－淀粉酶，胰蛋白 修饰 酶、过氧化氢酶，提高了酶的热稳定性。 过氧化氢酶，提高了酶的热稳定性。
食品与生物工程学院 张海晖
二、酶化学修饰的目的
1. 研究酶的结构与功能的关系。（50年代末） 研究酶的结构与功能的关系。 50年代末） 年代末 人为改变天然酶的某些性质， 2. 人为改变天然酶的某些性质，扩大酶的应用 范围。 70年代末之后） 范围。（70年代末之后） 年代末之后 1）提高酶的生物活性（酶活力）。 提高酶的生物活性（酶活力）。 2）增强酶的稳定性（热稳定性、体内半衰期）。 增强酶的稳定性（热稳定性、体内半衰期）。 3）消除抗原性（针对特异性反应降低生物识别能力）。 消除抗原性（针对特异性反应降低生物识别能力）。 4）产生新的催化能力。 产生新的催化能力。
食品与生物工程学院 张海晖
Y
结构相似， ①与S结构相似，与活性中心的氨基酸残基 结构相似 亲和力大， 亲和力大，而与活性中心以外的氨基酸 残基亲和力小。 残基亲和力小。
亲 和
Y
X
Y
修
Y
饰
②具有活泼的化学基团（如卤素）可 具有活泼的化学基团（如卤素） 与活性中心的基团形成稳定的共价键。 与活性中心的基团形成稳定的共价键。
第五章 酶分子的化学修饰
• 酶的活性中心 • 酶化学修饰的目的 • 酶化学修饰的原理 • 酶化学修饰的设计 • 酶化学修饰的应用
食品与生物工程学院 张海晖
活性中心的重要化学基团
7种氨基酸出现的频率最高
Lys Asp Glu Cys His 兰天果拌猪肉丝） （兰天果拌猪肉丝） Tyr Ser
某些功能基团, 某些功能基团,如（氨基、羧基、巯基、羟基 氨基、羧基、巯基、 和咪唑基）是酶的必需基团。 和咪唑基）是酶的必需基团。
食品与生物工程学院 张海晖
酶蛋白侧链基团修饰） （二）小分子修饰 （酶蛋白侧链基团修饰）
•定义：通过选择性的试剂或亲和标记试剂与酶分子侧链上特 定义： 定义 定的功能基团发生化学反应。 定的功能基团发生化学反应。 •侧链基团：组成蛋白质氨基酸残基上的功能团。 侧链基团：组成蛋白质氨基酸残基上的功能团。 侧链基团 主要有：氨基、羧基、胍基、巯基、酚基、咪唑基。 主要有：氨基、羧基、胍基、巯基、酚基、咪唑基。 •侧链基团修饰剂：采用的各种小分子化合物。 侧链基团修饰剂：采用的各种小分子化合物。 侧链基团修饰剂 20种不同氨基酸的侧链基团中只有极性氨基酸的侧链易被 20种不同氨基酸的侧链基团中只有极性氨基酸的侧链易被 种不同氨基酸的侧链基团中只有极性氨基酸 修饰，它们一般具有亲核性。 修饰，它们一般具有亲核性。
食品与生物工程学院 张海晖