细菌的培养与分离技术ppt课件
微生物菌种分离(共61张PPT)
平板划线法
斜线法 曲线法 方格法 放射法 四格法
平板划线法
斜线法：
用接种环以无菌操作挑取菌悬液一环，先在平板 培养基的一边作第一次平行划线3-4条，再转动培 养皿70°角，并将接种环上剩余物烧掉，待冷却 后通过第一次划线部分作第二次平行划线，再用 同法通过第二次平行划线部分作第三次平行划线 和通过第三次平行划线部分作第四次平行划线。
琼脂固体 培养基
(1882年)
很多细菌不能
在土豆上生长
明胶高温易溶化
不能37°C培养
一直沿用至今
微生物纯培养分离技术
纯培养物分离方法
固体培养基分离
涂布平板法 平板划线法 平板倾注法 稀释摇管法
液体培养基分离
单细胞（孢子）分离 选择培养分离
涂布平板法
1、少量样品加到平板中央（1mL） 2、玻璃三角涂棒浸入酒精 3、沾有酒精的涂棒在火焰上灼烧后使其冷却 4、无菌涂棒将样品均匀涂布琼脂培养基表面，适当条件下培养
Technology
Erko Stackebrandt, DSMZ, Braunschweig, Germany
微生物菌种鉴定技术
1923(1)、1925(2)、1930(3)、1934(4)、1939(5)、1948(6)、1957(7)、1974(8)、 1994(9)
伯杰氏鉴定细菌学手册
Bergey's Manogy
产生新的问题：将有越来越多的分类单元不能只以表型 特征进行鉴别，必须结合基因型测定才能鉴定。
微生物菌种鉴定技术
表征（表型）特征
形态特征 生理和代谢特征 生态特征
遗传（基因型）特征
蛋白质比较 核酸碱基组成 核酸序列
分子标尺
多相鉴定技术
实验四：细菌的接种、培养和分离技术
实验四：细菌的接种、培养和分离技术一、实验目的与要求：（1）掌握从环境土壤、水体、活性污泥等中分离培养细菌的方法;从而获得若干种细菌纯培养技能（2）掌握细菌纯种分离的方法：稀释平板分离法和平板划线法..（3）掌握几种接种技术：斜面接种技术、穿刺接种、稀释平板涂布法等..二、实验原理在土壤、水、空气或人及动、植物体中;不同种类的微生物绝大多数都是混杂生活在一起;当我们希望获得某一种微生物时;就必须从混杂的微生物类群中分离它;以得到只含有这一种微生物的纯培养;这种获得纯培养的方法称为微生物的分离与纯化..为了获得某种微生物的纯培养..一般是根据该微生物对营养、酸碱度、氧等条件要求不同;而供给它适宜的培养条件;或加入某种抑制剂造成只利于此菌生长;而抑制其他菌生长的环境;从而淘汰其他一些不需要的微生物;再用稀释涂布平板法或稀释混合平板法或平板划线分离法等分离、纯化该微生物;直至得到纯菌株..三、实验器材1、牛肉膏蛋白胨培养基2、盛9ml无菌水的试管;盛90m1无菌水并带有玻璃珠的三角烧瓶;1ml和5ml无菌吸管;无菌培养皿；3、接种环;土样;酒精灯等..四、操作步骤1、倒平板将加热融化的牛肉膏蛋白胨培养基倒平板;并标明培养基的名称..2、贴标签接种前在试管上贴上标签;注明菌名、接种日期、接种人姓名等..贴在距试管口径2-3厘米的位置..3、点燃酒精灯..4、接种取接种环右手拿接种环如握钢笔一样、在火焰上将环端烧红灭菌;然后将有可能伸入试管的其余部分;均用火烧过灭菌..环冷却将灼烧过的接种环伸入菌种管;先使环接触边壁;使其冷却..