基因工程概论

连接产物

●重组分子

●未连接的载体分子

●未连接的D N A片段

●载体的自连

●含有错误插入片段的重组D N A分子

1转化—细菌吸收D N A的方式

自然界中，转化并不是细菌获取遗传信息的主要方式。

细菌必须经过物理或化学处理后可提高吸收D N A的能力，经过这样处理的细菌称为感受态。

1.1大肠杆菌感受态的制备

●感受态细胞(Competent cells):

受体细胞经过一些特殊方法的处理后，细胞膜的通透性发生变化，成为能容许有外源DNA的载体分子通过的感受态细胞(competent cell) 。

1.1大肠杆菌感受态的制备

●在冷的盐溶液中转化效率提高。一般利用50m M的C a C l2，或者氯化铷。

–原理：与细菌外膜磷脂在低温下形成液晶结构，并发生收缩，使细胞膜出现孔隙。

●42°C热激处理。

1.2筛选转化细胞

1n g的p U C8可以产生1000-10000个转化子，意味着只吸收了0.01%的D N A分子。

1.3其他的转化方法

●电穿孔驱动的完整细胞转化（电激转化法）

●接合转化

●微注射法

●λ噬菌体的转染

●P E G介导的细菌原生质体转化

1.3其他的转化方法

●电激转化

–受体细胞在脉冲电场作用下，细胞壁上形成一些微孔通道，使得D N A分子直接与裸露的细胞膜脂双层结构接触，并引发吸收过程。

–可以转化较大的质粒，适用于所有的细菌。

1.3其他的转化方法

●接合转化

–是由接合型质粒完成的。

–涉及到三种菌株的混合：受体菌、含有接合质粒的辅助菌以及含有待转化重组质粒的供体菌。

–重组质粒和接合质粒必须有相容性。

1.3其他的转化方法

●P E G介导的细菌原生质体转化

–高渗溶液中细菌培养至对数生长期

–溶菌酶的等渗液处理，形成原生质体。

–加入D N A样品和聚乙二醇等渗液

–离心除去聚乙二醇，固体培养。

●适用于芽孢杆菌和链霉菌等革兰氏阳性菌、酵母、霉菌甚至植物。

表5-1大肠杆菌5种常用转化方法的比较

2重组子的鉴定

●利用插入失活选择p B R322重组

●载体：含有β-半乳糖苷酶基因l a c Z的调控序列和头146个a a的编码序列

●宿主：缺失了l a c Z’基因，可编码β-半乳糖苷酶C端序列

●α-互补：l a c Z基因上缺失近操纵基因区段的突变体可以与带有完整的近操纵基因区段的β-

半乳糖苷酶隐性突变体之间实现互补。

●转染：是将纯化的噬菌体D N A通过热激的方法转化感受态大肠杆菌的过程。

●体外装配i n v i t r o p a c k a g i n g：将重组的λ分子装配成头-尾结构的病毒粒子。

●体外装配

–c o s位点突变的噬菌体的单品系系统

–另一种系统需要两种缺陷品系。一个是基因D的突变体，另一个是基因E的突变体。

3.1噬菌斑

●λ形成的是真正的噬菌斑。

●M13引起细菌生长的减慢，而使细菌的浓度低于周围细胞。

4重组噬菌体的鉴定

●利用插入失活鉴定

●λ噬菌体的c I基因的插入失活

●利用S p i表型选择

●根据λ基因组的大小筛选

4.1利用插入失活鉴定

4.2λ噬菌体的c I基因的插入失活

4.3利用S p i表型选择

4.4根据λ基因组的大小筛选

λ装配系统，只有37k b-52k b的D N A分子可以进入头部结构。

思考题

●α-互补的原理

●转化的方法

●感受态

●P h a g e的转化方法

●选择重组子的方法

农业，更专业的讲是植物生产，是世界上最早的生物技术，可以追溯到10000年以前。

?最初几千年，作物的改良是以零星的方式进行的。

?最近几个世纪，品种的改进是通过育种程序进行的。

1转基因的主要方法

根癌农杆菌法(X a21)

