医学-实验五土壤中细菌纯种分离和培养
土壤微生物的分离和纯化实验
实验八土壤微生物的分离和纯化一、目的1.了解从土壤中分离与纯化微生物的基本原理及方法。
2.掌握几种常用的分离的基本操作技术。
二、原理在自然界中,土壤是微生物生活中的最适宜的环境,土壤中存在大量的微生物,但土壤中的微生物是各种不同种类微生物的混合体,因此,为了研究某一微生物的特性,或者要大量地培养和利用某种微生物,必须把它们从这些混杂的微生物群中分离出来。
从而获得某一菌株的纯培养。
这种获得纯培养的方法称之为微生物的分离和纯化三、器材1.牛肉膏蛋白胨琼脂培养基、高氏l号培养基、马铃薯蔗糖琼脂培养基。
2.盛有100毫升无菌水的三角瓶,9毫升无菌水的试管,无菌吸管,无菌玻璃涂抹棒,10%的酚液,25%的乳酸,土样,接种环,标签。
四、方法(一)涂抹平板分离法1.制备土壤稀释液称取土样10克,放入装有玻璃珠和100毫升无菌水的三角瓶中,振摇15—20分钟,使土与水充分混合,将菌分散,静止片刻,用吸管从中吸取1毫升土壤悬液注人盛有9毫升无菌水试管中,吹吸三次,并振摇使之充分混匀,然后再吸取1毫升注入另一支盛有9毫升无菌水的试管中,以此类推制成10-1、10-2、l0-3、10-4、l0-5……的各种稀释度的土壤悬液。
2.倒平板将牛肉膏蛋白胨培养基,高氏1号培养基,马铃薯蔗糖培养基溶化。
待冷至50—60℃时,在高氏l号培养基中加入10%酚2滴,在马铃薯蔗糖培养基中加入25%乳酸2滴,然后分别倒平板,每支培养基倒一皿(用右手持盛培养基的试管,左手拨出棉花塞,试管口在火焰上灭菌,然后左手将培养皿在火焰附近打开少许,迅速注入培养基,加盖后轻轻摇动培养皿使培养基均匀分布,平放在桌面上,待凝后即成平板。
(见图18)。
3.涂抹将上述每种培养基平板标上10-3、10-4、10-5稀释度,然后用无菌吸管分别从10-5、10-4、10-3稀释度的试管中吸取土壤悬液,每一平板注入0.2毫升,再用灭菌玻璃涂抹刮棒在培养基表面轻轻地涂布均匀,静止5分钟。
细菌 、放线菌 、酵母菌及霉菌的分离与纯化
土壤中细菌、放线菌、酵母菌及霉菌的分离与纯化一、实验目的1. 学习、掌握从土壤稀释分离、划线分离各类微生物的技术。
2. 学习从样品中分离、纯化出所需菌株。
3. 学习并掌握平板倾注法和斜面接种技术，了解培养细菌、放线菌、酵母菌及霉菌四大类微生物的培养条件和培养时间。
4. 学习平板菌落计数法。
二、实验原理将待分离的样品进行一定的稀释，使微生物的细胞（或孢子）尽量呈分散状态，选用有针对性的培养基，在不同温度、通风等条件下培养，让其长成一个纯种单个菌落。
要想获得某种微生物的纯培养，还需提供有利于该微生物生长繁殖的最适培养基及培养条件。
微生物四大类菌的分离培养基、培养温度、培养时间见表2-1所示。
表2-1 微生物四大类菌的分离和培养要求样品来源分离对象分离方法稀释度培养基名称培养温度/℃培养时间/d土样细菌稀释分离10-5，10-6，10-7牛肉膏蛋白胨30～37 1～2土样放线菌稀释分离10-3，10-4，10-5高氏1号28 5～7土样霉菌稀释分离10-2，10-3，10-4马丁氏琼脂28～30 3～5面肥或土样酵母菌稀释分离10-4，10-5，10-6马铃薯葡萄糖28～30 2～3细菌分离平板细菌单菌落划线分离10-2 牛肉膏蛋白胨30～37 1～2三、实验材料1. 菌源土样2. 培养基牛肉膏蛋白胨培养基，马丁氏培养基，高氏合成1号培养基，马铃薯葡萄糖培养基(制平板和斜面)，见附录Ⅲ。
3. 无菌水 250 mL锥形瓶，每瓶装99 mL无菌水(或95mL为分离霉菌用)，内装10粒玻璃珠。
4.5 mL无菌水试管(每人5～7支)。
4. 其他物品无菌培养皿，无菌移液管，无菌玻璃涂棒(刮刀)，称量纸，药勺，橡皮头，10%酚溶液。
（一）系列稀释平板法1. 取土样选定取样点，按对角交叉（五点法）取样。
先除去表层约2cm的土壤，将铲子插入土中数次，然后取2～10cm处的土壤。