取菌种待环冷却后轻轻沾取经稀释10倍的土壤悬液-环;然后将接种环移出菌种管;注意不要使环的部分碰到管壁;取出后不可使环通过火焰..接种在火焰旁迅速将沾有菌种的接种环在平板上划线..划线的方法很多;但无论哪种方法划线;其目的都是通过划线将样品在平板上进行稀释;使形成单个菌落..常用的划线方法有下列二种：⑴用接种环以无菌操作挑取土壤悬液一环;先在平板培养基的一边作第一次平行划线3-4条;再转动培养皿约70°角;并将接种环上剩余物烧掉;待冷却后通过第一次划线部分作第二次平行划线;再用同法通过第二次平行划线部分作第三次平行划线和通过第三次平行划线部分作第四次平行划线图A..划线完毕后;盖上皿盖;倒置于温室培养..⑵将挑取有样品的接种环在平板培养基上作连续划线图 B..划线完毕后;盖上皿盖;倒置温室培养..环灭菌将接种环烧红灭菌..5、挑菌将培养后长出的单个菌落分别挑取接种到上述三种培养基的斜面上;分别置25℃和28℃温室中培养;待菌苔长出后;检查菌苔是否单纯;也可用显微镜涂片染色检查是否是单一的微生物;若有其他杂菌混杂;就要再一次进行分离、纯化;直到获得纯培养..四、注意事项1、实验操作过程中无菌操作..。
细菌培养基的制备、灭菌及接种、培养技术ppt课件
目的要求
掌握从环境中分离培养细菌的方法，从 而获得若干种细菌纯培养技能。 掌握几种接种技术。
21
实验材料
无菌培养皿(直径90mm)10套、无菌移液管1mL2
支、10mL1支。
营养琼脂培养基1瓶，活性污泥或土壤或湖水1瓶， 无菌稀释水90mL1瓶、9mL5管。 其它：接种环、酒精灯、恒温箱。
22
c. 第三次蒸煮之后基本无菌，但为了确保无菌仍要放 在37℃恒温条件下培养24h，确定无菌才能使用。
18
实验程序4
（培养基和玻璃器材的灭菌方法）
过滤除菌法： 不能用加热灭菌的 液体物质（如维生 素、血清），一般 可用细菌过滤器进 行除菌。
19
第二部分 细菌纯种分离、培养和接
种技术
目的要求 实验材料 实验程序
9
实 验 程 序2
（培养基的配制方法和步骤） 3. 调pH值：用10％ NaOH调pH至7.6，用精 密pH试纸对照。 4. 分装：将培养基分装于5支试管，其余全部 倒入250mL锥形瓶中，分别塞上棉塞。注意 不要污染棉塞和瓶口。 5. 包扎成捆，挂上标签，注明何种培养基。 6. 灭菌备用：培养基灭菌后必须在37℃下恒 温培养24h，确定无菌生长，方可使用。
实验二
细菌培养基的配制、灭 菌及接种、培养技术
1
第一部分 细菌培养基的制备、灭菌
目的要求 实验材料 实验程序
2
目的要求
熟悉玻璃器皿的洗涤和灭菌前的准备。 掌握培养基和无菌水的制备方法。 掌握高压蒸气灭菌技术。
3
实验材料
药品：牛肉膏、蛋白胨、氯化钠、琼脂、蒸馏水等。
高压蒸气灭菌锅、烘箱、细菌过滤器、酒精灯。 其它：培养皿、试管、移液管、锥形瓶、烧杯、玻 璃珠等。
细菌分离培养、接种技术及培养方法-精品医学课件
革兰染色法
Gram staining
临床微生物与免疫学检验教研室
一、实验目的
1.掌握细菌涂片制作方法； 2.掌握革兰染色法和细菌的基本形态； 3.了解革兰染色法的临床意义。
二、革兰染色原理
原理
细胞壁学说 等电点学说 化学学说