转基因植物中80%；遗传稳定性较好。

基因枪法(B t,X a21）

约10%，转化频率较高，但遗传稳定性较差，是叶绿体、线粒体D N A遗传转化的首选方法。 花粉管通道法(中国抗虫棉)

小于10%，中国80%以上，该方法经济方便。

2植物性状改良的策略

基因附加（g e n e a d d i t i o n)：通过添加1个或多个基因改变植物的性状。

基因消减(g e n e s u b t r a c t i o n)：利用基因工程技术使一个或多个植物已经存在的基因失活。

2.1抗虫转基因植物的培育

研究目的意义及进展

研究方案

研究结果

昆虫是在农业生产中危害最严重的生物逆境。

传统杀虫剂和理想杀虫剂

?选择性

?容易降解

?保护整个植株

苏云金杆菌的δ-内毒素

苏云金杆菌的δ-内毒素

?苏云金杆菌在孢子形成过程中，细胞内形成杀虫晶体蛋白—称为δ-内毒素，其活性很强，要比有机磷毒性高80000倍。

表14-1不同δ-内毒素的杀虫范围

苏云金杆菌的δ-内毒素

1904年作为无公害的杀虫剂使用，易降解。

利用蛋白质工程，修饰其蛋白结构使其更加稳定。

通过基因工程使植物合成毒素。

转基因的鉴定

分子鉴定

P C R鉴定

免疫技术鉴定转基因植株是否合成了δ-内毒素。

?转基因植株中产生δ-内毒素250-1750n g/m g。

转基因植株是否对玉米螟有抗性呢？

?害虫对植株总的危害

?虫道的长度

对照虫道长度40.7c m,转基因植株虫道只有6.3c m。

2.2基因消减

反义技术的原理

延长货架期的工程番茄

?

F L A V R S A V R T M

2.2.1反义技术的原理

反义技术（a n t i s e n s e）

?将克隆的基因反向插入表达载体中，转录成m R N A后，与正义的m R N A是反向互补的。这种反向互补为反义R N A，缩写为a s R N A。

基因克隆

?1980s中期，I C I种子公司生物技术部与N o t t i n g h a n大学合作，从多聚半乳糖醛酸酶基因的5’端克隆了一个730b p的限制性片段，包含一半的编码序列.