盛土的容器应是无菌的。
将5点样品约1kg充分混匀，除去碎石、植物残根等杂物，装入已灭过菌的牛皮纸袋内，封好袋口，并记录取样地点、环境及日期。
从土壤中分离纯培养微生物并作初步观察鉴定实验报告
从土壤中分离纯培养微生物并作初步观察鉴定实验报告林淑丽（漳州师范学院生物系食品科学与工程10级101304116）【摘要】熟练分离纯化微生物的基本操作技术，并对土壤中的微生物进行分离与纯化，根据菌落形态观察及一系列的生理生化结果，对照种属特征初步鉴定分离纯化的微生物所属的类群。
【关键词】细菌、霉菌、放线菌、培养基配制、高压蒸汽灭菌、平板划线、斜面接种ISOLATED FROM SOIL MICROBIAL AND PURE TRAININGPRELIMINARY OBSERVATION APPRAISAL EXPERIMENTREPORTLin Shuli(Food science and engineering 10 levels in biosystem department,zhangzhounormal university 101304116)【abstract】skilled purification microbial the basic operation of the technology, and the soil of the microbial separation and purification, according to the colony morphology observation and a series of physiological and biochemical results, the comparison species features of separation and purification preliminary identification of microbial subordinate groups.【Key Words】bacteria，mould，Actinomyces，Culture medium preparation，High-pressure steam sterilization，Flatcrossed，Cant vaccination培养基各成分的作用：①牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏为微生物提供碳源、磷酸盐和维生素，蛋白胨主要提供氮源和维生素，而NaCl提供无机盐，其中琼脂起凝固剂的作用。
土壤分离微生物实验步骤
土壤分离微生物实验步骤一、实验目的从土壤中分离和培养微生物，了解土壤微生物的多样性和生态功能，掌握微生物分离和培养的基本技术和方法。
二、实验原理土壤是微生物的天然栖息地，其中包含了各种类型的微生物，如细菌、放线菌、真菌等。
通过选择合适的培养基和培养条件，可以将不同类型的微生物从土壤中分离出来，并进行培养和鉴定。
三、实验材料和设备1、土壤样品：从不同地点采集的新鲜土壤。
2、培养基：牛肉膏蛋白胨培养基（用于细菌培养）、高氏一号培养基（用于放线菌培养）、马丁氏培养基（用于真菌培养）。
3、无菌水、无菌移液管、无菌培养皿、无菌三角瓶、无菌玻璃棒、无菌涂布棒、无菌镊子、无菌滤纸条、酒精灯、接种环、显微镜等。
4、恒温培养箱、超净工作台、高压蒸汽灭菌锅等。
四、实验步骤1、制备培养基（1）按照培养基配方准确称取各种药品，放入三角瓶中，加入适量蒸馏水，加热溶解。
（2）调整 pH 值至所需范围（例如，牛肉膏蛋白胨培养基的 pH 为72-74，高氏一号培养基的 pH 为 74-76，马丁氏培养基的 pH 为 55-60）。
（3）将培养基分装到三角瓶或培养皿中，包扎好，进行高压蒸汽灭菌（121℃，20-30 分钟）。
2、土壤样品的采集（1）选择具有代表性的地点，去除表层的枯枝落叶和杂质。
（2）用无菌铲子或采样器采集深层土壤（5-20 厘米），放入无菌塑料袋中，密封保存。
