叶绿体的分离及荧光染色观察
叶绿体的提取与荧光观察
叶绿体的次生 荧光的来由， 橘红色为叶绿 体的荧光效果 黑色部分来自 叶绿体悬液中 混有的细胞核 碎片中的DNA 和RNA，经吖
应，故观察到 斑状分布的火 红色荧光效 果。
啶橙染色荧光 反应呈现绿 色。.
六）注意事项 1、叶绿体的分离应在等渗溶液(0.35mol/L氯化钠)中进行,以免渗透压的 改变使叶绿体受到损伤。 2、分离过程最好在0~5℃的条件下进行；如果在室温下，要迅速分离和 观察。 3、离心机使用：离心管要平衡 4、凡是荧光染料都有一定毒性，请做好防护 5、在荧光观察时应抓紧时间,有必要时立即拍照。 6、在制作荧光显微标本时最好使用无荧光载片、盖片和无荧光油。 7、汞灯开启后15min内不要关闭，关闭后3min内不要开启。
叶绿体的分离与荧光观察
一）实验目的： 1.通过植物细胞叶绿体的分离，了解细胞器分离的一般原理和方法。 2.观察叶绿体的自发荧光和次生荧光，并熟悉荧光显微镜的使用方法。 二）实验原理：
细胞器分离的过程包括两个主要阶段：破碎细胞和细胞组分的分 离。在等渗溶液中进行组织匀浆、分离，叶绿体的分离采用差速离心或 密度梯度 光（次生/诱发荧光）。离心分离技术是分离细胞组分和生物大分子最 常用的分离方法，因为不同的细胞器和分子有不同的体积和密度，可在 不同离心力不同介质沉降分离。
三）实验用品
材料： 菠菜叶片 试剂：蒸馏水，0.35mol/L氯化钠溶液，0.01%吖啶橙(AO) 仪器：普通离心机，组织捣碎机，天平，荧光显微镜，显微镜，镊子， 培养皿，纸，移液管，滴管，烧杯，无荧光载片，盖玻片，离心管,吸 水纸等 四）实验步骤： 1、叶绿体悬浮液的制备 菠菜叶片(去叶脉)3g → 0.35mol/L氯化钠15ml→研磨→匀浆过滤(6层纱 布)→滤液在1000r/min离心2min→弃沉淀，上清液3000r/min离心5min → 去上清液→沉淀为叶绿体(混有部分细胞核)，用0.35mol/L氯化钠溶液悬 浮 →滴片观察 2、叶绿体的显微与荧光观察 取叶绿体悬液1滴置于载玻片上，加盖玻片后用分别用普通光学显微镜 观察叶绿体的形态结构和荧光显微镜观察自发荧光。 将叶绿体悬液滴在无荧光的载玻片上,再滴加1滴0.01%吖啶橙荧光染
实验二叶绿体的分离与荧光观察
叶绿体荧光产生的机制
荧光产生
叶绿体在接受光能后，将能量转化为活跃的化学能，这个过程会产生荧光。荧光是一种光发射现象，发生在叶绿 素和其他色素分子吸收光能后。
荧光类型
根据荧光产生的机制，可以将荧光分为自发性荧光和诱导荧光。自发性荧光是指色素分子自发地吸收光能后产生 的荧光；诱导荧光是指通过外部刺激使色素分子吸收光能后产生的荧光。
叶绿体的分离
01
02
03
04
制备匀浆
将新鲜叶片洗净后剪碎，加入 适量的磷酸缓冲液，用匀浆器
充分研磨的转速和时间进行离心分离，
使叶绿体沉淀到底部。
吸取上清液
将上清液吸出，留下叶绿体沉 淀。
重悬浮
将叶绿体沉淀重新悬浮在适量 的溶液中，以便进行后续的荧
光观察。
实验二叶绿体的分 离与荧光观察
目录
• 实验目的 • 实验原理 • 实验步骤 • 结果分析 • 实验结论
01
CATALOGUE
实验目的
掌握叶绿体的分离技术