革兰阳性菌 细胞壁肽聚糖形成网状 结构，乙醇处理时，脱水 引起网状结构孔径变小， 通透性降低，结晶紫-碘 复合物不易脱去
实验步骤和方法
1)连续划线分离法：①将接种环火焰灭菌，待冷后取标 本少许；②左手持平板，五指固定平皿盖边缘，向外反 转手掌，装有培养基的平板于手掌内用拇指、小指和 无名指固定，并将平板边缘稍微提高呈现30～45度角， 置酒精灯前上方5～6cm；③右手持已取材的接种环， 先在平板一端涂布，然后快速大幅度左右来回以密而 不重的曲线形式作连续划线接种，使整个平板布满曲 线④划线完毕，将平板作好标记，置35℃孵育18-
革兰阴性菌
细胞壁肽聚糖含量低， 脂类物质含量高，乙醇处 理时，脂类物质溶解，细 胞壁的通透性增加，结晶 紫-碘复合物易脱去
三、实验器材和试剂
1.标本 ：金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌的培养物。 2.试剂 ：革兰染液。 3.其他 ：载玻片、生理盐水、接种环、酒精灯、显微镜。
四、操作步骤
1. 细菌涂片制备 ⑴涂片：取洁净载玻片一张，按无菌的方法取1~2环生 理盐水于载玻片上，按无菌的方法各取葡萄球菌和大肠埃 菌 培养物少许，在生理盐水中均匀研磨，涂好的菌膜直径 1cm左右。 ⑵干燥：室温下自然干燥或于酒精火焰半尺高处烘干。 ⑶固定：火焰加热法。目的是杀死细菌，并使菌体与载 玻片粘附牢固，染色时不致于被染液和水冲掉。
培养方法
2 二氧化碳培养法 (1)二氧化碳孵箱：能自动调节二氧化碳的含量和温度， 使用较为方便。 (2)烛缸法：取有盖磨口标本缸或玻璃干燥器，在盖及磨 口处涂以凡士林。将接种细菌的培养基放入缸中，点燃 缸内蜡烛，加盖密封。当蜡烛燃烧时会消耗缸内氧气并 产生CO2，随着缸内氧气的逐渐减少，蜡烛会自行熄 灭，此时缸内CO2浓度约为5％左右。 (3)化学法(重碳酸钠一盐酸法)：（自学）
《细菌的培养方法》课件
细菌的培养是一项重要的实验技术，本课件将介绍细菌培养的各种方法和技 巧，以及培养过程中需要注意的条件和控制。
培养基的选择
培养基的种类和配方
了解不同种类和配方的培养基，选择适合特定细菌的培养基。
不同细菌所需的基本营养成分
掌握不同细菌所需的营养成分，为其提供合适的生长环境。
3
接种
学习不同接种方法，将细菌转移到培养基上进行生长。
4
培养箱的使用
了解培养箱的操作和使用技巧，提供稳定的培养环境。
常见细菌的培养方法
普通细菌的培养
介绍培养常见细菌的 方法和技巧，如大肠 杆菌等。
必需营养物细菌 的培养
了解必需营养物细菌 的培养方法，满足其 特殊的营养需求。
厌氧菌的培养
掌握培养厌氧菌的技 术，为其提供合适的 生长环境。
培养技术
1 纯培养
学习如何进行细菌的纯培养，以获得纯净的 细菌培养物进行研究。
2 混合培养
了解混合培养技术，用于培养多种细菌共存 的环境。
3 原代培养
学习如何进行原代培养，从样品中分离出单 个细菌菌落进行培养。
4 经过子代培养
掌握细菌的连续培养方法，保持菌株的稳定 性和可用性。
培养条件的控制
温度
难以培养细菌的 培养
解决难以培养细菌的 挑战，探索新的培养 方法和技术。
语
细菌培养的实际应用
探索细菌培养在科学研究、医学和工业中的实际应 用。
细菌培养的限制和进展
讨论细菌培养所面临的限制，并展望未来的发展和 创新。
