1基因工程概论
基因工程概论
主要基因工程产品的研制、开发、上市时间
产品
人生长激素释放抑制素(SRM) 人胰岛素 人生长激素（HGH）
时间
1977 1978 1979
国家 用途
日本 巨人症 美国 糖尿病 美国 侏儒症
上市时间 国家
1982 1985
欧洲 美国
人α-干扰素（IFN）
乙肝疫苗（HBsAgV）
1980
198破了常规育种难以突破的物种之间界限，可使
原核生物与真核生物之间、动物与植物之间、甚至人与其
他生物之间的遗传信息进行重组和转移。 缩短了新物种出现的时间。
基因工程的基本操作程序
供体细胞
目的基因
载体 重 组D N A分 子
受体细胞 转化细胞
基因治疗 基因诊断
多肽药物 疫苗、抗体
（二）克隆载体研究
基因工程的发展是与克隆载体构建密切相关的； Ti质粒的发现使植物基因工程研究迅速发展起来；
动物病毒克隆载体的构建，使动物基因工程研究也有
一定的进展。可以认为构建克隆载体是基因工程技术路线 中的核心环节。 构建适合于高等动植物转基因的表达载体和定位整合 载体是今后研究的重要内容。
（三）受体系统的研究
就基因药物而言，最理想的表达场所是 转基因动物的乳腺。
1）乳腺是一个外分泌器官，乳汁不进入体内循环，不
会影响转基因动物本身的生理代谢反应。 2）从乳汁中获取目的基因产物，产量高，易提纯，表 达的蛋白质已经过充分的修饰加工，具有稳定的生物活性。 3）从乳汁中源源不断获得目的基因的产物的同时，转
基因动物又可无限繁殖。
基因工程 Gene Engineering
生物工程
包括基因工程、细胞工程、发酵工
程、蛋白质工程和酶工程等。
基因工程概论
基因工程概论连接产物●重组分子●未连接的载体分子●未连接的D N A片段●载体的自连●含有错误插入片段的重组D N A分子1转化—细菌吸收D N A的方式自然界中，转化并不是细菌获取遗传信息的主要方式。
细菌必须经过物理或化学处理后可提高吸收D N A的能力，经过这样处理的细菌称为感受态。
1.1大肠杆菌感受态的制备●感受态细胞(Competent cells):受体细胞经过一些特殊方法的处理后，细胞膜的通透性发生变化，成为能容许有外源DNA的载体分子通过的感受态细胞(competent cell) 。
1.1大肠杆菌感受态的制备●在冷的盐溶液中转化效率提高。
一般利用50m M的C a C l2，或者氯化铷。
–原理：与细菌外膜磷脂在低温下形成液晶结构，并发生收缩，使细胞膜出现孔隙。
●42°C热激处理。
1.2筛选转化细胞1n g的p U C8可以产生1000-10000个转化子，意味着只吸收了0.01%的D N A分子。
1.3其他的转化方法●电穿孔驱动的完整细胞转化（电激转化法）●接合转化●微注射法●λ噬菌体的转染●P E G介导的细菌原生质体转化1.3其他的转化方法●电激转化–受体细胞在脉冲电场作用下，细胞壁上形成一些微孔通道，使得D N A分子直接与裸露的细胞膜脂双层结构接触，并引发吸收过程。
–可以转化较大的质粒，适用于所有的细菌。
1.3其他的转化方法●接合转化–是由接合型质粒完成的。
–涉及到三种菌株的混合：受体菌、含有接合质粒的辅助菌以及含有待转化重组质粒的供体菌。
–重组质粒和接合质粒必须有相容性。
1.3其他的转化方法●P E G介导的细菌原生质体转化–高渗溶液中细菌培养至对数生长期–溶菌酶的等渗液处理，形成原生质体。
–加入D N A样品和聚乙二醇等渗液–离心除去聚乙二醇，固体培养。
●适用于芽孢杆菌和链霉菌等革兰氏阳性菌、酵母、霉菌甚至植物。
表5-1大肠杆菌5种常用转化方法的比较2重组子的鉴定●利用插入失活选择p B R322重组●载体：含有β-半乳糖苷酶基因l a c Z的调控序列和头146个a a的编码序列●宿主：缺失了l a c Z’基因，可编码β-半乳糖苷酶C端序列●α-互补：l a c Z基因上缺失近操纵基因区段的突变体可以与带有完整的近操纵基因区段的β-半乳糖苷酶隐性突变体之间实现互补。
《生物技术概论》1基因工程
二、目的DNA片段的获得
（三）DNA片段的化学合成 1.合成引物 2.合成DNA寡核苷酸连杆 3.合成基因片段
第二节 DNA重组
三、DNA片段的连接