叶绿体的分离
通过离心、密度梯度离心等技术，从植物组织中分离出叶绿 体。
叶绿体纯化
通过过滤、洗涤等步骤，去除杂质，获得纯度较高的叶绿体 。
了解叶绿体荧光的基本原理
叶绿体分离的原理与方法
原理
叶绿体分离主要依据其密度和大小差异进行。常用的分离方法有差速离心法和密度梯度离心法。差速 离心法是通过逐渐增加离心速度，使不同大小和密度的细胞器分批分离；密度梯度离心法则是在介质 中形成密度梯度，使不同密度的细胞器在梯度中停留并形成不同的区带。
方法
叶绿体分离通常包括细胞破碎、差速离心或密度梯度离心、洗涤和重悬浮等步骤。根据实验需求，可 以选择适当的方法分离纯化叶绿体。
叶绿体的分离及荧光染色观察
叶绿体的分离及荧光染色观察泮力菁 2011级生物基地 201100140091 同组者:商倩倩【实验目的】1、通过植物细胞叶绿体的分离，了解细胞器分离与纯化的原理和方法；2、熟悉荧光显微镜的使用方法，观察叶绿体的自发荧光和间接荧光;3、复习巩固制片及染色的基本技术。
【实验原理】1、真核细胞由细胞膜、细胞核和细胞质组成。
细胞质中含有若干细胞器和细胞骨架,这些结构被称为亚细胞组分。
分离亚细胞组分的方法主要有差速离心和密度梯度离心两种。
2、差速离心和密度梯度离心：差速离心法是在密度均一的介质中由低速到高速的逐级离心用于分离不同大小的物体。
离心速度逐渐提高，样品会按先大后小的顺序沉淀.在差速离心中细胞器沉降的顺序为：细胞核、线粒体、溶酶体和过氧化物酶体、内质网和高尔基体。
最后为核糖核蛋白复合体。
由于各种细胞器在大小和密度上可能相互重叠。
一般差速离心2—3次，分离效果会好一些。
差速离心只用于分离密度和大小悬殊的细胞或细胞器，并且得到的产物纯度较低。
若对产物纯度的要求较高,则需要密度梯度离心来分离纯化。
密度梯度离心法是利用一定的介质在离心管内形成连续的密度梯度，将细胞悬浮液或匀浆置于介质的顶部，通过离心力的作用使细胞或细胞器分层、分离，最后不同密度的细胞或细胞器位于与自身密度相同的沉降区带中。
这种离心技术又可分为速度沉降和等密度沉降两种.速度沉降主要用于分离密度相近而大小不同的物体，而等密度沉降用于分离密度不同的物体.叶绿体是植物细胞所特有的能量转换细胞器。
它是一种比较大的细胞器，利用差速离心即可分离收集,然后用密度梯度离心纯化,便可用于各种研究.3、荧光：光致发光：某些物质在照射下，吸收光能进入激发态，当从激发态进入基态时，可以以电磁辐射的形式释放出吸收的光能，这种现象称之为“光致发光”。
紫外辐射,可见光及红外辐射均可引起光致发光，如磷光与荧光.荧光：在光致发光中，如果一定波长的短波光（如紫外光）照射某种物质，这种物质吸收光能后进入激发态，并立即激发在极短的时间内能发射出比照射光波长更长的光（如可见光），这种光就称为荧光.一旦停止入射光，发光现象也随之立即消失.荧光的性质：A、吸收光，必须有激发光源；B、荧光波长大于激发波长（损失热能）；C、荧光强度小于激发光的强度；D、有不同程度的衰减（影响因素：如温度、光。
叶绿体的分离与荧光观察
04 实验操作流程
实验材料准备
01
02
03
新鲜植物叶片
选择健康、无病虫害的植 物叶片，如菠菜、豌豆等。
实验试剂