了解细菌对温度的适 应性，并控制培养环 境的温度以促进生长。
pH值
掌握细菌生长所需的 最适pH范围，并调节 培养基的酸碱度。
细菌的培养与分离技术
细菌的培养与分离技术● 考点◇ 基本条件◇ 细菌的接种与分离技术◇ 细菌培养的方法◇ 细菌的生长现象◇ 细菌L型的检查【内容讲解】细菌培养是将细菌接种到培养基内，并在适当的环境内，使细菌生长和繁殖。
分离培养是指从标本中培养出细菌或者从混有多种细菌的标本中将各个菌种分别同时培养出来。
一、基本条件（一）细菌实验室（二）无菌实验室（三）基本设备和器具（一）细菌实验室标本接种、培养、分离、鉴定及药敏试验等工作都要在此完成。
1.细菌室必须安装严密的门窗，以防室内环境受到外界的污染。
且室内禁用风扇，避免细菌的播散。
2.细菌室必须安装供空气消毒的紫外线灯，置于操作台上面lm处，每天开始工作前照射20min。
对其消毒效果要定期检查，及时更换失效的灯管。
3.室内应备有消毒剂，用于试验中发生菌液洒溅时的及时消毒处理。
同时还应备有供工作人员浸手用的盛有消毒剂的水盆、肥皂及自来水源等。
4.室内操作台须每日用消毒剂擦洗，地面至少一周用消毒剂擦洗l次。
5.对接收的标本、无菌器具、用过的物品等应明显分开并放在指定位置。
同时要对用过的物品及时进行灭菌处理。
6.细菌室根据当地的气温特点，安装空调机，以适合细菌实验工作。
同时室内应设置必要的消防设备。
（二）无菌实验室无菌实验室是细菌实验室内用于无菌操作的小室，其内部装饰、消毒条件要求更严格。
1.无菌室应完全封闭，人员出入应有两道门，其间应隔有缓冲区。
2.用前应以紫外线消毒30min，定期用乳酸或甲醛熏蒸，彻底消毒。
3.在无菌室中一般仅限于分装无菌的培养基及传染性强的细菌的接种，不进行有菌标本的分离及其他操作。
4.无菌室内应仅限操作人员进入，而且进入无菌室应着隔离衣和专用鞋，操作时戴口罩，随时保证室内的无菌状态。
5.条件有限的实验室，可用超净工作台代替无菌实验室进行相应的操作。
超净工作台应选择垂直气流通风方式。
6.无菌室应配备空调设备，保证不因室温而影响工作。
（三）基本设备和器具温箱、C02培养箱、厌氧培养设备；显微镜；高压蒸气灭菌器、干烤箱；冰箱和冷藏柜；接种器具，包括接种环和接种针；pH计；火焰灯或酒精灯；平皿、试管、吸管等玻璃器皿，以及离心机、天平等。
细菌的培养与分离
– 蛋白胨、肉浸液、牛肉膏、糖（醇）类、血 液、鸡蛋和动物血清、无机盐类、生长因子
2.水：蒸馏水或去离子水 3.凝固物质：即赋形剂，常用琼脂、明胶
一、培养基
4.抑制剂
– 抑制非检出菌的生长或使其少生长，以利于检 出菌的生长。
– 胆盐、煌绿、亚硫酸钠、某些染料及抗生素等。
5.指示剂
– 常用的指示剂：酚红、中性红、中国蓝、溴甲 酚紫、酸性复红等。
– 菌落：单个细菌在培养基上分裂繁殖成一堆肉 眼可见的细菌集团 • CFU：菌落形成单位，活菌计数用
– 细菌菌落的描述：大小、形状、突起或扁平、 边缘、颜色、表面、透明度等
二、细菌的人工培养
2. 在液体培养基中
– 均匀混浊：大多数细菌 – 沉淀生长：呈链状排列的细菌 – 表面生长：专性需氧菌
3.在半固体培养基
一、培养基
（二）培养基分类
1. 按用途分类