表达载体构建（反义）

?p B I N19质粒，C a M V启动子

遗传转化

?重组p B I N19分子转化根癌农杆菌，用来侵染番茄茎段，k a n筛选转化子。

转基因植物的分子鉴定：

S o u t h e r n杂交检测反义基因

N o r t h e r n杂交检测反义基因的转录

?单链探针

反义基因对正义多聚半乳糖醛酸酶基因表达量的影响

?正义m R N A表达量

转基因植物的田间鉴定

聚丙烯酰胺凝胶电泳结果显示，多聚半乳糖醛酸酶的表达量明显降低。

表型鉴定

?转基因果实虽然也在逐渐的成熟，但存放时间明显延长。

?反义R N A不能完全将多聚半乳糖醛酸酶基因失活，但可以有效的降低基因的表达量，延缓成熟过程。

表14－2反义R N A技术的应用

思考题

植物基因改良的策略？

反义R N A技术的基本原理？

转基因植物的鉴定方法？

植物基因工程的基本步骤

第二代抗虫玉米是如何培育的？

3植物基因工程的应用、进展

植物基因工程的应用

G M O的产业化现状

品种改良典型事例

3.1植物基因工程的应用

利用报告基因研究植物基因的表达与调控

利用转座元件、T-D N A插入失活克隆植物基因

利用转基因植物生产重组异源蛋白质

改良植物品种

基因表达与调控的研究

报告基因研究植物基因的表达与调控

植物报告基因

?大肠杆菌的β－葡萄糖苷酸酶（G U S）

底物：X-G l u c

?昆虫的荧光素酶基因

底物：昆虫荧光素、A T P A M P,C O2,光

T-D N A插入克隆基因

利用转座元件克隆植物基因

实质是创造突变体

作为生物反应器生产外源蛋白质

异源蛋白药物

?烟草生产医用血清蛋白；

?蚕丝纤维基因转入棉花，生产动物纤维

食用或工业用油

?制造肥皂和去垢剂的月桂酸

高分子材料

?可降解的聚羟丁酯塑料（P H B）及天然棉花与聚酯的混合纤维等

改良植物品种

延迟果实成熟

抗虫

抗病

耐除草剂

改变花型及花色

抗非生物胁迫

提高品质

雄性不育

3.3改良植物品种

延迟果实成熟

?反义技术控制乙烯的合成与信号传导

?半乳糖醛酸酶（P G）

3.3改良植物品种

强化表达除草剂的靶蛋白（酶）基因

?少数除草剂的靶部位被鉴定。5-烯醇式为酸基莽草酸－3－磷酸盐合成酶（E P S P S），是植物叶绿体中芳香族必需氨基酸合成中的一个酶，除草剂g l y p h o s a t e（g l i f o s e i t）抑制该酶而杀死植物的。

?g l y p h o s a t e在除草剂中使用最为广泛。因为它很少的剂量就能杀灭广谱杂草，对环境的

危害也比其它除草剂小，进入土壤后能被微生物迅速降解。

3.3改良植物品种

强化表达除草剂的靶蛋白（酶）基因

?将来自矮牵牛花的E P S P S c D N A转入植物中，转基因酶活比非转基因植物提高了20倍，使得转基因植物较好地耐受g l y p h o s a t e的存在。但转基因植物生长缓慢。

3.3改良植物品种

克隆表达除草剂的突变靶蛋白（酶）基因

?K l e b s i e l l a p n e u m o n i a e中的E P S P S对草甘磷亲和性降低了16倍

?鼠伤寒沙门氏杆菌(S a l m o n e l l a t y p h i m u r i u m)分离出了一个E P S P S突变体，转入烟草，表现出了较好的耐性

?M o n s a n t o公司的K i s h o r e在E.c o l i分离出了一个突变体S M-1，对草甘磷的耐性提高了8000倍。

3.3改良植物品种

除草剂的降解、解毒基因

?溴腈衍生物（B r o m o x y n i l）是一种抑制光合成反应的除草剂，K l e b s i e l l a o z a e n a e有一基因编码一种腈水解酶，能将B r o m o x y n i l降解为3,5－二溴－4羟－苯甲酸。将该细菌基因转入烟草中已获成功。

3.3改良植物品种

改变花型、花色

?在黄酮类色素物质的生物合成途径中，苯基苯乙烯酮合成酶（C H S）是一个关键酶。

3.3改良植物品种

改变花型、花色

?天然的玫瑰没有蓝色的花冠，因为蔷薇科植物缺少合成蓝色色素的酶系，从矮牵牛花中克隆了一个控制合成蓝色素的基因（3’,5’-羟氧化酶）。期望培育出蓝色的玫瑰。

3.3改良植物品种

抗非生物胁迫

?抗冻蛋白（a n t i f r e e z e p r o t e i n,A F P）

?脯氨酸合成酶

?甜菜碱合成酶

?渗调蛋白（o s m o t i n,O S M）

?乙醇脱氢酶

3.3改良植物品种

改良作物的品质

?植物淀粉合成的控制

?油科植物中脂肪酸合成的控制

?植物种子储存蛋白合成的控制

?植物甜味剂合成的控制

3.3改良植物品种

植物淀粉合成的控制：

?淀粉由直链淀粉与支链淀粉组成，淀粉的质量与淀粉的组成有关。

淀粉合成酶（G B S S）控制直链淀粉合成

分支酶（B E）控制支链淀粉的合成

3.3改良植物品种

油科植物中脂肪酸合成的控制

?人造黄油的工艺是将植物油催化加氢，使其熔点升高，加工成本很高，并且会导致顺式双链变成对健康不利的反式双链。

?将植物内控制脱饱和反应的硬脂酰－A C P脱饱和酶基因的反义基因导入植物中，即可有效地提高饱和脂肪酸的含量。

3.3改良植物品种

植物甜味剂合成的控制

?M o n e l l i n（莫内林）是一种甜味蛋白，来自一种西非灌木植物。相同分子浓度下，它的甜度为蔗糖的10万倍。莫内林是一二聚体。A链45a a，B链50a a。两条链一分开，甜味即消失。限制了它作为食品添加剂的使用。

