胎鼠海马神经元培养及其鉴定
胎鼠海马神经元体外原代培养与鉴定
胎鼠海马神经元体外原代培养与鉴定【关键词】胎鼠海马神经元；体外原代培养；鉴定doi：10.3969/j.issn.1004-7484（x）.2013.06.568 文章编号：1004-7484（2013）-06-3323-02在神经生物学及相关学科领域中，原代培养的神经元因其排除机体生理病理状态干扰的影响而成为较为理想的实验模型，是研究神经元形态、物质代谢、分子机制及电活动的主要前提。
海马是大脑边缘系统重要的组成部分，在学习、记忆、情绪反应及中枢神经系统疾病的病理生理变化方面发挥着重要作用。
对于原代海马神经元的培养，主要供体主要有胎鼠与新生鼠两种，培养方法有含血清培养和不含血清培养两种。
我们通过实验摸索，取得一种较稳定且简便实用的方法，能获得较高存活率的海马神经元。
1 材料与方法1.1 实验动物来源清洁级孕17-19天sd大鼠上海斯莱克实验动物有限责任公司提供，生产许可证号：scxk（沪）2012-0002。
1.2 主要仪器与试剂 co2培养箱（thermo公司），倒置相差显微镜为（olympus公司），激光共聚焦显微镜型号为zeiss lsm710，小鼠抗大鼠classⅲβ-tubulin单抗（beyotime公司），nse免疫组化染色试剂盒、dab显色试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司），b27添加剂、neuralbasal、hoechst 33342sigma公司），dmem（高糖型）培养基、胎牛血清（gibco公司）。
1.3 培养方法与鉴定取孕17-19天大鼠，水合氯醛麻醉后70%酒精浸泡20min，颈椎脱臼法处死孕鼠，将子宫立即放入冰浴含dmem 的大平皿中，在解剖显微镜下取下海马组织，剪成约1mm×1mm×1mm 大小，用0.125%胰蛋白酶于37℃、5%co2培养箱中消化15min，中间每隔5min振荡一次，加入含10%fbs的dmem液终止消化，巴氏管轻柔吹打，200目筛网过滤。
胎鼠海马神经元培养及其鉴定
２１ ，（ ：７ ９ ０ １ ５） １ １
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胎 鼠海 马神经元培养及其鉴定
李 玉 ” ，王 波 ” 但齐琴 ∞ ， （ 昆明医学院第一附属医院神经外科 ，云南 昆明 ６０３ ；２ 昆明医学院神经科学研 究所，云南 昆 １ ） ５０ １ ）
ｔｅ ｅ ｌ ｆ ｍ ｔ ａ ， ｗｉ ａ ｕ ｌ ｎ ｒａ ｉｇｔｅｎ ｕ ｔ ｕｇｏ ｔ ． Ｃｏ ｃｕ ｉｎ Ｐ ｒ ｅ ｅ ｒｎ ｔ ｈ ｎｇ ｗ ｗｅｌ ｒ ５ｈ ｄ ｙ ｒ ｏ ｔ ｇ ｄ ａ ｃｅ ｓｎ ｅ ｒ ｉ ｏ ｔ ｗ ｈ ｈｒ ｉ ｈ ｉ ｓ ｒ ｎ ｌｓｏ ｕ ｆ ｄｎ ｕ ｏ ｓ ｈ ｉ ｉ ｗｉ
ｎ ｕ ｏ ｓ ｙＳ —ｗｏ ｓｅ ｔｉｉｇｍｅｈ ｄ Ｒｅ ｕｔ Ａｆ ｒｉｃ ｂ ｔｄｆｒ ｏ ｒ ， ｔａ ｓ ｒｅ ｕ ｐ ｎ ｉｎ ｅｌ ｅ ｒｎ Ｐ ｔ — ｔｐ ｓ ｎｎ ｔｏ ． ｂ ａ ｓｌ ｓ ｔ ｕ ａｅ ｈ ｕ ｓ ｒｎ ｆ ｒ ｄｓ ｓ ｅ ｓｏ ｓ ｎｗ ｌ ｅ ｎ ｏ ２ ｅ ｉ ｓ
ｎ ｕ ｏ ａ ｒ ｗｔ ｃ ａ ａ ｔ ｒ ｉｔ ｓ Ｍ ｅ ｈ ｄ Ｔ ｓ ｕ ｓ ｆｏ ｈ ｐ ｏ ａ ｕ ｆ ｆ ｔｌ ｒ ｔ ｗｅ ｅ ｈ ｒ ｅ ｔｄ， ｔ ｅ ｅ ｒ ｎ ｌ ｇ ｏ ｈ ｈ ｒ ｃｅ ｓｉ ． ｃ ｔｏ ｓ ｉｓ ｅ ｒ ｍ ｉ ｐ ｃ ｍｐ ｓ ｏ ａａ ａｓ ｒ ａ ｖ ｓｅ ｈｎ
明 ６ ０ ３ ） ５０ １
［ 要］ 目的 摘 建立胎 鼠海马神经元体外 培养 方法 ，观察细胞生长情况 ，免疫 组织化学染色鉴定神经元特
异性． 方法
神经元细胞培养步骤