– 基础培养基：只有基本营养成分 – 营养培养基：加有血液 、血清等 – 鉴别培养基：含有特定底物和指示剂 – 选择培养基：含有抑制剂 – 特殊培养基：厌氧、细菌L型
一、培养基
2.按物理性状分类
– 液体培养基：增菌 – 固体培养基：分离培养、纯化、增菌 – 半固体培养基：动力检测、保存菌种
• 无菌技术是保证细菌检验质量，防止污染和病原 菌扩散的基础
二、细菌的人工培养
（二）细菌的接种与分离方法
1.平板划线法：分离单个菌落 2.琼脂斜面接种法：纯培养 3.液体培养基接种法 ：增菌 4.穿刺接种法：观察细菌动力 5.涂布平板法：计数细菌源自量 6.倾注接种法 ：纸片法药敏试验
分区划线分离法
– 琼脂斜面：分装量为试管的1/4~1/3，灭菌后趁 热摆成斜面，斜面长度约为试管的2/3。
细菌的培养与分离技术
玻璃器皿灭菌前的准备
玻璃器皿在清洗、干燥后必须经正确的 包裹和加塞后才能进行灭菌处理。
培养基的成分和作用
培养基：是指人工
配制的适合细菌生
长繁殖的综合营养
基质。
水
01
03
抑制剂
05
02
04
06
营养物质：蛋白胨、 肉浸液、牛肉膏、 糖醇类、血液、鸡 蛋和动物血清、生 长因子、无机盐类
凝固剂：琼脂、明 胶
假设2ml培养基矫正pH至7.4时需0.1mol/L NaOH 0.12ml，现有培养基1000ml，求需 加NaOH的量。
设需加NaOH的量为Xml。
2：1000＝0.12：X
X=
0.12×1000
＝ 60ml 0.1mol/L NaOH
2
60÷10＝6ml 1mol/L NaOH
细菌的接种与培养
05
第三区划线
02
灭菌接种环
04
灭菌接种环
06
灭菌接种环
连续划线法
细菌培养法
一般培养（需氧培 养）：
○ 培养温度： 35℃（采用恒 温培养箱）
○ 培养时间： 18～24h
二氧化碳培养法： 烛缸法、二氧化 碳培养箱
厌氧培养法：厌 氧培养箱、厌氧 袋、厌氧罐、疱 肉培养法、硫乙 醇酸盐法等
细菌在固体培养基中的生长现象
细菌接种法
平板划线接种法： ★目的：使混合的细菌呈单个分散生长，形成
单个菌落，以便获得纯菌。 ★方法： ★分区划线法：适用于含菌量较多的标本 ★连续划线法：适用于含菌量较少的标本
液体培养基接种法 穿刺接种法 :用于观察细菌动力 斜面接种法 倾注培养法:用于细菌计数
分区划线法
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液体培养基接种法 穿刺接种法 :用于观察细菌动力 斜面接种法 倾注培养法:用于细菌计数
分区划线法
第一区划线 灭菌接种环 第二区划线 灭菌接种环 第三区划线 灭菌接种环
连续划线法
细菌培养法
一般培养（需氧培养）： ★培养温度：35℃（采用恒温培养箱） ★培养时间：18～24h
二氧化碳培养法：烛缸法、二氧化碳培 养箱 厌氧培养法：厌氧培养箱、厌氧袋、厌 氧罐、疱肉培养法、硫乙醇酸盐法等
厌氧培养基：用于培养厌氧菌
培养基pH测定及矫正
材料： 待测培养基、 pH7.4标准比色管、4孔比色架、0.02％酚红、 氢氧化钠0.1mol/L、1mol/L） 盐酸（0.1mol/L、1mol/L） 蒸馏水 试管（与比色管口径一致）、 刻度吸管（5ml、1ml、0.5ml、0.25ml）、
pH矫正
基础培养基：培养营养要求不高的细菌，如普通 平板