（一）DNA连接酶 （二）DNA片段之间的连接 1. 互补黏性末端片段之间的连接 2.平末端DNA片段之间的连接 3.DNA片段末端修饰后进行连接 4. DNA片段加连杆或衔接头后连接
（六）基因可以通过复制把遗传信息传递给下 一代
第一节 基因工程概述
三、基因工程操作的基本技术路线
第一节 基因工程概述
四、基因工程研究最突出的优点
打破了常规育种难以突破的物种之间的界限， 可以使原核生物与真核生物之间、动物与植物 之间，甚至人与其他生物之间的遗传信息进行 相互重组和转移。人的基因可以转移到大肠杆 菌（E.coli）中表达，细菌的基因可以转移到动 植物中表达。
第二章 基因工程
第一节 基因工程概述
一、基因工程的含义
按照人们的愿望，进行严密的设计，通过体外 DNA重组和转移等技术，有目的地改造生物种 性，使现有物种在较短的时间内趋于完善，创 造出新的生物类型，这就是基因工程的基本含 义。
第一节 基因工程概述
二、基因工程研究的理论依据
（一）不同基因具有相同的物质基础 （二）基因是可以切割的 （三）基因是可以转移的 （四）多肽与基因之间存在对应关系 （五）遗传密码是通用的
质粒基因组、病毒（噬菌体）基因组、线粒体 基因组和叶绿体基因组也有少量的基因
第四节 目的基因的制备
二、分离目的基因的途径
（一）利用限制性内切核酸酶酶切法直接分离 目的基因
基因工程概论
基因工程概论重点知识：遗传工程、基因工程的概念；基因工程理论上的三大发现和技术上的三大发现；基因工程的基本步骤；基因工程的意义。
难点知识：基因工程的概念；基因工程的基本步骤；基因工程的基本原理。
第二章基因工程的工具酶重点知识：同位酶；同裂酶；同尾酶；星号活力；DNA操作酶的功能及应用（Bal 31, E. coli外切酶III,S1核酸酶，DNase I,测序酶，DNA连接酶，DTD, Ligase,逆转录酶，碱性磷酸酯酶，甲基化酶）；限制性内切酶的分类、命名原则；电泳后DNA的检测方法；DNA分子量的估算方法；怎样提高平头末端的连接效率；如何实现目的基因与载体连接效率；提高重组率的方法；构建酶切图谱的方法。
难点知识：DNA操作酶的功能及应用；怎样提高平头末端的连接效率；如何实现目的基因与载体连接效率；提高重组率的方法；构建酶切图谱的方法。
第三章基因克隆的载体重点知识：载体；克隆载体；表达载体；穿梭载体；质粒；严谨型质粒松弛型质粒；cos位点；λ cI突变体；溶源/溶菌性噬菌体；粘粒（cosmid）；噬菌粒；2μm质粒；载体的基本要求；质粒的基本特征及其分类；λDNA的特点；M13作为载体的优点；如何测定DNA的浓度和纯度？质粒DNA的提取方法，纯化的原理与方法；噬菌体DNA的分离纯化方法；大肠杆菌质粒pBR322、pUC8、pGEM3Z-DNA的特点；不同载体克隆DNA的片段大小；M13、λDNA作为载体需要进行哪些改造？λ克隆载体的类型；建生物基因组文库需要克隆的数目；酵母克隆载体的类型；YAC载体包括那些结构，来源和构建方法。
难点知识：严谨型质粒松弛型质粒；粘粒（cosmid）；噬菌粒；M13、λDNA作为载体需要进行哪些改造？λ克隆载体的类型；建生物基因组文库需要克隆的数目；YAC载体包括那些结构，来源和构建方法第四章重组DNA的转化与筛选重点知识：感受态细胞；插入失活；α-互补；Spi+；转化的方法有哪些？转化效率如何；噬菌体DNA转化大肠杆菌的方法；重组噬菌斑的鉴定方法；重组DNA的鉴定方法。
第一章 基因工程概述
或新性状的DNA体外操作程序，也称为分子克隆技术。
因此，供体、受体、载体是重组DNA技术的三大基
本元件。
基因工程的基本概念
B 基因工程的基本定义
基因工程是指重组DNA技术的产业化设计与应用，
包括上游技术和下游技术两大组成部分。上游技术指的
是基因重组、克隆和表达的设计与构建（即重组DNA技
术）；而下游技术则涉及到基因工程菌或细胞的大规模
酶工程
基因工程的基本概念
D 基因工程的基本形式
第一代基因工程 蛋白多肽基因的高效表达 经典基因工程 第二代基因工程 蛋白编码基因的定向诱变 蛋白质工程
第三代基因工程 代谢信息途径的修饰重构 途径工程
第四代基因工程 基因组或染色体的转移
基因组工程
第二节 基因工程的诞生和发展
一、基因
泛基因阶段
孟德尔遗传因子阶段
（如胰岛素）、干扰素、乙肝疫苗等 研制新型疫苗（HIV、霍乱、单纯疱疹病毒等）