包括分离液、荧光染色剂、 缓冲液等。
实验仪器
包括离心机、显微镜、染 色皿、吸管等。
叶绿体的分离
将新鲜叶片洗净，剪成小段， 放入离心管中。
加入适量的分离液，轻轻摇晃 ，使叶片充分浸泡在分离液中
荧光显微镜的工作原理和使用方法
工作原理
荧光显微镜利用特定波长的光激发细 胞内荧光染料或荧光探针发出可见光 ，通过光学系统放大并显示在屏幕上 。
使用方法
使用荧光显微镜时，需要先对样本进 行染色或标记，然后将其置于显微镜 下观察。观察时需要调整光源和滤光 片，以获得最佳的荧光效果。
荧光观察技术在叶绿体研究中的应用
叶绿体形态观察
荧光染料或荧光探针可以标记叶 绿体，通过荧光显微镜观察叶绿
体的形态、数量和分布情况。
叶绿体功能研究
荧光染料或荧光探针可以结合叶绿 体中的色素或蛋白质，通过观察荧 光信号的变化来研究叶绿体的功能 和代谢过程。
叶绿体动力学研究
利用荧光探针标记叶绿体，可以观 察叶绿体的运动和分布情况，了解 其在细胞内的动力学特征。
荧光观察
在荧光显微镜下观察叶绿体，发现叶绿体发出强烈的绿色荧光，表 明叶绿体含有丰富的叶绿素。
细胞壁与细胞质的分离
通过实验操作，成功将细胞壁与细胞质分离，便于后续实验的进行。
结果分析
1 2
叶绿体分离效果
实验结果表明，采用离心和密度梯度离心法能够 获得较为纯净的叶绿体，分离效果较好。
荧光观察的意义
荧光观察能够直观地展示叶绿体的存在和状态， 对于研究叶绿体的功能和结构具有重要意义。
高中生物实验 叶绿体的分离和荧光观察 实验报告
实验十一叶绿体的分离和荧光观察一．实验目的了解细胞匀浆和差速离心分级分离细胞组分的原理。
了解提取叶绿体的基本原理及其过程，通过光学显微镜的观察了解体外分离的叶绿体的一般形态，增加对叶绿体的感性认识。
掌握吖啶橙染色叶绿体的方法。
掌握显微数码拍照的方法。
二．实验内容提取叶绿体，吖啶橙染色，观察染色结果。
显微数码拍照。
三．实验原理将组织匀浆后悬浮在等渗介质中进行差速离心，是分离细胞器的常用方法。
在一定的离心场中，同一时间内，密度和大小不同的颗粒其沉降速度不同。
依次增加离心力和离心时间，就能够使非均一悬浮液中的颗粒按其大小、密度先后分批沉降在离心管底部。
叶绿体的分离应在等渗溶液（0.35mol/LNacl或0.4mol/L 蔗糖溶液）中进行。
离心后可得沉淀的叶绿体。
四．实验方法与步骤1．取嫩叶3g，洗净去柄去叶脉，剪碎放入研钵中。
2．加4ml0.35mol/LNacl，研磨匀浆，尼龙布过滤于离心管中1ml。
3．1000rpm离心2分钟弃去沉淀。
4．3000rpm离心15分钟，弃去上清液，将沉淀用少量0.35mNacl悬浮。
5．提取叶绿体观察：①普通光镜②荧光光镜③加吖啶橙。
6．撕取叶表皮观察：①普通光镜②荧光光镜③加吖啶橙。
a．在普通光镜下，可看到叶绿体为绿色椒榄形，在高倍镜下看到叶绿体内部含有较深的绿色的绿色小颗粒即基粒。
b．在荧光显微镜下，叶绿体发出火红色荧光。
c．加入吖啶橙染后，叶绿体可发也桔红色荧光。
而其中混有的细胞核发出绿色荧光菠菜叶手切片观察。
d．在普通光镜下可以看到三种细胞：表皮细胞：为边缘吐锯齿表的鳞片状细胞。
保卫细胞：为构成气孔的成对存在的肾形细胞。