海马神经元细胞培养一、实验前准备1.手术器械、培养皿、筛网的消毒2.多聚赖氨酸的配制3.培养板处理：（培养板中可加入小的圆形玻片，多次使用）(1)用多聚赖氨酸室温包被5min，随后吸取多余液体，晾干。
(2)用PBS洗一遍，吸取PBS后晾干备用。
4.胰酶的配制5.PBS的配制二、操作步骤1. 新生一天的小鼠，酒精喷洒全身，置于干净的培养皿中，用手术剪刀剪下头部，放入另外一个干净的培养皿中（五只）。
2.用干净镊子取出全脑放于（冰）的PBS的培养皿（10cm）中，置于解剖显微镜下。
3.移入解剖显微镜下，分离出皮层或海马组织，去除血点，移入盛有HOOD下的培养皿中。
4.将皮层或海马组织剪成1-3mm的小块，用0.25%，2ml胰酶-EDTA 消化，37ºC水浴消化30分钟，每消化10分钟振摇一下。
30分钟后，用移液枪吸取可见组织，放入离心管中，并加入与胰酶等体积的DMEM （HG）+10% FBS培养液终止消化，吹打20次左右，注意动作轻柔，不要吹打出气泡。
5.如果组织明显不能吹散或粘稠的话，过一下200目筛网。
过滤液DMEM，进入大离心管中。
离心800r，3min。
弃去上清，加入DMEM 培养液，分装在培养皿（6cm）中，放入含5% CO2 的37C恒温培养箱内培养。
6.6-8小时（或第二天）后换液，用PBS液先洗两遍，并上下左右摇晃10次左右，去除一些细胞碎片，随后培养液换成Neurobasal 培养液+B27（2%）+谷氨酰胺（0.5mM）（+双抗)继续培养，并且3天半换液一次。
7.到第八天时，将培养液换成新鲜Neurobasal无B27、谷氨酰胺、双抗，开始用于实验。
染料木素对体外培养胎鼠海马神经元细胞活力及其形态的影响
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ห้องสมุดไป่ตู้
染料木素对体外培养胎鼠海马神经元细胞活力及其形态的影响 3
第四军医大学药学系药物研究所 ( 西安 710032 ) 王 超 王四旺△ 王剑波 涂宏海 # 肖 茜▲ 张 松 摘 要 目的: 观察染料木素 ( Geniste in, Gen ) 对正常胎鼠海马神经元细胞培养条件下的活 力及其形态影响。方法: 取 16～ 18d 孕龄 SD 胎鼠海马组织进行原代培养海马神经元。采用M TT 比色法 检测 0. 01Λg �m l、 0. 02Λg�m l、 0. 04Λg�m l、 0. 08 Λg � m l、 0. 16Λg�m l、 0. 32Λg �m l、 0. 64 Λg � m l、 1. 28Λg �m l、 2. 56Λg �m l、 5. 12Λg �m l Gen 组及空白组对海马神经元分别作用 24h、 48h、 72h 的 细胞活力及其形态变化。结果: ①Gen 对海马神经元细胞活力的最佳剂量为 0. 32Λg �m l; Gen 在 0. 01 Λg � 0. 02Λg�m l、 0. 04Λg�m l、 0. 08Λg �m l、 0. 16Λg � 0. 32 Λg � m l、 m l、 m l 呈剂 量依 赖性 增强; 而 0. 64Λg�m l、 1. 28Λg�m l、 2. 56Λg�m l、 5. 12Λg�m l Gen 各组的细胞活性呈剂量依赖性下降。②Gen 各剂量度组对海马神经元细胞的最明显促进生长时间是 24h ; Gen 作用 48h 和 72h 时细胞活力则 呈下降趋势。 ③ 0. 32 Λg � 0. 02Λg�m l、 m l Gen 干预 24h 海马神经元细胞的形态最佳; 0. 01Λg�m l、 0. 04Λg � m l、 0. 08Λg �m l、 0. 16Λg�m l、 0. 32 Λg�m l Gen 各组随剂量的增加对海马神经元细胞的生 长促进作用明显增强, 细胞形态呈轴突树突明显连接成网, 胞体折光性好, 细胞碎片少; 大于 0. 32 Λg � m l Gen 剂量的效应结果则反之 , 随剂量增大其作用明显呈副效应变化 , 其细胞形态的轴突 树突网状结构不明显 , 胞体折光性差, 且呈崩解趋势, 细胞碎片明显增。