3.3改良植物品种

雄性不育

?绒毡层特异表达基因

拟南芥A G

烟草T A29

金鱼草t a p2基因

番茄108、92b基因

?R N a s e基因

3.3品种改良典型事例

1抗除草剂，高不饱和脂肪酸含量的转基因大豆

2耐储藏西红柿

3转富铁基因的金米水稻

4转人的血清蛋白的烟草

5转X a21基因抗白叶枯病的明恢63恢复系的选育

6转X a4,X a5,X a13及X a21的多个抗性基因的累加系的选育

7抗虫玉米、棉花

8终结者技术

特殊性状的遗传利用限制技术

4转基因植物的安全性

转基因植物的大面积应用，在解决资源短缺、环境恶化、效益衰退三大难题中显示了越来越重要作用。

G M O的安全性

普斯陶伊事件

1998年,英国R o w e t t研究所的P u s z t a i宣称用转G N A基因的马铃薯饲喂大鼠,“导致大鼠体重及器官重量严重减轻,免疫系统被损坏”。制造了著名的“P u s z t a i事件”,进而在世界范围内引发了转基因作物安全性的争论。

斑蝶事件

1999年5月20日L o s e y等在《N a t u r e》发表了题为“转基因花粉对大斑蝶幼虫有害”的研究报告。

?饲养在撒有B t玉米花粉的马利筋叶片上的大斑蝶幼虫取食量减小、生长延缓且死亡率更高。

B t玉米的种植面积增加了40%,但与此同时大斑蝶的种群也增加了30%。

《N a t u r e》有关转基因玉米生态安全争论性报道的回顾

陈茂叶恭银胡萃

(浙江大学应用昆虫学研究所,杭州310029)

生态学杂志C h i n e s e J o u r n a l o f E c o l o g y2004,23(2):80～85

G M O潜在的危险性

转基因作物本身可能变为杂草或通过杂交等方式使野生种变为杂草。

标记基因扩散到物种中而造成生态失衡

转基因食品的基因及其产物可能对人或动物健康有害。

标记基因可能转移到人或动物肠道寄生菌中而产生抗药性

4.1选择标记的安全性

标记基因是否有害

食品中的k a n抗性基因是否能传给人体肠道中的细菌？

k a n抗性基因能否传给环境中的其他生物，导致生态系统的破坏？

4.1选择性标记的安全性

乐观观点：

食品中的k a n抗性基因与肠道中的细菌接触之前已被消化，即使部分未被破坏，转化的机率很低。

k a n抗性基因在自然中早已存在。

4.1选择性标记的安全性

安全的选择标记基因

?激素代谢基因：i p t异戊烯基转移酶；i a a H吲哚-3-乙酰胺水解酶。

?糖代谢基因：甘露糖磷酸异构酶p m i和木糖异构酶x y l A。

无标记转化系统

4.2对环境危害的可能性

工程植株的新基因组可能影响环境。

?含有植物所合成的蛋白质外壳和侵染病毒的基因组的杂交病毒。

在允许转基因植物释放之前，必须进行安全性评价。保证产品向环境中的释放是安全的，产品的消费也是安全的。

转基因是一项新技术，在研究和产业化的管理和审批上采取谨慎的做法是必要的，但这种谨慎应该以科学为根据，应该以促进发展为出发点。如果审批程序过于繁琐，不科学地设卡，作茧自缚，就会限制扼杀转基因技术在我国的发展，失去让转基因技术造福于我国的良机。