3、土壤悬液的制备（1）称取 10 克土壤样品放入装有 90 毫升无菌水的三角瓶中，充分振荡，使土壤颗粒均匀分散在水中，制成 10⁻¹浓度的土壤悬液。
（2）用无菌移液管吸取 1 毫升 10⁻¹浓度的土壤悬液，加入装有 9 毫升无菌水的试管中，充分混匀，制成 10⁻²浓度的土壤悬液。
以此类推，制备 10⁻³、10⁻⁴、10⁻⁵等不同浓度的土壤悬液。
4、涂布平板法分离微生物（1）分别吸取不同浓度的土壤悬液 01 毫升，滴加在相应的培养基平板上。
土壤细菌的分离与纯化
土壤细菌的分离与纯化土壤细菌是一种普遍存在于土壤中的微生物，它们在土壤生态系统中发挥着重要的角色。
分离和纯化土壤细菌，不仅可以研究其基本特性、生物学功能和代谢途径等，还可以开发其潜在的应用价值，比如生物农药和生物化学制品的生产等。
本文将介绍土壤细菌的分离和纯化过程，以及影响土壤细菌分离的因素和纯化方法。
土壤细菌的分离是指从土壤中分离得到单个细菌菌落的过程。
一般分离方法有以下几种：（一）稀释涂布法该方法是将土壤分别用不同浓度的生理盐水进行稀释，然后将不同浓度的土壤悬液制成平板培养基并涂布在培养基上。
菌落形成后，可再次从菌落上接种单个细菌。
该方法适用于分离数量稀少的细菌。
（二）膜过滤法该方法是将土壤和生理盐水混合后通过孔径为0.22μm的滤膜过滤出微生物体，然后将此滤膜放置于适宜的培养基上进行培养。
该方法适用于分离数量较多的细菌。
（四）毛细管沉淀法该方法是利用毛细管的吸力将土壤中的细菌沉淀到毛细管中，然后将毛细管插入含有适宜培养基的瓷片中，放置在恒温箱中进行分离和培养。
该方法适用于分离数量稀少的细菌。
（五）选择性富集法该方法是通过添加选择性富集剂使特定种类的细菌生长，不同种类的细菌生长受到不同富集剂的影响。
该方法适用于富集数量稀少的特定种类细菌。
（一）单菌落分离法该方法是将分离得到的细菌菌落在新的培养基上进行二次分离和培养，直至获得单一的细菌菌落。
该方法适用于分离数量较多并且形态较为相似的细菌。
（三）挑选法该方法是利用显微镜观察细菌形态和形状，手工用铂丝挑选出单个细菌菌落。
该方法适用于菌落数量较少且形态差异较大的细菌。
该方法是利用滤纸将细菌菌液过筛，分离得到单个细菌颗粒。
该方法适用于分离数量较少的细菌。
土壤细菌的分离受到多种因素的影响，如土壤环境因素、培养基种类和培养方式等。
（一）土壤环境因素土壤的物理化学因素，如土壤温度、pH值、土壤含水量等对土壤细菌的生长有很大影响。
不同种类的土壤中细菌种群差异很大，所以适当选择适宜的土壤样品可以更好的分离得到目标细菌群落。
土壤中细菌、放线菌、酵母菌及霉菌的分离与纯化
土壤中细菌、放线菌、酵母菌及霉菌的分离与纯化一、实验目的1. 学习、掌握从土壤稀释分离、划线分离各类微生物的技术。
2. 学习从样品中分离、纯化出所需菌株。
3. 学习并掌握平板倾注法和斜面接种技术，了解培养细菌、放线菌、酵母菌及霉菌四大类微生物的培养条件和培养时间。
4. 学习平板菌落计数法。
二、实验原理将待分离的样品进行一定的稀释，使微生物的细胞（或孢子）尽量呈分散状态，选用有针对性的培养基，在不同温度、通风等条件下培养，让其长成一个纯种单个菌落。
要想获得某种微生物的纯培养，还需提供有利于该微生物生长繁殖的最适培养基及培养条件。
微生物四大类菌的分离培养基、培养温度、培养时间见表2-1所示。
表2-1 微生物四大类菌的分离和培养要求样品来源分离对象分离方法稀释度培养基名称培养温度/℃培养时间/d土样细菌稀释分离10-5，10-6，10-7牛肉膏蛋白胨30～37 1～2土样放线菌稀释分离10-3，10-4，10-5高氏1号28 5～7 土样霉菌稀释分离10-2，10-3，10-4马丁氏琼脂28～30 3～5面肥或土样酵母菌稀释分离10-4，10-5，10-6马铃薯葡萄糖28～30 2～3细菌分离平板细菌单菌落划线分离10-2 牛肉膏蛋白胨30～37 1～2三、实验材料1. 菌源土样2. 培养基牛肉膏蛋白胨培养基，马丁氏培养基，高氏合成1号培养基，马铃薯葡萄糖培养基(制平板和斜面)，见附录Ⅲ。