结论: Gen 对体外培养胎 鼠海马神经元细胞生长活力作用的最佳剂量为 0. 32Λg�m l, 最佳效应时间是 24h。 主题词 海马旁回�生理学 细胞培养 植物生长调节物�药理学 体外研究 大鼠 染料木素 (Geniste in , Gen ) 广泛存在于豆科植物 中。 Gen 亦称植物雌激素 , 在人体内可与雌激素受体结 [1] 合发挥弱雌激素样作用和抗雌激素活性 。 目前, Gen 研究较多的是用于治疗骨质疏松和肿瘤 , 而在神经再 生方面的研究较少 [2, 3 ] , 且刚刚开始。 在 Gen 对神经细 胞作用的研究
胎鼠、新生大鼠原代海马神经元培养及鉴定
胎鼠、新生大鼠原代海马神经元培养及鉴定熊丽娇;郭阗廷;曾治平;黄志华;曾靖【摘要】目的:建立胎鼠、新生鼠海马神经元体外培养方法.方法:分别取胎鼠、新生鼠海马,消化后种植,用含有2%B27的neurobasal培养液培养,第3天加入5 μmol·L-1的阿糖胞苷,换液后继续培养,以获得纯度较高的海马神经元.培养第3、7天观察细胞生长及突起情况,用neurofilament抗体以免疫荧光方法鉴定神经元细胞.结果:海马神经元种植24 h后贴壁,7天时神经元突起相互连接成网络.经neurofilament染色,培养细胞阳性率高,新生鼠原代培养海马神经元阳性率达(89±3.4)%,胎鼠海马神经元阳性率达(98±1.5)%.结论: 本方法培养出的胎鼠、新生大鼠海马神经元纯度较高,可作为海马神经元模型用于进一步研究.【期刊名称】《赣南医学院学报》【年(卷),期】2017(037)003【总页数】3页(P354-356)【关键词】海马神经元;细胞培养;胎鼠;新生鼠【作者】熊丽娇;郭阗廷;曾治平;黄志华;曾靖【作者单位】赣南医学院第一附属医院全科医学VIP科;赣南卫生健康职业教育学院外科教研室,江西赣州 341000;赣南医学院第一附属医院全科医学VIP科;赣南医学院;赣南医学院【正文语种】中文【中图分类】R285.5海马是大脑边缘系统重要部分，神经元分布高度集中，在认知、记忆、情绪、植物神经系统方面起着不可替代的作用[1-3]。
海马神经元体外培养模型已经成为研究神经元发育分化、神经疾病的发生机制的重要技术手段[4-6]。
海马神经元体外培养文献报道方法多样，动物来源主要有胎鼠和新生鼠，根据实验条件，我们摸索出了原代胎鼠、新生大鼠的海马神经元培养方法，并进行了细胞鉴定，获得了高纯度的胎鼠、新生大鼠海马神经元。
1.1 材料1.1.1 实验动物孕17天SD大鼠及出生24 h内的SD大鼠。
1.1.2 主要试剂 DMEM培养基、neurobasal培养基、胎牛血清(FBS)和B27培养基添加剂(Gibco公司)、青链霉素、胰酶、多聚L赖氨酸(sigma公司)。
海马神经元细胞免疫荧光检验
海马神经元细胞免疫荧光检验神经元鉴定：一、烯醇化酶鉴定：培养细胞用100%乙醇固定---10min---PBS漂洗5min×3次---3%H2O2室温孵育30min，目的用于去除内源性过氧化物酶---PBS 漂洗5min×3次---5%羊血清（0.3%TritonPBS配制），室温封闭30min 以减少排特异背景颜色------加第一抗体特异烯醇化酶（chemicon，1:1000），4℃冰箱孵育18~24小时---PBS漂洗5min×3次---加入2步法：PV9000试剂Ⅰ,37℃，30min---PBS漂洗5min×3次---PV9000试剂Ⅱ,37℃，30min---PBS漂洗5min×3次---DAB显示红棕色；70%，80%，90%，100%I，100%II 梯度酒精透水；二甲苯Ⅰ，Ⅱ透明2次，每次30min---中性树胶灯片---镜下观察。