叶肉细胞：为排成栅状的长形和椭圆形细胞。
5．显微数码拍照。
五．实验结果。
实验1 叶绿体的分离与荧光观察
中国海洋大学实验报告2019年 3 月30 日姓名杨慧慧学号17050031803 系年级海洋生命学院2017 专业生物技术科目细胞生物学实验上课时间周六12节题目实验一叶绿体的分离和荧光观察一、实验目的1.通过植物细胞叶绿体的分离, 了解细胞器分离的一般原理和方法。
2.观察叶绿体的自发荧光和次生荧光, 并熟悉荧光显微镜的使用方法。
二、实验原理1.将组织匀浆后悬浮在等渗介质中进行差速离心，是分离细胞器的常用方法。
2.叶绿体的分离应在等渗溶液中进行, 以免渗透压的改变使叶绿体受到损伤。
3.因为叶绿体有自发荧光，因此用荧光显微镜进行观察。
三、实验用品1.材料：新鲜菠菜。
2.试剂：0.35mol/L氯化钠溶液，0.01%吖啶橙(acridine orange)。
3.器材：(1)主要设备: 普通离心机、组织捣碎机、粗天平、荧光显微镜。
(2)小型器材: 烧杯, 量筒, 滴管, 刻度离心管, 纱布，无荧光载片和盖片。
四、实验步骤与方法一、叶绿体的分离与观察1.选取新鲜的嫩菠菜叶，洗净擦干后去除叶梗脉，称30g于150ml 0.35mol/L NaCl溶液中，装入组织捣碎机。
2.低速匀浆3~5min。
3.将匀浆用6层纱布过滤于500ml烧杯中。
4.每组取滤液4ml，1000r/min下离心2min，弃去沉淀。
5.将上清液在3000r/min下离心5min，弃去上清液，沉淀即含叶绿体(混有部分细胞核)。
6.将沉淀用0.35mol/L NaCl溶液悬浮。
7.取叶绿体悬液一滴滴于载玻片上，加盖玻片后即可在普通光镜和荧光显微镜下观察。
(1)在普通光镜下观察。
(2)在荧光显微镜下观察叶绿体的直接荧光。
(3)在荧光显微镜下观察叶绿体的间接荧光：取叶绿体悬液一滴滴在无荧光载片上，再滴加一滴0.01%吖啶橙荧光染料, 加盖片后即可在荧光显微镜下观察。
二、菠菜叶手撕片观察轻轻撕取新鲜嫩菠菜叶的表皮，展平置于载玻片上，滴加1~2滴0.35mol/L NaCl溶液，加盖片后置显微镜下观察。
实验二 密度梯度离心法分离提纯叶绿体及叶绿体荧光观察
轻轻吸取上清液。
5. 先将50%蔗糖溶液0.4ml加入离心管，再取 15%蔗糖溶液0.4ml小心沿管壁缓缓注入， 不能搅动50%蔗糖液面，使两种溶液界面 可见，制成密度梯度。
三、实验用品
1. 材料：新鲜菠菜叶 2. 器材：光学显微镜、台式高速冷冻离心机，
研钵、剪刀、托盘、玻皿等 3. 试剂： （1）匀浆介质（0.25 mol/L蔗糖、
0.05 mol/L Tris-HCI缓冲液，pH7.4）（2） 50%蔗糖溶液，（3）15%蔗糖溶液。
四、实验步骤
1. 洗净菠菜叶，尽可能使它干燥，去掉叶柄、 主脉后，称取2~3g，剪碎置研钵中。
6. 加入0.4ml上清液，严格平衡离心管后，用 水平转头8000r/min离心，20min。
7. 用滴管轻轻吸出界面处的溶液，滴于载玻 片上，盖上盖玻片后，显微镜下观察。另 取部分溶液在暗室内用荧光显微镜直接观 察。（角转取中间靠壁的叶绿体）
五、作业
• 分离的叶绿体是否纯净？试分析原因。 • 实验报告