--张启发

思考题

结合专业特点，谈谈基因工程在本学科中的应用前景

基因工程在作物品种改良中的应用

选择标记基因潜在的危险性

C h a p t e r6常用的克隆载体

内容

?基于大肠杆菌的克隆载体

?基于噬菌体的克隆载体

?大容量的克隆载体

?酵母的克隆载体

?高等植物的克隆载体

第一节基于大肠杆菌的克隆载体

最早使用的三个“天然”的质粒---p S C101、C o l E1、R S F2124。需要进行改造：

?删除一些不必要的D N A区域

?灭活某些质粒的编码基因

?加入易于识别的选择性标记

?在选择标记基因内引入多克隆位点

?加装特殊的基因表达调控元件。

1大肠杆菌的质粒

?最早构建的载体，也是应用最广泛的载体是p B R322。

1以大肠杆菌为基础的质粒

?p B R322的优点：

?容易纯化（a m/P s t I,P v u I,S a c I，T c/B a m H I,H i n d I I I)

?较高的转化效率

?具有可以便利选择的标记基因

?具有克隆大片段D N A的能力。

?可以以多拷贝存在

p B R322的系谱

2其它大肠杆菌克隆载体质粒

?p B R327一个多拷贝质粒

?p U C8—L a c选择质粒

?p G E M3Z-D N A的体外转录载体

2其他的大肠杆菌克隆载体质粒

?p B R327

?每个细胞中含有30-45个拷贝。

?剪切破坏了p B R322的接合能力，消除了潜在的危险性。

第二节基于噬菌体的克隆载体

1M13噬菌体为基础的克隆载体

?M13可以提供单链的克隆D N A。

?正常的M13噬菌体D N A长6.4k b，只能插入507b p的D N A片段。

1.1载体M13m p2的构建

?引入l a c Z’基因，产生了M13m p1。

?起始端有G C A T T C，通过体外定点突变获得了一个E c o R I位点，产生了M13m p2。第六个密码子

由天冬酰胺代替了天冬氨酸。

1.2M13m p7—对称的克隆位点

合成短的多聚核苷酸p o l y l i n k e r，含一系列的限制性位点和E c o R I粘端，将多聚接头插入到M13m p2的E c o R I位点上，就产生了M13m p7。M13m p7就含有了E c o R I,B a m H I，S a l I,P s t I 等位点。

1.2M13m p7—对称的克隆位点

?M13m p7最大优点：具有对称的克隆位点，可通过一种酶将插入片段切下来。

1.3更复杂M13载体

这些载体有更复杂的多聚接头插入l a c Z’基因，可以插入不同粘端的片段。如M13m p8和

M13m p9。在D N A测序中有重要作用。成对的载体还有M13m p10/M13m p11，M13m p18/M13m p19等。

2质粒-M13杂交载体

?M13载体只能插入1500b p的D N A片段，偶尔可插入3k b的片段。

2质粒-M13杂交载体

?噬菌粒：p E M B L8,在p U C8中插入了一个1300b p的M13基因组。含有将双链分子转化为单链分

子的酶识别位点。

?可以以质粒的形式复制

?也可以包装，以噬菌体的方式复制。

?p E M B L8可克隆10k b的D N A片段。

3以λ噬菌体为基础的克隆载体

?需要解决的问题：

?λD N A分子只能增加5%的大小，意味着只能插入3k b的D N A分子。

?每种限制性酶具有多个识别位点。

3.1可切除的λ片段

分子中央有大量可切除的片段，使分子减少为15k b，可以插入18k b的外源分子。

非必需序列包括整合和切下噬菌体的大部分基因。经过修饰的λ基因组可发生裂解循环。

3.2限制性位点的缺失

?一个或2个位点可用体外突变的方法改造。

?多个位点通过自然选择法改造。

?自然选择法是用p h a g e侵染能产生E c o R I的E.c o l i。

3.3λ克隆载体

?插入型载体

改造后的长度为37k b，允许插入片段最大为13.9k b（54.9-37k b）

?取代型载体

改造后的长度约为40k b，在非必需区域内含有两个相同的酶切口（如E c o R I、H i n d I I I、或s a l I），距离为14k b长，可用外源D N A片段取代。其载装下限为10.4而上限为25.5k b。