3. 无菌水 250 mL锥形瓶，每瓶装99 mL无菌水(或95mL为分离霉菌用)，内装10粒玻璃珠。
4.5 mL无菌水试管(每人5～7支)。
4. 其他物品无菌培养皿，无菌移液管，无菌玻璃涂棒(刮刀)，称量纸，药勺，橡皮头，10%酚溶液。
（一）系列稀释平板法1. 取土样选定取样点，按对角交叉（五点法）取样。
先除去表层约2cm的土壤，将铲子插入土中数次，然后取2～10cm处的土壤。
盛土的容器应是无菌的。
将5点样品约1kg充分混匀，除去碎石、植物残根等杂物，装入已灭过菌的牛皮纸袋内，封好袋口，并记录取样地点、环境及日期。
土壤中微生物的分离与鉴定实验报告
Sdu微生物大实验土壤微生物的分离纯化与鉴定【实验目的】1、从各地区土壤中筛选含几丁质酶的真菌及含果胶酶的菌株；2、通过从土壤中分离纯化菌株，掌握培养基的制备与灭菌技术、微生物的筛选、分离纯化方法和无菌操作技术。
3、复习以前学过的各种染色方法，掌握生理生化试验的原理与方法。
4、掌握微生物的鉴定技术、菌种保藏技术。
【实验原理】1、微生物的分离与纯化：从混杂的微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物的分离与纯化。
此次实验采取平板分离法，该方法操作简便，普遍用于微生物的分离与纯化，其基本原理主要包括两个方面：a.选择适合于待分离微生物的生长条件或加入某种抑制剂造成只利于待分离微生物生长，而抑制其它微生物生长的环境，从而淘汰大部分不需要的微生物。
b.微生物在固体培养基上生长形成的单个菌落可以是由一个细胞繁殖而成的集合体，因此可通过挑取单菌落而获得一种纯培养。
获得单菌落的方法可通过稀释涂布平板法或平板划线法等技术来完成。
微生物的观察可以用显微镜观察其细胞形态，也可以用肉眼观察其菌落形态。
前者是微生物的显微镜观察技术，后者是微生物的肉眼观察技术。
2、霉菌：霉菌可产生复什分枝的菌丝体，分基内菌丝和气生菌丝，气生菌丝生长到一定阶段分化产生繁殖菌丝，由繁殖菌丝产生孢子。
霉菌菌丝体（尤其是繁殖菌丝）及孢子的形态特征是识别不同种类霉菌的重要依据。
霉菌菌丝和孢子的宽度通常比细菌和放线菌粗得多（约 3-10μm ），常是细菌菌体宽度的几倍至几十倍，因此，用低倍显微镜即可观察。
观察霉菌的形态有多种方法，常用的有直接制片观察法、载玻片培养观察法和玻璃培养观察法三种方法，本实验采用载玻片培养观察法。
3、果胶酶筛选培养基：配制以果胶为唯一碳源的筛选培养基，在该培养基上，只有能分解利用果胶的菌株才能够生长，依此来从土壤中筛选出能够产果胶酶的菌株。
刚果红（Congo Red,简称CR）是一种染料，它可与果胶形成红色复合物，但并不和果胶水解后的产物发生这种显色反应，在含有果胶的培养基中加入刚果红时，刚果红能与培养基中的果胶形成红色复合物。
实验六_土壤中真菌纯化、分离和培养
将1瓶土壤菌液（称取土样10g放入盛90 mL无菌水）和4管9mL的无菌水排列好， 按10-1、10-2、10-3、10-4及10-5依次编号。 在无菌操作条件下，用lmL无菌移液管吸 取lmL10-1浓度的菌液于一管9mL无菌水 中，将移液管吹洗三次，摇匀即为10-2浓 度菌液。同样方法，依次稀释到10-5。 注意：在土壤稀释过程中，吸取不同梯 度的菌液需换用不同的吸管。
三、仪器和材料
样品：新鲜土壤 培养基：加有 2ml 链霉素的 PDA 培养基或 孟加拉红培养基。 无菌水：装有9mL无菌水的试管4支。 其它： 无菌培养皿 4 皿、无菌吸管、酒精 灯、培养箱等 。
四、真菌纯种分离的操作方法
1、土壤稀释液的制备
用“稀释平板计数法”中的方法 进行，将土样稀释至10－5。
土壤稀释液的制备和稀释液的取样
2、分离方法 采用稀释平板分离法。
混 菌 法
涂 抹 法
3、培养
将上述接种土壤悬液的平板 倒置于28℃培养3-5d。
