共聚焦显微镜简介及免疫荧光染色
共聚焦显微镜
共聚焦显微镜从一个点光源发射的探测光通过透镜聚焦到被观测物体上，如果物体恰在焦点上，那么反射光通过原透镜应当汇聚回到光源，这就是所谓的共聚焦，简称共焦。
共焦显微镜[confocallaserscanningmicroscope(clsm或lscm)]在反射光的光路上加上了一块半反半透镜(dichroicmirror)，将已经通过透镜的反射光折向其它方向，在其焦点上有一个带有针孔(pinhole)的挡板，小孔就位于焦点处，挡板后面是一个光电倍增管(photomultipliertube，pmt)。
可以想像，探测光焦点前后的反射光通过这一套共焦系统，必不能聚焦到小孔上，会被挡板挡住。
于是光度计测量的就是焦点处的反射光强度。
其意义是：通过移动透镜系统可以对一个半透明的物体进行三维扫描。
激光扫描共聚焦显微镜是二十世纪80年代发展起来的一项具有划时代的高科技产品，它是在荧光显微镜成像基础上加装了激光扫描装置，利用计算机进行图像处理，把光学成像的分辨率提高了30%--40%，使用紫外或可见光激发荧光探针，从而得到细胞或组织内部微细结构的荧光图像，在亚细胞水平上观察诸如ca2+、ph值，膜电位等生理信号及细胞形态的变化，成为形态学，分子生物学，神经科学，药理学，遗传学等领域中新一代强有力的研究工具。
激光共聚焦成像系统能够用于观察各种染色、非染色和荧光标记的组织和细胞等，观察研究组织切片，细胞活体的生长发育特征，研究测定细胞内物质运输和能量转换。
能够进行活体细胞中离子和ph值变化研究（ratio），神经递质研究，微分干涉及荧光的断层扫描，多重荧光的断层扫描及重叠，荧光光谱分析荧光各项指标定量分析荧光样品的时间延迟扫描及动态构件组织与细胞的三维动态结构构件，荧光共振能量的转移的分析，荧光原位杂交研究（fish），细胞骨架研究，基因定位研究，原位实时pcr产物分析，荧光漂白恢复研究（frap），胞间通讯研究，蛋白质间研究，膜电位与膜流动性等研究，完成图像分析和三维重建等分析。
医学实验技术 共聚焦显微镜
上海交通大学医学院 郭强苏副主任技师
激光扫描共聚焦显微镜
• 激光扫描共聚焦显微镜是80年代逐渐得到广泛应 用，比较先进的细胞生物学分析仪器
• 用激光扫描装置，通过计算机控制和处理获得细 胞和组织内部微细结构的荧光图像
• 观察细胞形态和细胞器及细胞内各种成分的细微 变化，并可动态的检测胞内Ca2+、PH值、膜电位 等生理信号
光活化 Photoactivation
解笼锁 Uncaging
激光扫描共聚焦显微镜在医学 中的应用举例
激光扫描共聚焦显微镜在细胞 凋亡中应用
• 激光扫描共聚焦显微镜不但可用于凋亡细胞亚细胞水平的观察，还可 以观察到细胞内某些超微结构的变化，在培养的K562细胞中加入放 线菌素诱导细胞凋亡，并对细胞内DNA片断进行3‘--末端标记，经观察 发现该细胞凋亡早期有大量DNA片断出现
大鼠附睾组织（AO)染色
动脉内皮细胞三标记染色
培养细胞的免疫组化
细胞内离子和膜电位的实时 定量测定
利用多种特异的荧光探针,激光扫描共聚 焦显微镜可对细胞内各种离子（Ca2+、 K+、Na+、Mg2+）的浓度和膜电位及 PH值动态变化作毫秒级的实时定量检测 和分析，因此激光扫描共聚焦显微镜能 完成对活细胞生理信号的动态检测
激光扫描共聚焦显微镜种类
1、台阶式激光扫描共聚焦显微镜 2、狭缝式激光扫描共聚焦显微镜 3、光束式激光扫描共聚焦显微镜 4、双光子和多光子激光扫描共聚
焦显微镜
激 光 扫 描 共 聚 焦 显 微 镜 原 理
激光扫描共聚焦显微镜的组成
低噪音光电倍增 管
共焦针 孔
激光
发射滤光 片