实验二 密度梯度离心法 分离提纯叶绿体及叶绿体
荧光观察
一、实验目的
• 学习密度梯度法，分离提纯菠菜叶 绿体及叶绿体的荧光显微镜观察。
二、实验原理
❖一个颗粒在离心场中的沉降速率取决于颗 粒的大小、形状和密度，也同离心力以及 悬浮介质的粘度有关；
❖用两种浓度的蔗糖溶液制成的梯度，在 离心条件下，叶绿体和比它沉降系数小 的细胞组分聚集到梯度交界处，而沉降 系数较大的细胞组分沉到离心管底部， 这样，可粗略地分离叶绿体。
叶
叶绿体的分离纯化及荧光观察
叶绿体的分离纯化及荧光观察叶绿体是植物细胞中的一种细胞器，它是进行光合作用的主要场所。
叶绿体具有一定的自复制能力，可以独立分离出来，纯化叶绿体样品可以方便地进行进一步的实验研究。
本文将详细介绍叶绿体的分离、纯化以及荧光观察的方法。
一、叶绿体的分离1.实验材料准备为了分离叶绿体，我们需要充足的植物组织样品。
可以选择新鲜的叶片或者细胞培养物作为实验材料。
同时，需要准备好一系列试剂，例如缓冲液、葡萄糖、EDTA、PEG等。
2.组织破碎和提取液的准备首先，将植物组织样品冷冻在液态氮中，然后用超声波处理器将样品破碎。
接下来，将破碎的样品用缓冲液溶解，加入适量的葡萄糖和EDTA。
将溶解后的样品在低温条件下离心，然后取出上清液。
3.叶绿体的沉淀将提取液中的上清液用PEG逐渐沉淀叶绿体。
首先加入PEG溶液，并轻轻搅拌。
然后，将样品在低温条件下离心，离心后会出现一个绿色的沉淀。
这个沉淀就是叶绿体。
4.叶绿体的洗涤和纯化将叶绿体的沉淀用缓冲液洗涤数次，然后用离心将叶绿体沉淀下来。
最后，将沉淀的叶绿体用缓冲液悬浮，即可得到纯化的叶绿体样品。
二、叶绿体的荧光观察1.荧光探针的准备为了观察叶绿体的荧光，我们需要准备好合适的荧光探针。
通常使用的探针有二苯基苯酚（DPBF）和二聚(4-乙基-5-（4-甲基吡啶氧基）-2-溴脱氧葡萄糖（DAB）等。
2.荧光探针的添加将纯化的叶绿体置于含有荧光探针的溶液中，静置一段时间。
荧光探针会与叶绿体中的一些分子发生作用，从而产生荧光。
3.荧光观察使用荧光显微镜观察叶绿体的荧光。
将样品放置于荧光显微镜下，设置合适的激发波长和观察波长。
然后观察荧光显微镜中的图像，即可看到叶绿体的荧光。
4.结果分析通过观察叶绿体的荧光，可以得到关于叶绿体活性和光合作用效率的信息。
例如，如果观察到荧光强度较高，可以推测叶绿体的光合作用效率较低。
总结：叶绿体的分离、纯化及荧光观察是研究植物生物学和光合作用的重要方法之一、通过正确的操作流程和合适的实验材料，可以得到纯化的叶绿体样品，并通过荧光观察了解叶绿体的活性和光合作用效率。
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叶绿体的分离及荧光染色观察泮力菁 2011级生物基地 201100140091 同组者：商倩倩【实验目的】1、通过植物细胞叶绿体的分离，了解细胞器分离与纯化的原理和方法；2、熟悉荧光显微镜的使用方法，观察叶绿体的自发荧光和间接荧光；3、复习巩固制片及染色的基本技术。
【实验原理】1、真核细胞由细胞膜、细胞核和细胞质组成。
细胞质中含有若干细胞器和细胞骨架，这些结构被称为亚细胞组分。