二、β-微管蛋白Ⅲ（β-tubulinⅢ）荧光显示：培养细胞用预冷PBS液轻柔漂洗3次，4%多聚甲醛固定，1h，4℃---吸去多余甲醛---PBS漂洗5min×3次---0.25%triton，室温，15min---3%H2O2室温孵育30min，目的用于去除内源性过氧化物酶---PBS漂洗5min×3次---5%羊血清（0.3%TritonPBS配制），室温封闭30min以减少排特异背景颜色------弃血清，加入β-tubulinⅢ抗体（1:100稀释），4℃，过夜---PBS漂洗5min×3次---滴加FITC 标记的山羊抗小鼠lgG（体积比1:200稀释），37℃，1h---DAPI复染10min---抗荧光猝灭封片液封片---荧光显微镜观察---选择10个视野，统计学处理。
一、烯醇化酶鉴定：培养细胞用100%乙醇固定---10min---PBS漂洗5min×3次---3%H2O2室温孵育30min，目的用于去除内源性过氧化物酶---PBS漂洗5min×3次---5%羊血清（0.3%TritonPBS配制），室温封闭30min以减少排特异背景颜色------加第一抗体特异烯醇化酶（chemicon，1:1000），4℃冰箱孵育18~24小时---PBS 漂洗5min×3次---加入2步法：PV9000试剂Ⅰ,37℃，30min---PBS漂洗5min×3次---PV9000试剂Ⅱ,37℃，30min---PBS漂洗5min×3次---DAB显示红棕色；70%，80%，90%，100%I，100%II 梯度酒精透水；二甲苯Ⅰ，Ⅱ透明2次，每次30min---中性树胶灯片---镜下观察。
海马细胞培养与鉴定
非特异性对照:用正常羊血清代替兔抗特异性烯醇化酶(NSE)多克隆抗体,其它实验步骤上。
阴性对照:用PBS代替兔抗特异性烯醇化酶( NSE )多克隆抗体,其它实验步骤同上。
纯度计算：高倍镜视野下，随机选取计数视野，计数100个细胞中阳性神经元的数目，重复5次后，计算均值。
吸去培养液用PBS液冲洗3遍
↓
质量分数为4%的多聚甲醛固定15 m in;
↓
0.01mol/LPBS液中洗15 m in;（5min×3次）
↓
质量分数为0.4%的Triton X-100湿盒反应40 m in;
↓
0.01mol/LPBS液中洗15 m in;（5min×3次）
↓
3%H2O2孵育15min,消除内源性的过氧化物酶
搅拌。
↓
(3)将待标记的抗体12.5mg用生理盐水稀释至5ml，搅拌下逐滴加入酶溶液中。
↓
(4)用1M PH9.5碳酸缓冲液0.25ml，继续搅拌3?小时。
↓
(5)加0.2M赖氨酸0.25ml，混匀后，置室温2小时。
↓
(6)在搅拌下逐滴加入等体积饱和硫酸铵，置4℃1小时。
↓
(7)3000rpm离心半小时，弃上清。沉淀物用半饱和硫酸铵洗二次，最后沉淀物溶于
或使用和一抗相同来源的血清(10%)进行封闭。另一方面，请注意选购经过适当吸附的二抗，以减小二抗的非特异性吸附。
b.在免疫组化时如果背景显色太深，需注意灭活内源性过氧化氢酶。可以在4体积甲醇中加入1体积3%过氧化氢，混匀后用于内源性过氧化氢酶的灭活。
c.可以考虑缩短显色时间，或降低二抗浓度。另外，选择适当强度的洗涤液，或延长洗涤时间也会有所帮助。
步骤：
大鼠海马神经元原代培养
汇报人：何克宇
S
实验要点
S 取活体细胞
S 令海马神经元贴壁生长
S 神经元培养液
实验材料
S 动物：大鼠胎鼠（15~20天）
S 试剂：多聚赖氨酸
解剖液（DMEM+PBS） 0.125%胰蛋白酶
S 培养液：①DMEM+F12+10%胎牛血清
②Neurobasal+2%b27+1%双抗
1. 胰蛋白酶（预暖）消化15min，3~5min震荡一次。
2. 静置2min，去上清，PBS洗两遍终止消化 3. 加入DMEM，吹打，取上清。重复3次。 4. 种板，培养液（DMEM+F12+10%胎牛血清），细
胞密度3.5*105/cm2
抗）
Thank You
实验步骤
1.器械灭菌 2.多聚赖氨酸（PLL）铺板
0.1mg/ml，包被30min，吸去多余PLL，
过夜晾干
实验步骤