激光扫描共聚焦显微镜(LSCM)技术简介
.b ž激光扫描共聚焦显微镜( LSCM) 是随着光学、视频、计算机等技术的迅速发展而诞生的一种高科技产品。
它是在荧光ž显微镜成像基础上加装了激光扫描装置, 利用计算机进行图像处理, 使用紫外或可见光激发荧光探针, 从而得到细胞或组织内部微细结构的荧光图像, 成为形态学﹑分子细胞生物学﹑神经科学﹑药理学﹑遗传学等领域新一代强有力的研究工具。
同时,激光扫描共聚焦显微镜也是活细胞的动态观察、多重免疫荧光标记和离子荧光标记观察的有力工具。
不仅可对活的或固定的细胞及组织进行无损伤的“光学切片”; 进行单标记或双标记细胞及组织标本的荧光定性定量分析; 还可用于活细胞生理信号, 离子含量的实时动态分析监测, 粘附细胞的分选, 细胞激光显微外科和光陷阱技术等。
可以无损伤的观察和分析细胞的三维空间结构。
- www 生物秀-专心做生物w ww .b b i o o .c o mIntroductionžLSCM 是一种高科技显微镜ž荧光显微镜成像为基础，加装了激光扫描装置, 计算机进行图像处理, 使用紫外或可见光激发荧光探针, 得到细胞或组织内部微细结构的荧光图像。
ž无损伤的“光学切片”ž细胞三维立体机构ž实时动态分析监测激光扫描共聚焦显微镜( LSCM) 是随着光学、视频、计算机等技术的迅速发展而诞生的一种高科技产品。
生物秀-专心做生物w w w .b b i o o .c o mž光学显微镜部分ž激光发射器ž扫描装置ž光检测器ž计算机系统( 包括数据采集, 处理, 转换, 应用软件)ž图像输出设备LSCM 的基本组成生物秀-专心做生物w w w .b b i o o .c o mLSCM 的原理激光光源：激光扫描束经照明针孔形成点光源, 普通显微镜采用的自然光或灯光是一种场光源, 标本上每一点的图像都会受到邻近点的衍射光或散射光的干扰。
而LSCM 以激光为光源, 激光具有单色性强﹑方向性好﹑高亮度﹑相干性好等优点, 可以避免普通显微镜的缺点。
共聚焦显微镜
共聚焦显微镜从一个点光源发射的探测光通过透镜聚焦到被观测物体上，如果物体恰在焦点上，那么反射光通过原透镜应当汇聚回到光源，这就是所谓的共聚焦，简称共焦。
共焦显微镜[confocallaserscanningmicroscope(clsm或lscm)]在反射光的光路上加上了一块半反半透镜(dichroicmirror)，将已经通过透镜的反射光折向其它方向，在其焦点上有一个带有针孔(pinhole)的挡板，小孔就位于焦点处，挡板后面是一个光电倍增管(photomultipliertube，pmt)。
可以想像，探测光焦点前后的反射光通过这一套共焦系统，必不能聚焦到小孔上，会被挡板挡住。
于是光度计测量的就是焦点处的反射光强度。
其意义是：通过移动透镜系统可以对一个半透明的物体进行三维扫描。
激光扫描共聚焦显微镜是二十世纪80年代发展起来的一项具有划时代的高科技产品，它是在荧光显微镜成像基础上加装了激光扫描装置，利用计算机进行图像处理，把光学成像的分辨率提高了30%--40%，使用紫外或可见光激发荧光探针，从而得到细胞或组织内部微细结构的荧光图像，在亚细胞水平上观察诸如ca2+、ph值，膜电位等生理信号及细胞形态的变化，成为形态学，分子生物学，神经科学，药理学，遗传学等领域中新一代强有力的研究工具。
激光共聚焦成像系统能够用于观察各种染色、非染色和荧光标记的组织和细胞等，观察研究组织切片，细胞活体的生长发育特征，研究测定细胞内物质运输和能量转换。