生产具有药用价值的生物制剂，如水蛭素等
3. 基因诊断
– 遗传性疾病的分子诊断
– 癌症的分子诊断 – DNA指纹
4. 基因治疗
是指将外源正常基因导入靶细胞，以纠正或补偿因基因缺陷和异 常引起的疾病，以达到治疗目的。
3．断裂基因
1个基因被间隔区分成不连续的若干区段，这种编码序列不连续的间断基因被称为 断裂基因。
4．假基因
不能合成出功能蛋白质的失活基因 。
5．重叠基因
不同基因的核苷酸序列有时是可以共用的 即重叠的。
现代对基因的定义是DNA分子中含有特定遗传信息的一段核苷酸序列， 是遗传物质的最小功能单位。
二、 基因工程的诞生
顺反子阶段
1957 年，本泽尔（Seymour Benzer）以T4噬菌 体为材料，在DNA分子水平上研究基因内部的精细结 构，提出了顺反子（cistron）概念。 顺反子是1个遗传功能单位，1个顺反子决定 1条多肽链。
1基因工程概论
6. 其他 除以上争论外，对转基因食品安全性的争议还表现在
微生物作为宿主细胞的安全性问题，转基因动物激素、食 品、饲料添加剂等对动物本身的生长、发育和繁殖的安全 性问题等方面。
基于上述诸多方面的异议，转基因食品的安全性问题 的研究成为转基因技术研究的一个热点。
所以关于GMO（genetic modified origanism）的争论主 要集中于安全性，宗教，贸易
1.实验室的物理安全
P1——P4是关于基因工程实验室物理安全防护上的装备规定。 P1级实验室为一般的装备良好的普通微生物实验室；
P2级实验室，在P1级实验室的基础上，还需装备负压的安全操 作柜；
P3级实验室，即全负压的实验室，同时还要装备安全操作柜；
P4级实验室是具有最高安全防护措施的实验室，要求建设专用 的实验大楼，周围与其它建筑物之间应留有一定距离的隔离带， 细菌操作带手套进行，以及使用其他必要的隔离装置，使研究 者不会直接同细菌接触。
一.基因工程的诞生
1. Berg的开创性实验
1972年斯坦福大学的Paul Berg小组完成了首次体外重 组实验：将SV40的DNA片断与噬菌体的DNA片断连 接起来(用DNA末端转移酶，而非限制性内切酶)。
2. Boyer-Cohen实验
1973年斯坦福大学的S. Cohen小组将含有卡那霉素抗性基因的 大肠杆菌R6-5质粒与含有四环素抗性基因的另一种大肠杆菌质 粒pSC101连接成重组质粒，具有双重抗药性。
二.揭示了DNA分子的双螺旋结构模型和半保留复制机 理，解决了基因的自我复制和传递的问题。
1953年James D. Watson和Francis H. C. Crick揭 示了DNA分子的双螺旋结构和半保留复制机制。
基因工程一基因工程概况PPT教案
二 、应用研究
（一） 药物相关基因 最活跃发展最快的领域
主要种类有： 1. 活性多肽 2. 疫苗 3. DNA药物
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1、活性多肽
种类： 干扰素、胰岛素、白介素，生长因子等。 用途 诊断、预防和治疗疾病 干扰素：干扰病毒复制，广谱抗病毒活性和免疫调节功能 胰岛素：治疗糖尿病， 白介素：治疗多种实质性恶性肿瘤。
作用方式： • 重组DNA药物并转入病变组织、细胞，发挥作用治疗基因缺陷。 • 药物蛋白基因转入病人体内表达后发挥作用。 • DNA插入异常表达基因使其失活。
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DNA药物的生产方法： • 转基因微生物发酵培养 • 转基因动物细胞培养 • 利用转基因动物的乳腺生产
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（二）转基因植物 1、转化方法： • 农杆菌介导法 • 枝接转化法：基因枪、电穿孔、聚乙二醇法 2、受体细胞 • 愈伤组织(Callus) ,叶片, Protoplast(原生质体) • 种质系统的基因转移：子房注射、花粉管通导等。
第29页/共52页
生产方法： 传统方法：培养动物，从中分离 基因工程方法：克隆基因—转入细菌—基因表达 ----纯化蛋白
第30页/共52页
2、 疫苗
诱导免疫反应.
