细菌的分离与培养

细菌的分离与培养

实验目的：

掌握在各种培养基上的接种方法并观察生长现象。

实验材料：

菌种、普通琼脂平板、肉汤培养基、半固体培养基、斜面培养基、接种环、接种针、酒精灯。实验内容：

一、平板划线接种法（分离培养法）

原理：通过在平板上划线，将混杂的细菌在琼脂平板表面充分的分散开，使单个细菌能固定在一点上生长繁殖，形成单个菌落，以达到分离纯种的目的。若需从平板上获取纯种，则挑取一个单个菌落作纯培养。

用途：分离出纯种细菌，以利作纯培养。

课时安排：2课时

操作方法（三区划线法）：

1、右手拿接种环，烧灼冷却后，取菌液一环。

2、左手抓握琼脂平板（让皿盖留于桌上），在酒精灯火焰左前上方，使平板面向火焰，以免空中杂菌落入，右手将已沾菌的接种环在琼脂表面密集而不重叠的来回划线，面积约占整个平板的1/5-1/6，此为第一区。划线时接种环与琼脂呈30-40度角轻轻接触，利用腕力滑动，切忌划破琼脂。

3、接种环上多余的细菌可烧灼（每划完一个区域是否需要烧灼灭菌视标本中含菌量多少而定），待冷后，在划线末端重复2-3根线后，再划下一区域（约占1/4面积），此为第二区。

4、第二区划完后可不烧灼接种环，用同样方法划第三区，划满整个平皿。

5、划线完毕，将平板扣入皿盖并作好标记，置37℃温箱孵育18-24小时观察琼脂表面菌落分布情况，注意是否分离出单个菌落，并记录菌落特征（如大小、形状、透明度、色素等）。

二、液体培养基接种法

用途：凡肉汤、蛋白胨水，各种单糖发酵均用此法接种。可以观察细菌不同的生长性状、生化特性以供鉴别之用。

操作方法：

右手执笔式握住接种环，灭菌冷却后取单个菌落。

1、左手拇指、食指、中指托住液体培养基之下端，右手小指和无名指（或手掌）拔取试管塞，将管口移至火焰上旋转烧灼。

2、将沾菌的接种环移入培养基管中，在液体偏少侧接近液面的管壁上轻轻研磨，沾取少许液体与之调和，使菌液混合于培养基中（图5）。

3、管口通过火焰，塞好试管塞，将接种环灭菌后放下，经37℃温箱孵育18-24小时，取出观察生长情况。

三、半固体穿刺接种法

用途：观察细菌动力，保存菌种。方法：

1、以无菌操作用接种针挑取单个菌落，立即垂直插入培养基中心至接近管底处循原路退回。

2、管口通过火焰，塞上棉塞，接种针灭菌后放下。试管置37℃温箱孵育18-24小时，取出后对光观察穿刺线上细菌生长情况：细菌有无向周围扩散生长，穿刺线是否清晰等。

图5 液体（左）及半固体（右）培养基接种法

四、斜面培养基接种法

用途：常用于扩大纯种细菌及实验室保存菌种。

操作方法：

1、以无菌操作法用接种环挑取单个菌落，自斜面底向上划一直线，然后再从底向上轻轻来回作蜿蜒划线。

2、管口通过火焰，塞上棉塞，接种环烧灼后方可放下。置37℃温箱孵育18-24小时，取出观察斜面上菌苔生长情况。

细菌分离培养及移植

在细菌学诊断中，分离培养是不可缺少的一环。分离培养的目的主要是在含多种细菌的病料或培养物中挑选出某种细菌。在分离培养时应注意：选择适合于所分离细菌生长的培养基、培养温度、气体条件等。同时应严格按无菌操作程序进行实验，并做好标记。

[目的要求]

(1)掌握细菌分离培养的基本要领和方法。

(2)掌握厌氧菌培养的原理及其方法。

[实验材料]