分离亚细胞组分的方法主要有差速离心和密度梯度离心两种。
2、差速离心和密度梯度离心：差速离心法是在密度均一的介质中由低速到高速的逐级离心用于分离不同大小的物体。
离心速度逐渐提高，样品会按先大后小的顺序沉淀。
在差速离心中细胞器沉降的顺序为：细胞核、线粒体、溶酶体和过氧化物酶体、内质网和高尔基体。
最后为核糖核蛋白复合体。
由于各种细胞器在大小和密度上可能相互重叠。
一般差速离心2-3次，分离效果会好一些。
差速离心只用于分离密度和大小悬殊的细胞或细胞器，并且得到的产物纯度较低。
若对产物纯度的要求较高，则需要密度梯度离心来分离纯化。
密度梯度离心法是利用一定的介质在离心管内形成连续的密度梯度，将细胞悬浮液或匀浆置于介质的顶部，通过离心力的作用使细胞或细胞器分层、分离，最后不同密度的细胞或细胞器位于与自身密度相同的沉降区带中。
这种离心技术又可分为速度沉降和等密度沉降两种。
速度沉降主要用于分离密度相近而大小不同的物体，而等密度沉降用于分离密度不同的物体。
叶绿体是植物细胞所特有的能量转换细胞器。
它是一种比较大的细胞器，利用差速离心即可分离收集，然后用密度梯度离心纯化，便可用于各种研究。
3、荧光：光致发光：某些物质在照射下，吸收光能进入激发态，当从激发态进入基态时，可以以电磁辐射的形式释放出吸收的光能，这种现象称之为“光致发光”。
紫外辐射，可见光及红外辐射均可引起光致发光，如磷光与荧光。
荧光：在光致发光中，如果一定波长的短波光（如紫外光）照射某种物质，这种物质吸收光能后进入激发态，并立即激发在极短的时间内能发射出比照射光波长更长的光（如可见光），这种光就称为荧光。
一旦停止入射光，发光现象也随之立即消失。
荧光的性质：A、吸收光，必须有激发光源；B、荧光波长大于激发波长（损失热能）；C、荧光强度小于激发光的强度；D、有不同程度的衰减（影响因素：如温度、光。
猝灭剂等，因此可以先拍照，后观察）；E、荧光强度取决于激发光强度，被检物浓度、荧光效率（在制作荧光显微标本时最好使用无荧光载玻片、盖玻片和香柏油）。
荧光显微镜的光源有汞灯光源（提供激发光：U,V,B,G），疝灯光源：高峰值更宽，更稳定）。
4、荧光显微镜及其操作的注意事项：激发光源启动后，15min之内不得关闭电源，一旦关闭电源，3min内不得重新启动；光路对中；选择相对应的激发滤片，阻断滤片和双色滤片；需照片时，应该及时拍照，否则效果可能会降低。
激发滤片：得到想要的激发光；双色镜：三角棱镜。
起分离激发光和荧光的作用；阻断滤片：阻挡未转化成荧光的激发光，三者组合成为激发滤块；荧光显微镜的物镜与标本离得较近，用于多收集荧光；5、染色剂吖啶橙：A、探针特性：AO是三环杂芳香类荧光探针，既可以标记DNA，又可以标记RNA，用蓝光激发后能够发出绿、红两种荧光；AO与核酸的结合分为强结合方式和弱结合方式两种：一种是嵌入核酸双链的碱基对之间，另一种是与单链核苷酸的磷酸发生静电间相互作用。
强结合作用又称插入性方式。
AO分子插入在双链核酸的碱基对之间，它们的结合能量为6-10kcal/mol探针，插入后的探针分子与核酸结合更加稳定，每插入一个AO分子，双链结构就发生26度旋转，这样在一个位点上就限制了AO分子插入的数目，每隔三个碱基插入一个AO分子，这种方式的结合，主要是AO分子与DNA结合，其荧光发射峰为530nm，呈绿色荧光。