能够进行活体细胞中离子和ph值变化研究（ratio），神经递质研究，微分干涉及荧光的断层扫描，多重荧光的断层扫描及重叠，荧光光谱分析荧光各项指标定量分析荧光样品的时间延迟扫描及动态构件组织与细胞的三维动态结构构件，荧光共振能量的转移的分析，荧光原位杂交研究（fish），细胞骨架研究，基因定位研究，原位实时pcr产物分析，荧光漂白恢复研究（frap），胞间通讯研究，蛋白质间研究，膜电位与膜流动性等研究，完成图像分析和三维重建等分析。
共聚焦显微镜
共聚焦显微镜
共聚焦显微镜，最常见的是共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）或激光共聚焦扫描显微镜（LCSM），是一种光学成像技术，可通过使用空间针孔来阻挡散焦光来提高显微图像的光学分辨率和对比度。
在图像形成中。
捕获样品中不同深度的多个二维图像可重建三维结构（此过程称为光学切片）。
该技术广泛用于科学和工业界，典型的应用是生命科学、半导体检查和材料科学。
共聚焦显微镜利用照明点与探测点共轭特性，可有效yi 制同一焦点平面上非测量点的杂散荧光及来自样品中非焦平面的荧光，从而获得普通光镜无法达到的分辨率。
共聚焦显微镜是激光共聚焦扫描显微镜LCSM 的简称，它显微成像主要采用3D 捕获的成像技术，使其具有较高的三维图像分辨率。
这些都是通过构建显微照片来实现的。
在荧光显微镜使用过程中，由于需要高强度紫外光辅助成像，所以显微镜内的汞弧灯产生的强光可能会导致令人不安的背景噪音，甚至会导致光漂白。
共聚焦显微镜以一个微动步进马达控制载物台的升降，可以逐层获得高反差、高分辨率、高灵敏度的二维光学横断面图像，从而对活的或固定的细胞及组织进行无损伤的系列“光学切片”，得到各个层面的信息。
这种功能也被称为细
胞CT或显微CT。
荧光显微镜及激光扫描共聚焦显微镜使用
荧光显微镜及激光扫描共聚焦显微镜使用可以参照相关参考资料
荧光显微镜是一种放大显微镜，它可以用于观察单个细胞或多个细胞，甚至是单个分子。
它的工作原理是，激发光通过荧光技术和特定的滤色片
将被观察物体的荧光分子特定波长的光波吸收，然后通过精密的放大镜头
进行放大，并通过荧光镜板分别输出激发光和发射光，最后将多波长波段
的发射光通过摄像机捕捉，从而形成的荧光图像。
荧光显微镜的优势之一
是它可以用于检查细胞和其内部的结构，可以检测不同的细胞特性，包括
活性、基因型、蛋白质含量和其他蛋白质表达。
激光扫描共聚焦显微镜是一种表面观察技术，它通过光学系统将多束
激光（称为共聚束）聚合到一个点，从而使能量集中到一个空间仅仅几微
米的点上，引起形成激发光，它可以精确地显示表面的形貌、表面缺陷和
细节。
此外，它还可以在极低的功率下，提供精确的材料成分和表面化学
分析，包括成分的化学结构、光谱以及深度分析，同时还能提供室温下的
探针定量分析。
激光扫描共聚焦显微镜-仪器百科
一、激光扫描共聚焦显微镜简介激光扫描共聚焦显微镜（Confocal laser scanning microscope，简称CLSM）是近代生物医学图像仪器。
它是在荧光显微镜成像的基础上加装激光扫描装置，使用紫外光或可见光激发荧光探针。
利用计算机进行图像处理，从而得到细胞或组织内部微细结构的荧光图像，以及在亚细胞水平上观察诸如Ca2+、pH值、膜电位等生理信号及细胞形态的变化。
二、激光扫描共聚焦显微镜原理在普通宽视野光学显微镜中，整个标本全部都被水银弧光灯或氙灯的光线照明，图像可以用肉眼直接观察。
同时，来自焦点以外的其他区域的荧光对结构的干扰较大，尤其是标本的厚度在2um以上时，其影响更为明显。
激光共聚焦显微镜脱离了传统光学显微镜的场光源和局部平面成像模式，采用激光束作光源，激光束经照明针孔，经由分光镜反射至物镜，并聚焦于样品上，对标本焦平面上每一点进行扫描。