菌种：大肠杆菌斜面、大肠杆菌与金黄色葡萄球菌混合培养肉汤等。

器械：剪刀、记号笔(以上小组共用)。

培养基：普通肉汤和普通琼脂斜面、普通琼脂和鲜血琼脂平板、酒精灯、接种环(以上每人一套)。

[需氧性细菌分离培养法]

1．划线分离培养法此法为常用的细菌分离培养法。平板划线培养的方法甚多，可按各人的习惯选择应用，其目的都是达到使被检材料适当的稀释，以求获得独立单在的菌落，防止发育成菌苔，以致不易鉴别其菌落性状。划线培养时须注意以下几点：

(1)左手持皿，用左手的拇指、食指及

中指将皿盖揭开呈20。左右的角度(角度愈小愈好，以免空气中的细菌进入皿中将培养基污染)。

(2)右手持接种环，从大肠杆菌与金黄色葡萄球菌混合培养肉汤中取少许材料涂布于培养基边缘，然后将接种环上多余的材料在火焰中烧毁，待接种环冷却后，再与所涂材料的地方轻轻接触，开始划线，方法如图(5-l)。

(3)划线前先将接种环稍稍弯曲，这样易和平皿内琼脂面平行，不致划破培养基。

(4)划线中不宜过多地重复旧线，以免形成菌苔。

(5)接种完毕，在皿底上作好菌名、日期和接种者等标记，平皿倒扣，置37℃培养。

2．纯培养的获得与移植法将划线分离培养37℃24h的平板从温箱取出，挑取单个菌落，经染色镜检，证明不含杂菌，此时用接种环挑取单个菌落，移植于琼脂斜面培养，得到的培养物，即为纯培养物，再作其他各项试验检查和致病性试验等。具体操作方法如下：

(1)两试管斜面移植时，左手斜持菌种管和被接种琼脂斜面管，使管口互相并齐，管底部放在拇指和食指之间，松动两管棉塞，以便接种时容易拔出(图5—2)。右手持接种棒，在火焰上灭菌后，用右手小指和无名指并齐同时拔出两管棉塞，将管口进行火焰灭菌，使其靠近火焰(图5—3)。将接种环伸入菌种管内，先在无菌生长的琼脂上接触使之冷却，再挑取少许细菌后拉出接种环立即伸入另一管斜面培养基上，勿碰及斜面和管壁，直达斜面底部。从斜面底部开始划曲线，向上至斜面顶端为止，管口通过火焰灭菌，将棉塞塞好(图5—4)。接种完毕，接种环通过火焰灭菌后放下接种棒。最后在斜面管壁上注明菌名、日期和接种者，置37℃温箱中培养。

(2)从平板培养基上选取可疑菌落移植到琼脂斜面上作纯培养时，则用右手执接种棒，将接种环火焰灭菌，左手打开平皿盖，挑取可疑菌落，左手盖上平皿盖后立即取斜面管，按上述方法进行接种、培养。

3．肉汤增菌培养为了提高由病料中分离培养细菌的机会，在用平板培养基做分离培养的同时，多用普通肉汤做增菌培养，病料中即使细菌很少，这样做也多能检查出。另外用肉汤培养细菌，以观察其在液体培养基上的生长表现，也是鉴别细菌的依据之一。其操作方法与斜面纯培养相同：无菌取病料少许接种增菌培养基或普通肉汤管内于37℃下培养。

4．穿刺培养半固体移植用穿刺法接种。方法基本上与纯培养接种相同，不同的是用接种针挑取菌落，垂直刺人培养基内。要从培养基表面的中部一直刺入管底，然后按原方向退出即可。

5. 倾注培养法取3支融化后冷却至45℃左右的琼脂管，用接种环取一环培养物移至第一管内，摇匀。从第一管取一接种环至第2管，振荡。再由第2管取一接种环至第3管，混匀。将3管含有培养物的琼脂分别倒入3个灭菌培养皿内做成平板，凝固后倒放于37℃恒温箱内培养，24h后观察结果。第一管的平板菌数甚多，而第2、第3管之平板则渐渐减少，此法现在应用较少。