传统生产方法 ：灭活或减毒的病原物。
缺点：有不良反应。
基因工程方法 ：
•
去除有毒基因，根本解决致病性
•
可食疫苗。
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3、 DNA药物
第8页/共52页
3、基因是可以转移的. 基因可在不同染色体、细胞和物种间转移。 4、多肽与基因之间存在对应关系。 有一条多肽就有一种相对应的基因，基因序列决定 多肽的序列，通过多肽链可推导基因的有无。
基因工程概论复习重点
复习题一、名词解释1. 原核基因（Prokaryotic gene）：由原核生物（如大肠杆菌）基因组编码的基因，以及高等生物细胞器线粒体基因组和叶绿体基因组等编码的基因，统称原核基因。
2. 真核基因（Eukaryotic gene）：真核生物基因组DNA编码的基因,以及感染真核细胞的DNA病毒和反转录病毒基因组编码的基因，统称真核基因。
3. .前导序列（Leader sequence）：又叫前导序列区或5'-非翻译区（5'-UTR），，系指位于mRNA5'-起始密码子之前的一段长数百个核苷酸的不翻译的RNA 区段。
4. 尾随序列（Tai1er sequence）：又称尾随序列区或3'-非翻译区（3'-UTR），系指位于mRNA3'-终止密码子之后一段100多核苷酸的不翻译的RNA区段。
5 复制子（Replicon）：指有一个复制起始区（oriC）和起始基因的DNA复制单元。
例如细菌染色体、病毒基因组、质粒基因组等，凡其DNA能够进行复制的遗传单元，均称复制子。
真核细胞基因组的复制子是指含有一个复制起始位点的DNA（RNA）的复制子特称复制单元。
6. 增强子（Enhancer）：又叫增强子序列或增强子元件，是真核基因中发现的一种特异序列，能够在距离目标基因50kb以上的位置，从上游或下游的不同位置及方向增强该基因的转录活性。
7. 沉默子（Silencer）在真核基因启动子中除了增强子之外，沉默子同样也是一种可远距离调控相关基因转录活性的顺式元件。
与增强子一样，沉默子也能够从启动子的上游、下游甚至是基因内部三种不同的位置以及正向或反向，影响相关基因启动子的转录起始效率。
同时沉默子往往是以组织特异性或时间特异的作用方式，控制基因的表达作用。
但与增强子的功能效应相反，沉默子只能抑制而不能激活相关基因的转录起始活性。
8. 绝缘子（Insulator）亦即是增强子活性的物理边界元件（physical boundaryelement），它是一段能够抑制或隔离增强子功能效应的顺式转录调节序列。
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?基因工程菌（细胞）是现代生物工 程中的微型生物反应器
4 基因工程的意义
? 基因工程可以绕过远缘有性杂交的困 难，使基因在微生物、植物、动物之 间交流，迅速并定向的获得人类需要 的新的生物类型 。
? 概括地讲，其意义体现在以下三个方 面：
基因工程 Genetic Engineering
生科院遗传室 盖树鹏
本课程的地位：
现代科技革命 高新技术 生物技术 基因工程 基因克隆
基本要求：
? 掌握基因克隆的基本工具、基本方法。 ? PCR技术基本原理和应用。 ? 怎样利用基因重组技术研究基因的结构、表达
和调控。
? 利用基因工程生产重组蛋白，基因工程在医药 和农业上的应用。
? 大规模的生产生物分子
? 设计构建新物种
? 搜寻、分离和鉴定生物体尤其是人体内 的遗传信息。
表1-1 主要基因工程产品的研制、开发、上市时间
产品
人生长激素释放抑制素(SRM) 人胰岛素 人生长激素（HGH）
时间 国家 用途 上市 国家 时间
1977 日本 巨人症
1978 美国 糖尿病 1982 欧洲 1979 美国 侏儒症 1985 美国
? 根据酶切结果判读酶切图谱，以及判读DNA序 列的能力。
? 能够设计一个基因克隆的程序。
参考书：
? Gene cloning, T.A. Brown. Third edition.