3.3λ克隆载体

?插入型载体

?λg t10，可以携带8k b的D N A分子，插入点位于c I基因内的E c o R I。插入失活鉴定。

?λZ A P I I，含多聚接头，可插入约10k b D N A分子，通过l a c Z’基因的插入失活鉴定重组子。

3.3λ克隆载体

?取代型载体

?λW E S.λB’，两个E c o R I位点跨越替换区域，根据分子大小筛选重组子。

?λE M B L4，可插入20k b的分子，可利用E c o R I、B a m H I、S a l I替换填充片段。重组子的筛选

可以根据片段的大小也可利用S p i表现型。

3.4利用插入载体和替换载体克隆

?转染法（环状）

?体外装配（线状）

3.4利用插入载体和替换载体克隆

?纯化载体的两个臂。

?将克隆D N A分子与左臂和右臂混合构建重组分子。

?连接后产生了左臂—D N A—右臂的多个重复，在体外装配过程中就从c o s位点切开，产生重组

子。

?侵染大肠杆菌。

第三节大容量的克隆载体

1粘粒

粘粒（c o s m i d)是噬菌体D N A和细菌质粒的杂合体，含有噬菌体的c o s位点。依据：体外装配不仅能装配λ基因组，任何含c o s位点的，37-52k b的D N A分子都可装配。

1.1粘粒克隆

?粘粒是含有c o s位点的质粒，他还需要选择标记，一个复制起始位点。

?粘粒缺失了λ的所有基因，因此不能形成噬菌斑，而只能形成克隆。

?常用c o s m i d:p H C79,p I B8,p K U206

2大容量λ和其他类型的载体

?替换载体如λE M B L4可以插入20k b的片段。

?粘粒可携带40k b。

?质粒8k b。

?M13小于3k b。

?基因文库：将生物的基因组D N A用合适的限制内切酶把D N A切割成适宜的大小，再把这些片段

与载体一一结合起来，形成重组D N A分子，最后将重组质粒全部引入受体菌中，包含生物基因组的全部D N A片段的一个细菌群就是一个基因文库。

?图书馆：基因文库；

?一本书：一个细菌（噬菌体）；

?一个书页：一个重组质粒；

?段落章节：基因；

?文章（字）：D N A序列

?基因组文库：核D N A建成的文库。c D N A文库：用c D N A建成的文库。

4大容量的克隆载体

?建立一个基因文库需要克隆的数目，可以通过下面的公式计算：

?N=l n(1-P)/l n(1-a/b)