4、挑菌纯化 5、计数
6、菌种保存
将分离到的真菌转接到PDA斜面上培 养，待长好后，置于冰籍中保存，必要时 进行深入研究。
六、注意事项
1、混菌法接种时温度不能过高，应低于45℃， 如不用温度计，则以不烫脸、手为宜。
2、涂布法接种时一定要涂抹均匀，否则就会无 法记数。
3、接种后的培养皿应静置15分钟以上，然后倒 置培养。
七、作业 题
1． 在分离真菌时为什么需加链霉素（庆 大霉素或氯霉素），而不加青霉素？ 2 ．用一根无菌移液管接种几种浓度的水 样时，应从哪个浓度开始？为什么？
实验六
土壤中真菌分离、纯化和培养
一、目的要求
掌握从土壤中初步分离培养真菌的方法， 从而获得真菌纯培养技能；了解基本接 种技术。
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③对 照 取“对照”的无菌培养皿，倒平板待
凝固后，打开皿盖10min后盖上皿盖。
2、平板划线分离法
（1）平板的制作
将融化并冷至约50℃的肉膏蛋白胨琼脂 培养基倒入无菌培养皿内，使凝固成平 板。
实验五
土壤中细菌分离、纯化和培养
一、目的要求
1、初步掌握从土壤中分离和纯化细菌的 基本方法。
2、练习微生物接种和培养的基本技术， 掌握无菌操作技术。
二、实验原理
土壤是微生物生活的大本营，是寻找和发现 有重要应用潜力的微生物的主要菌源。不同 土样中各类微生物数量不同，一般土壤中细 菌数量最多。用挑单孢法、稀释涂布平板法 或平板划线法获得一种或一株微生物。
（2）划线
用接种环挑取一环土壤悬液，左手拿培养 皿，中指、无名指和小指托住皿底，拇指 和食指夹住皿盖，将培养皿稍倾斜，左手 拇指和食指将皿盖掀半开，右手将接种环 伸入培养皿内，在平板上轻轻划线（每组 做三皿）。
注意：切勿划破培养基
划线的方式可取图中任何一种
1.斜线法 2.曲线法 3.方格法 4.放射法 5.四格法
1、稀释平板分离法
（1）取样 选择较肥沃的土壤，铲去表土层，挖5-20cm 深度的或特殊要求的地方土壤，装入灭过菌 的袋内，封好袋口，做好编号记录，携回实 验室供分离用。
（2）制备土壤稀释液
◆ 将1瓶90mL和7管9mL的无菌水排列好，按 10-2、10-3、10-4、10-5及10-6依次编号。
注意：在土壤稀释过程中，吸取不 同梯度的菌液需换用不同的吸管。
（3）平板的制作 ①吸取菌液：
用无菌移液管吸取菌 液于无菌培养皿内。
注意：在无菌培养皿底部注明稀释度。 注意：每次吸取前，用移液管在菌液中吹泡使菌液充分混匀。
②倒平板：
♫ 将 融 化 并 冷 至 约 50℃ 的牛肉膏蛋白胨琼脂 培养基倒入培养皿内。
注意无菌操作。 平板划线要注意染菌，同时注意划线深
度和密度。无菌移液管接种几种浓度的水
样时，应从哪个浓度开始？为什么？ 3．如何检验平板上某个单菌落是不是纯
培养？
Thank you
三、仪器和材料
样 品：新鲜土壤 培养基：灭菌的牛肉膏蛋白胨琼脂培养基 无菌水：带有玻璃珠装有90mL无菌水三角
瓶、装有9mL无菌水的试管。 其 它：无菌培养皿(直径75毫米) 、无菌玻
璃移液管、酒精灯、培养箱等 。
四、操作步骤
（一）细菌纯种分离的操作方法
细菌纯种分离的方法有两种： 1、稀释平板法 2、平板划线法
◆ 称取土样10g放入盛90mL无菌水并带有玻 璃珠的三角瓶中，用手摇10min，使土样均 匀分散，制成（10-1）土壤悬液。
◆ 在无菌操作条件下，用lmL无菌移液管吸取lmL 10-1浓度的菌液于另一管9mL无菌水中，将移液 管吹洗三次，摇匀即为10-2浓度菌液。
◆ 同样方法，依次稀释到10-6。
（二）培养
将前面制作的平板倒置于培养箱， 30℃培养24～48h，然后观察结果。
（三）挑菌纯化
在平板上选择分离较好的有代表性的单菌 落接种斜面，如果不纯，需进一步挑取此 菌落采取稀释平板法或划线分离法分离， 直至获得纯培养。
分离平板
五、注意事项
制备土壤稀释液时，要注意使土样均匀 分散在稀释液中。