弱结合方式：即静电吸引结合方式，带正电荷的AO分子与带负电荷的磷酸和结合，每个磷酸根的位点上均可结合一个AO分子，最大结合率为1:1，这种结合方式主要是AO分子与RNA结合，其发射波长为640nm呈红色荧光。
AO愈合素昂的结合在低浓度下最佳，此时插入性强结合作用方式占优势。
B、AO的主要应用：对细胞内单链或双链DNA/RNA定性或定量测定；分析核酸内部结构及核酸的细胞成分构象；观察DNA凝胶电泳情况；作为细胞内PH梯度的显示剂，用来检测离子交换，钙离子诱导的质子浓度梯度变化等。
【实验器材】1、材料：新鲜菠菜；2、试剂：吖啶橙染色剂；0.35mol/L 的NaCl溶液；3、实验器材：普通或高速离心机；电子天平；荧光显微镜；剪刀；滴管；离心管；盖玻片，载玻片；镊子；普通显微镜等；【实验步骤】1、选取新鲜嫩滤菠菜叶,去叶梗及粗脉,洗净擦干，称30克放于150ml 0.35M.Nacl 溶液中；2、将叶、液同装入组织捣碎机中，匀浆3–5分钟，转速5000r/min；3、将匀浆用纱布(6层)过滤于500ml 烧杯中；4、取滤液4ml在1000r /min 下离心2min；5、取上层清液在3000r /min下离心5min(沉淀为叶绿体和细胞核混合物)；6、将沉淀用2-3ml 0.35MNaCl 溶液悬浮；7、取一滴悬液滴片，加盖片后显微镜下观察；8、另取一滴悬液滴片，再滴加一滴0.01%的吖啶橙染料，混匀，盖上盖片，在荧光显微镜下观察。
9、另取新鲜叶片，从叶片的下表面撕取表皮制成装片，在普通显微镜及荧光显微镜下分别观察气孔及气孔周围的叶绿体。
【实验结果】1、实验图片：图1：普通光学显微镜下的菠菜叶片表面气孔图2：荧光显微镜下的气孔周围的叶绿体（红色）（右为放大后的涂片）图3：普通光学显微镜下的叶绿体图4：荧光显微镜下的叶绿体 图5：吖啶橙染色后荧光显微镜下的叶绿体 气孔 叶绿体叶绿体2、实验结果：A、气孔为成对存在的肾形保卫细胞构成，保卫细胞中含有叶绿体，保卫细胞中的叶绿体发出红色荧光并围绕气孔排列一圈（如图1图2）；B、普通光学显微镜下，叶绿体为绿色，橄榄形，若在高倍镜下观察，可以看到叶绿体内部含有颜色较深的绿色小颗粒，即基粒；C、使用荧光显微镜，在选用B激发滤片，B双色镜和O530阻断滤片的条件下，叶绿体发出火红色荧光；D、加入吖啶橙后，叶绿体可发出橘红色荧光，视野中亮绿色的为细胞核碎片等杂质。
3、实验结果分析：A、在普通显微镜下，观察到气孔由两个保卫细胞组成，然而因为镜头有污染，可以看到照片的正中央位置有些模糊；B、在荧光显微镜下观察到保卫细胞内部的叶绿体，放大后更加明显，却也有一些模糊；背景为黑色，说明其他的结构没有自发荧光；C、普通光学显微镜下可以看到绿色橄榄形的叶绿体，还有其他的一些杂质，如细胞核碎片等，但是杂质不是绿色，可以区分；D、荧光显微镜下的游离叶绿体发出火红色的荧光，可以看到，叶绿体较多，背景为黑色；E、吖啶橙染色后在荧光显微镜下观察，可以看到橘红色的叶绿体以及亮绿色的细胞核碎片等杂质，背景为较亮的黄绿色，说明悬液中其他的杂质存在；F、总体来说，此次实验的结果较为理想，找到了应该找到的结构，并进行了拍照记录，学习了使用荧光显微镜；【实验反思与总结】1、注意事项：A、要得到完整的，有活性的叶绿体，需在低温下迅速提取，图片后立即观察；B、利用荧光显微镜对可发荧光的物质进行观察时，会受到许多因素的影响，如温度、光、猝灭剂等。