?N=所需要的克隆数

?P=可能性，一般用95%的可能性

?a=插入载体的D N A片段的平均大小

?b=整个基因组的大小

大容量的克隆载体

大容量的克隆载体

?以P1为基础的粘粒，可插入70-100k b的D N A分子，可将人类基因文库克隆数目257000个（λ

粘粒）降低到90000个。

?细菌人工染色体或者B A C s，可以插入300k b的片段，只需要30000个克隆就可以建立人类的基

因文库。

?Y A C s可以克隆600k b的片段，特殊的类型可以携带1400k b片段，可以将人类基因文库的克隆

数降至6500个。

思考题

?常用的克隆载体的类型、特点及其克隆外源D N A的大小

?基因文库，构建基因文库所需的克隆的数目

?C o s m i d,p h a m i d,Y A C,B A C

?P h a g e D N A转化的方法

第四节酵母克隆载体

1酵母和其他真菌的载体

酵母除了酿酒和生产面包外，也被用来生产药物。在酵母S.c e r e v i s i a e发现了一个2μm环状的分子。

1.12μm质粒的选择标记

?2μm质粒6k b，拷贝数在70-200之间，含有编码蛋白质的基因R E P1,R E P2。

?一般使用编码氨基酸合成的酶作为标记，如L E U2基因编码β-异丙基苹果酸脱氢酶，参与丙

酮酸向亮氨酸的转化。

?寄主必须是L E U2营养缺陷体。

1.2酵母附加质粒

?来自于2μm质粒的载体称为酵母附加载体(Y E p s)。Y E p s可含完整的2μm质粒，也可只含2

μm质粒的复制起点，如Y E p13。

?很难从转化的重组克隆中将重组D N A分子提取出来。对Y E p13不存在问题。

Y E p13是一个穿梭质粒，含2μm质粒的复制起点和选择基因L E U2,Y E p13还包含p B R322的完整序列。

1.3Y E p可以插入酵母的染色体D N A

Y E p13质粒中L E U2基因可以与染色体上突变的L E U2基因进行重组，将整个质粒插入到酵母染色体内，可以一直保持整合状态，也可以切下来。

2其他类型的克隆载体

?酵母整合质粒(Y I p s)：

?酵母复制质粒(Y R p s)：

2.1其他类型的克隆载体

?酵母整合质粒(Y I p s)：在细菌质粒含有一个酵母基因。缺少酵母的复制起点。

?Y I p5，是在p B R322的基础上插入了一个U R A3基因，这个基因编码乳清酸核苷-5’-磷酸脱

羧酶，是嘧啶合成中的一个酶，可以作为选择标记，选择的方法与L E U2标记相同，Y I p不能像质粒一样复制。

2.2其他类型的克隆载体

?酵母复制质粒(Y R p s)：含有一段包括起始位点在内的染色体D N A,可以作为独立质粒进行复

制。复制起始位点与多个酵母基因距离很近，包括作为选择标记的基因。

?Y R p7由p B R322与酵母基因T R P1组成，T R P1参与色氨酸的合成，他与起始位点的距离非常

近，插入Y R p7的酵母D N A片段包括T R P1和复制起始位点。

2.2其他类型的克隆载体

?实验中质粒的选用需要考虑三个因素：

?转化频率

?拷贝数

?稳定性

?转化频率:也就是每μg的质粒D N A可获得转化子的数目。

?Y E p s可获得10000-100000转化细胞

?Y R p s可产生1000-10000个转化细胞

?Y I p产量较低，一般少于1000个，如果不是用特殊的程序，只能产生1-10个重组子。

?拷贝数

?Y E p s和Y R p s含有的拷贝数也最多，每个细胞中含有20-50和5-100个

?Y I p s一般只以单个拷贝存在于细胞中

?稳定性

?Y I p s能产生稳定的重组子

?Y R p重组子是非常不稳定的，母细胞中聚集大量的重组分子，但在子代中就可能丢失，

Y E p也有同样的问题。

3人工染色体

?染色体的主要组成如下：

?着丝点

?两个端粒：存在于染色体的末端，使染色体正确的结束复制，防止染色体被外切酶撕咬

?复制起始位点

1.5.1Y A C载体的结构和应用

?p Y A C3是在p B R322基础上插入酵母基因构建而成的。如U R A3和T R P1。

?携带T R P1的同时也包含一个复制起点

?在p Y A C3中这一片段扩展到C E N4。T R P1-o r i g i n—C E N4片段已经包含了人工染色体组成三

部分中的两部分。

Y A C载体的结构和应用

?第三部分端粒，有两段称为T E L的序列提供。

?S U P4，作为插入片段的选择标记基因。

Y A C载体的结构和应用

?利用p Y A C3克隆的策略如下：

?载体首先被B a m H I和S n a B I酶切将分子切成三块，B a m H I片段被去掉，剩下两个臂都以T E L

作为末端，另一端是S n a B I位点。

?克隆的D N A必须是平端(S n a B I是一个平端酶，识别序列是T A C G T A)被连接在两个臂的中

间就产生了人工染色体。

?利用原生质转化法将人工染色体引入酵母。受体酵母是利用一个双营养缺陷体

t r p1-u r a3。

?转化后于基本培养基上培养。插入片段的鉴定可以通过S U P4基因的插入失活，白色的克

隆是重组子，红色的不是。

3Y A C载体的应用

?最早人工染色体的目的是研究不同染色体结构和行为。

?可作为载体克隆大片段D N A。

?某些情况下，Y A C s可在哺乳动物中表达。

?Y A C s可以克隆600k b的片段，特殊类型可携带1400k b片段，可将人类基因文库的克隆数降至

6500个。

?一些哺乳动物的基因大于100k b（如人类膀胱纤维基因有250k b）正好在Y A C载体的范围之内。4其它酵母和真菌的载体

?2u m的附加体质粒只能在少数酵母中复制。

?整合质粒Y I p s，可在生物反应器中生长很长的时间。

?现在已经有许多高效的整合质粒满足不同的酵母使用，如P i c h i a p a s t o r i s和K l u v e r o m y c e s

l a c t i s,和丝状真菌A s p e r g i l l u s n i d u l a n s和N e u r o s p o r a c r a s s a。