营养培养基：能满足营养需求较高细菌的生长， 如血平板
鉴别培养基：含有某些特定的底物，用于鉴别细 菌，如克氏双糖培养基（KIA）
选择培养基：具有选择性抑制作用，用于选择性 的培养目的菌，如SS平板
增菌培养基：促进目的菌的生长，适用于含菌量 较少的标本，如葡萄糖肉汤。
细菌的培养与分离技术
培养基
常用玻璃器材的准备 培养基的成分和作用 培养基的种类 培养基的制备
常用玻璃器材的准备
玻璃器材的种类及用途 玻璃器材的清洗 ★新购置的玻璃器材：1％～2％盐酸浸泡－→清 水清洗 ★用过的无污染器皿：洗涤剂洗刷－→清水清洗 细菌污染的器材：消毒灭菌后再洗刷 ★盛培养基试管和平皿：高压灭菌－→趁热倒出 －→洗涤剂洗刷－→清水冲洗 ★吸管：3％来苏浸泡－→清水冲洗 ★玻片和盖玻片：3％来苏和清洁液浸泡－→清水 冲洗；染色后的玻片，应肥皂水煮沸10min再洗 涤 ★含油脂的器皿：单独灭菌
玻璃器皿灭菌前的准备
玻璃器皿在清洗、干燥后必须经正确的 包裹和加塞后才能进行灭菌处理。
培养基的成分和作用
培养基：是指人工配制的适合细菌生长繁殖的 综合营养基质。 营养物质：蛋白胨、肉浸液、牛肉膏、糖醇类、 血液、鸡蛋和动物血清、生长因子、无机盐类 水 凝固剂：琼脂、明胶 抑制剂 指示剂
培养基的种类（按用途分类）
混浊 沉淀：多见于链状排列的细菌 菌膜：多见于厌氧菌
细菌在半固体培养基中的生长现象
有鞭毛细菌：在培养基中沿穿刺线并向 外扩散生长，穿刺线边缘模糊。 无鞭毛细菌：只沿穿刺线生长，穿刺线 边缘清晰。
菌落
菌落与菌苔
细菌在液体培养基中的生长现象
细菌在半固体培养基中的生长现象
无动力 现象
有动力 现象
水
培养基
酚红 指示剂
培养基
比色管
目视
pH矫正
蒸 待馏 测水 管
标准比培养基 色
管
过酸
蒸 待 测馏 水 管
标 准 比培 养 基 色
管
相同
蒸 待馏 测水 管
标准比培养基 色
管
过碱
计算
假设2ml培养基矫正pH至7.4时需 0.1mol/L NaOH 0.12ml，现有培养基 1000ml，求需加NaOH的量。
设需加NaOH的量为Xml。
2：1000＝0.12：X
X=
0.12×1000 ＝ 60ml 0.1mol/L NaOH
2
60÷10＝6ml 1mol/L NaOH
细菌的接种与培养
无菌技术 细菌检验的操作需在无菌室或超净工作 台内进行。 无菌室、超净工作台使用前后需进行消 毒。 细菌检验使用的物品使用前后需严格灭 菌 标本的采集 无菌试管、烧瓶的使用Leabharlann 细菌在固体培养基中的生长现象
菌落 ★定义：指单个细菌在平板培养基上生长繁殖，形
成单一肉眼可见的细菌集团。 ★菌落特征：大小、形状、边缘、颜色、表面、透
明度、湿润度、黏度、溶血性 ★菌落类型：光滑型（S）、粗糙型（R）、黏液型
（M） 菌苔：指多个菌落融合在一起形成的细菌堆积物。
细菌在液体培养基中的生长现象
细菌接种的基本程序
灭菌接种环 杀灭接种环沾染的细菌，以免污染标本 沾取标本 接种 灭菌接种环 杀灭接种环沾染的细菌，以免污染环境
细菌接种法
平板划线接种法： ★目的：使混合的细菌呈单个分散生长，
形成单个菌落，以便获得纯菌。 ★方法： ★分区划线法：适用于含菌量较多的标本 ★连续划线法：适用于含菌量较少的标本