? 基因工程原理，吴乃虎编著，科学出版 社
? 基因工程概论，张惠展编著，华东理工 大学出版社。
? 植物基因工程原理与技术，王关林，方 宏筠主编，科学出版社。
方法：叶圆盘法，并获得转基因植株。
2.3 发展过程中的重大事件
?1990年，患有遗传免疫疾病的 4岁 女孩接受了基因疗法。
?1990年，Perlak 将B.T.基因导入 棉花获得抗虫棉 。
?1991年，美国开始人类基因组计划。 ?2019年，“多利”绵羊诞生。
转 移 大 鼠 生 长 素 基 因 的 小 鼠
人α-干扰素（IFN） 乙肝疫苗（HBsAgV） 人白细胞介素
1980 美国 病毒 1983 美国 乙肝 1984 美国 肿瘤
1985 欧洲 1986 欧洲 1989 欧洲
人促红细胞生成素（EPO） 人粒细胞集落刺激因子(G-CSF) 人组织纤溶酶原激活剂（t-PA）
基 因 克 隆 的 基 本 步 骤
3.3 基因工程的基本原理
?分子遗传、分子生物学以及生化工 程学是基因工程原理的三大基石。
?载体DNA自主复制的特性
?提高基因剂量 ?提高宏观表达水平
?一个完整的基因由三部分组成：启动 子、编码序列与终止子。
?筛选、修饰和重组启动子、增强子、 终止子等基因的转录调控元件。
? 分子克隆实验指南，J. Sambtook, EF Frish, T Maniatis, 金冬雁，黎孟枫等译，科学出 版社。
第一部分 基因克隆的基 本原理
Chapter I 概论
? 生物工程、生物技术 ? 基因工程的发展史
? 理论上的三大发现 ? 技术上的三大发现 ? 发展过程中的重大事件
? 基因工程的概念
?上游技术：外源基因重组、克隆和表 达的设计与构建（狭义基因工程）
?下游技术：含有外源基因的生物细胞 （基因工程菌或细胞）的大规模培养 以及外源基因的表达、分离、纯化过 程。
gene manipulation, gene cloning,
recombinant DNA technology, genetic modification, new genetics, molecular agriculture
1. 几个相关概念
? 遗传工程：人工改造生物体遗传性的 技术。包括细胞工程、染色体工程、 细胞器工程、基因工程等 。
生物技术的范围最广。
2. 基因工程的发展史
2.1 理论上的三大发现 ?证明了生物的遗传物质是 DNA（基
因工程的先导） ? DNA的双螺旋 结构和 半保留复制 机
理 ?遗传信息的传递方式（ 中心法则）
3 基因工程的概念
3.1 概念
按照预先设计好的蓝图，利用现代 分子生物学技术，特别是酶学技术， 对遗传物质 DNA直接进行体外重组操 作与改造，将一种生物（ 供体）的基 因转移到另外一种生物（ 受体）中去， 从而实现受体生物的 定向改造与改良。
3 基因工程的概念
?3.1 概念
?广义基因工程： DNA重组技术的产 业化设计与应用。
3.2 基本步骤：(切、接、转、增、检）
? 施工材料的准备：目的基因、载体、工具 酶和受体细胞（宿主）的准备。用限制性 内切酶分别将外源DNA和载体分子切开。
? 目的基因与载体DNA的体外重组，形成重 组DNA分子。
? 把重组的DNA分子引入受体细胞，并建立 起无性繁殖系。
? 筛选出所需要的无性繁殖系，并保证外源 基因在受体细胞中稳定遗传、正确表达。
Tetracycline pSgase
Kanr and Tetr
2. 基因工程的发展史
2.3 发展过程中的重大事件
? 1977年，E. coli中合成了人生长激素基
因。 ? 1978-1979胰岛素基因在大肠杆菌中表达。 ? 1982年，培育出了超级鼠。 ? 1985年Horsch发明了植物基因工程的基本
2. 基因工程的发展史
2.2 技术上的三大发现 ?限制性内切酶和DNA连接酶的发
现（标志着DNA重组时代的开始） ?载体的使用 ?1970年，逆转录酶的发现。
2. 基因工程的发展史
?1973年，Cohen等获得了抗四环 素和新霉素的重组菌落TcrNer， 标志着基因工程的诞生。
Kanamycin R6-5
? 概念、原理 ? 基本步骤 ? 基因克隆需要的工具和技术
? 基因工程的意义
1. 几个相关概念
? 生物工程：直接或间接利用生物体的机能生 产物质的技术。包括发酵技术、基因重组、 细胞融合、细胞大量培养、生物反应器等技 术。
? 生物技术：生物技术是以现代生命科学为基 础，结合先进的工程技术手段和其他基础学 科的科学原理，按照预先的设计改造生物体 或加工生物原料，为人类生产出所需的产品 或达到某种目的。包括基因工程、细胞工程、 酶工程、发酵工程等。