第五节高等植物的克隆载体

高等植物的克隆载体

?农杆菌质粒

?基因直接转移

?以病毒为基础的载体

1高等植物的克隆载体

?根癌农杆菌

?根癌农杆菌可在许多双子叶植物中导致冠瘿病的形成。冠瘿瘤的形成是由于T i(t u m o r

i n d u c i n g)质粒导致的。侵染后，一部分分子将整合到植物的染色体D N A中，这一片段称

为T-D N A，大约有15k b-30k b。T-D N A有大约8个基因在植物中表达，产生冠瘿瘤。

?冠瘿碱有四种类型：

?章鱼碱（o c t o p i n e）

?胭脂碱（n o p a l i n e）

?农杆碱（a g r o p i n e）

?琥珀碱（s u c c i n a m o p i n e）

1.1T i质粒

?T i质粒分为4个区

?T-D N A区

?V i r区（V i r u l e n c e r e g i o n)

?C o n区（r e g i o n e n c o d i n g c o n j u g a t i o n)

?O r i区（o r i g i n o f r e p l i c a t i o n)

T i质粒

?利用T i质粒将新的基因引入植物

?将基因插入T-D N A中，细菌就可以将它整合到植物的染色体D N A中。

?问题：

?T i质粒分子太大。

?200k b的分子中无法找到单一切点的酶。

1.2利用T i质粒将新的基因引入植物

?双元载体策略

?共整合策略

1.3利用T i质粒获得转基因植物

?侵染培养的植物细胞或者原生质体，从转化细胞再生的植株每一个将含有克隆的基因，并将

基因传给下一代。

?只有利用“卸甲”的T i质粒才能获得转基因植株，而不形成冠瘿瘤。

1.3利用T i质粒获得转基因植物

?双元载体p B I N19

?T-D N A左右两端跨越着L a c Z’基因

?K a n抗性基因，作为选择标记。

?首先将重组质粒转入细菌大肠杆菌，鉴定正确的重组子，然后将其转入农杆菌和植物，通过

k a n筛选转基因植株。

?R i质粒和T i质粒非常相似，主要的区别在于R i质粒的T-D N A转入植物后并不导致冠瘿碱的形

成，而是形成毛发状的根。他在植物中大量增殖导致高度分支的根系统。

2直接基因转移

?1984年发现，超螺旋结构的细菌质粒，可以重组整合到植物染色体内。

?P E G(聚乙二醇溶液)介导的转化

?电激转化法

?注射法

?脂质体融合法

3病毒作为克隆载体

?大部分的植物病毒的基因组是R N A而不是D N A。

?在植物上已知有两种D N A病毒

?花椰菜花叶病毒

?二价病毒（g e m i n i v i r u s）

3病毒作为克隆载体

?花椰菜花叶病毒载体:

?装载能力有限。

?寄主范围窄，主要是芸苔属植物如芜菁、甘蓝和花椰菜等。

3病毒作为克隆载体

?二价病毒

?自然中他侵染重要的作物，如玉米和小麦。

?在侵染过程中，二价病毒重新排列并删除部分序列，搅乱插入的D N A序列。

?安全性。

4单子叶植物基因转移中的问题

?农杆菌一般只侵染双子叶植物不侵染单子叶植物。

?植株的再生受到基因型的限制。

4单子叶植物基因转移中的问题

?直接基因转移可以部分解决着一问题。标准的方法利用原生质体，再生的困难仍然存在。

?基因枪转化提供了解决方法，直接将质粒D N A打到胚胎上。

思考题

?酵母载体的类型及其特征

?人工染色体的结构

?T i质粒的结构、功能

?植物直接转化的原理

?植物基因转化的方法及其优缺点