组织样品中如果有可被激发的荧光物质，受到激发后发出的荧光经原来入射光路直接反向回到分光镜，通过探测针孔时先聚焦，聚焦后的光被光电倍增管（PMT）探测收集，并将信号输送到计算机，处理后在计算机显示器上显示图像。
在这个光路中，只有在焦平面的光才能穿过探测针孔，焦平面以外区域射来的光线在探测小孔平面是离焦的，不能通过小孔。
因此，非观察点的背景呈黑色，反差增加，成像清晰。
由于照明针孔与探测针孔相对于物镜焦平面是共轭的，焦平面上的点同时聚焦于照明针孔与探测针孔，焦平面以外的点不会在探测针孔处成像，即共聚焦。
以激光作光源并对样品进行扫描，在此过程中两次聚焦，故称为激光扫描共聚焦显微镜。
三、激光扫描共焦显微镜的优点1.动态连续扫描及三维图像重组。
LSCM可以对对活细胞和组织或细胞切片样品的不同层面进行连续逐层扫描,来获得各个层面的图像，即所谓的“无损伤的光学切片”。
激光扫描共聚焦显微镜扫描的每个层面之间的间距可以达到0.1um甚至更小。
获得的图像通过计算机重组，可获得精细的细胞骨架、染色体、细胞器和细胞膜系统的三维图像。
共聚焦显微镜下的荧光观察
•
绿色荧光蛋白（ GFP ），其基因产生的蛋白质，在蓝色波长范围的
光线激发下，会发出绿色荧光。
• 应用：利用绿色荧光的发光机制，可将 GFP 作为蛋白质标签，即利用 DNA重组技术，将目的基因与 GFP基因构成融合基因，转染合适的细胞 进行表达，然后借助荧光显微镜便可对标记的蛋白进行细胞内活体观察
免疫荧光操作步骤
德国Leica激光扫ห้องสมุดไป่ตู้共聚焦显微镜
共聚焦显微镜下的荧光观察
荧光的基本知识
• 一、荧光 • 荧光是指一个分子或原子吸收了给予的能量后，即刻引起发光；停止能量供给， 发光亦瞬间停止。荧光蛋白是一种可吸收激发光的光便能产生荧光的蛋白。
• 发射光谱指固定激发波长，在不同波长下所记录到的样品发射荧光的相对强度。
• 激发光谱指国定检测发射波长，用不同波长的激发光激发样品所记录到的相应的 荧光发射强度。
共聚焦显微镜应用技术
• 1、免疫荧光技术 • • 用荧光标记的抗体或抗原与样品中相应的抗原或抗体结合，以适当检测 荧光的技术对其进行分析的方法。 由于荧光素所发出的荧光可在共聚焦显微镜下检出，从而可对抗原进行 细胞定位。
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临床医学研究中心
德国Leica激光扫描共聚焦显微镜SP5 II简介
基本参数
型号：德国Leica SP5 II 激光器：4个 发射波长400nm-800nm 物镜：10倍 20倍 63倍 通道：多通道 多色
系统：windows 7＋LAS AF 活体细胞装置：配有
二、间接免疫荧光染色（FITC标记）
（4）滴加二抗 次日用PBS（5min×3）冲洗后，滴加用 PBS稀释的FITC标记的羊抗兔/鼠二抗， 37℃孵育60 min（避光）。 （5）染核并封片 用PBS（5min×3）冲洗后，滴加DAPI染 核5min, PBS冲洗（5min×3），滴加抗荧 光淬灭封片液。 （6）激光共聚焦显微镜拍照
日常保养及注意事项
短时间的停顿工作时，无需关闭系统。 只是做一些分析图片等工作时，无需打开激光器控 制钥匙，以减少激光器的损耗。 请避免使用外界存储设备（U盘，移动硬盘等）， 以免电脑受病毒感染。 请不要安装包含杀毒软件在内的任何未经软件生产 商授权和经Leica工程师认可的软件。
（1）将A549细胞细胞培养于35 mm 激光共聚焦 培养皿中间的圆形凹槽里； （2）染色前吸除培养皿的培养液，用PBS洗2-3 次； （3）向培养皿中轻轻滴入Lyso-Tracker Red或 Fluo-4/AM工作液200μL，使其覆盖凹槽里 全部细胞； （4）37 ℃、5%CO2 培养箱中孵育30 min； （5）吸除染液，用PBS洗2-3次； （6）再用800μL的PBS覆盖凹槽里全部细胞， 用激光扫描共聚焦显微镜观察Ca2+的变 化。