因此在进行荧光观察时应抓紧时间，必要时应立即拍照。
C、在制作荧光标本时，最好使用无荧光载玻片，无荧光盖玻片和无荧光香柏油；D、用菠菜叶提取叶绿体时，尽量使用鲜嫩的菠菜，去掉梗，打碎叶片时转速不可以过高，否则叶绿体也会遭到一定的破坏；E、在撕取菠菜叶表皮时，应该选用下表皮并且厚度适中，在1.35M的氯化钠溶液中铺平，盖盖玻片时尽量保证无气泡；F、由于荧光会慢慢变得不明显，最好吖啶橙染色后立即拍照观察，在照片上分析，这就要求拍照要迅速清晰；2、思考题：A、在荧光显微镜下观察叶绿体的自发荧光时，更换滤片系统，叶绿体的颜色是否有变化？答：有变化,因为叶绿体的颜色取决于发出荧光能量的高低，更换不同的滤片，激发光会不同，叶绿体得到和辐射的能量就会不同，颜色也就会不一样。
B、游离叶绿体和完整细胞内的叶绿体，在荧光显微镜下，颜色和荧光强度有无差异？为什么？答：有区别，因为完整细胞内的叶绿体还要进行光合作用，这会消耗掉一部分所吸收的光，所以最后释放的荧光能量就会比游离核糖体所释放的小，颜色和荧光强度就会有差别。
C、根据观察的实验现象，描述自发荧光和次生荧光的区别？答：某些物质受激发光照射后课直接发出荧光，如叶绿素、血红素的火红色荧光或木质素的黄色荧光，称自发荧光（直接荧光）。
某些物质本身不发荧光，但他经荧光染料染色后，再通过紫外线照射也能够发出荧光，这种荧光称为诱发荧光，如叶绿体被吖啶橙染色后可发出橘红色荧光。
D、叶绿体分离的原理是什么？操作过程中应注意什么？答：匀浆破碎细胞，利用差速离心方法分离等渗介质中的悬浮颗粒，手机类叶绿体大小的颗粒，得到叶绿体（差速离心：颗粒在离心场中的沉降速率取决于颗粒的大小、形状和密度。
也可同离心力以及悬浮介质的粘度有关，在一定的离心场中，同一时间内，密度和颗粒大小不同的颗粒其沉降速率不同；依次增加离心力和离心时间，就能使非均一悬浮液中的颗粒按其大小、密度先后分批沉降在离心管底部，分批收集即可获得各种亚细胞组分）叶绿体的分离应该在等渗溶液（0.35mol/L的氯化钠或0.4mol/L的蔗糖溶液）中进行，以免渗透压的改变使叶绿体受到损伤；分离过程最好在0-5摄氏度的条件下进行，如果在室温下，要迅速分离和观察。
3、实验小结：此次实验的主要内容是叶绿体的分离与荧光染色观察，并没有涉及用密度梯度离心进行纯化的过程，因此可以看到，在用吖啶橙染色后，仍然有除去橘红色的染色之外的亮绿色以及绿色的背景，说明含有细胞核碎片及其他的杂质，但是叶绿体仍然能够很明显的区分出来；此次实验学会了用荧光显微镜，并且在荧光显微镜下进行拍照。
荧光显微镜下的保卫细胞中的叶绿体以及游离的叶绿体都是会自发产生火红色的荧光，说明叶绿体可以自发荧光。
此次实验，锻炼了我的实验技能以及合作能力，巩固了制片与染色的实验技能，我学到了荧光显微镜的结构及光路原理以及使用的注意事项，并且学会了分离细胞器的方法。
【参考文献】《细胞生物学实验》第三版，高等教育出版社，王崇英，高清祥。