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Leica Science Lab网址：������
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LAS AF软件的基本界面
在生物医学中的主要应用
（一）原位鉴定细胞或组织内生物大分子、观察细胞及亚 细胞形态结构 1.细胞原位检测核酸 2.原位检测蛋白质、抗体及其他分子 3.检测细胞凋亡 4.细胞器观察及测定 5.观察细胞骨架 6.检测细胞融合 7.检测细胞内脂肪 （二）活体细胞或组织功能的实时动态监测 1.细胞内离子动态变化的测量 2.膜电位的测量 3.细胞内PH值的测定 4.检测细胞内活性氧物种的产生 5.检测药物等跨膜进入组织或细胞过程及其定位
荧光探针的选择
选择荧光探针的主要步骤： 1、根据实验目的确定需要检测的目标； 2、确定可供选择的荧光探针的范围； 3、考察荧光探针的特性是否符合荧光样品的制备 要求； 4、荧光探针与所用共聚焦显微镜系统的匹配情况。
样品要求
样品经荧光标记 组织切片在载玻片上，用盖玻片封片 固定的或活的贴壁培养细胞应培养在共聚焦专用 小培养皿或盖玻片上 悬浮细胞，甩片或滴片后，用盖玻片封片
样品要求
载玻片厚度应在0.8～1.2mm之间，盖玻片应光洁， 厚度在0.17mm左右 分激发 尽量去除非特异性荧光信号 封片剂多用甘油：PBS混合液（9：1)
激光共聚焦适用的器皿及要求
一、活细胞直接免疫荧光染色（溶酶体或钙离子）
激光扫描共聚焦显微镜的基本特点
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观察方式：以荧光为主 光源：激光（紫外、可见光） 照明方式：点照明、逐点扫描 成像方式：共聚焦、逐点成像 输出：实时观测，数字化图像，可以进行 图像处理和定量分析 ������ 多重染色样品的观察
基本功能
多荧光标记样品的高清晰度、高分辨率图像 采集 光学显微镜分辨率：0.25μm 共焦显微镜分辨率：0.18μm
基本功能
������ 定位、定量分析
基本功能
������ ������ 无损伤、连续光学切片，显微“CT” 三维重构成像
三维重构成像
基本功能
������ 像 活体细胞荧光染色的动态观察及快速扫描成
日常保养及注意事项
按照手册正确操作。如有疑问请及时联系 Leica 工程师，寻求专业帮助。 保证外部电源供应稳定。 由于环境的变化会影响各部件的相对位等，无论 工作与否请保持室内恒温，清洁，干燥。室温 22-25 摄氏度，相对湿度80%以下为宜。 使用一段时间后，精密器件可能会由于环境等因 数引起偏移，为保证仪器正常使用，请与 Leica 的专业工程师联系，及时调较仪器。 使用显微镜油镜后请用无水乙醇清洁镜头前部。
二、间接免疫荧光染色（FITC标记）
（1）收集细胞 收集细胞爬片，吸取各培养孔上清，PBS冲洗（ 5min×3），4%多聚甲醛固定20min，晾干后用。 （2）通透及封闭 取出细胞爬片，贴于载玻片上，用PBS（5min×3） 冲洗后，加入0.3% Triton X-100穿透细胞膜5min， PBS（5min×3），加入2% BSA封闭抗原30min。 （3）滴加一抗 滴加用PBS稀释的一抗，湿盒内4℃孵育过夜。每次 实验均作空对照白（PBS代替一抗）和同型对照（ 兔/鼠血清或IgG亚型代替一抗）。