1.孕鼠颈椎脱臼处死，取胎鼠 2.胎鼠断头，置于PBS，取全脑，置于解剖液（冷） 3.体视显微镜下沿中线分离半球，取海马，仔细分离血 管和膜性组织。（快、干净）
实验步骤
实验步骤
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［作者简介］李玉（1965～），男，云南昆明市人，医学硕士，副教授，主要从事癫痫外科和功能神经外科临床研究工作.昆明医学院学报2011，（5）：17～19Journal of Kunming Medical UniversityCN 53-1049/R胎鼠海马神经元培养及其鉴定李玉1），王波1），但齐琴2）（1）昆明医学院第一附属医院神经外科，云南昆明650031；2）昆明医学院神经科学研究所，云南昆明650031）［摘要］目的建立胎鼠海马神经元体外培养方法，观察细胞生长情况，免疫组织化学染色鉴定神经元特异性．方法取胎鼠海马，分裂获得细胞悬液，接种于24孔板，经2h 差速帖壁去除成纤维细胞，将细胞液转移并继续培养，以获娶纯度较高的海马神经元．培养第5、11、15天观察细胞和突起生长情况，用NeuN 抗体以免疫组化SP 二步法染色鉴立神经细胞．结果培养头3d ．细胞生长缓慢，5d 时细胞开始生长，可见突起，11d 时突起连成网状．经Neun 染色培养细胞呈阳性反应，证明是神经元．结论本方法获取生长良好，纯度较高的海马神经元．［关键词］胎鼠；海马神经元；Neun ；培养［中图分类号］Q831.1+1［文献标识码］A ［文章编号］1003－4706（2011）05－0017－03I dent ificat ion and Cult ur e of Hippocampus Neur ons in Fet al Rat sLI Yu 1），WANG Bo 1），DAN Qi －qin 2）（1）Deat.of Neurosurgery ；2）Institute of Neuroscience ，Kunming Medical University ，Kunming Yunnan 650031，China ）［Abstract ］Objective To establish the protocol for culturing hippocampus neurons in vitro and explore theneuronal growth character istics ．Methods Tissues from hippocampus of fatal rats were harvested ，then digested into cell suspension by using 0.125%trypsin ．After planted into wells for 2hours ，cell suspension was transferred into next well for continuing incubation ．The cell growth was observed at day 5，11and 15．Neurons specific Enolase （NSE ）antibody ，recognized specifically NSE antigen in cultured cells ，was used to identify neurons by SP-two-step staining method ．Results After incubated for 2hours ，transferred suspensions in wells showed some pure neurons ，which is identified by NSE staining ．However ，they grew slowly during 1～3days ，then grew well from 5th day ，with gradual increasing the neuritis outgrowth ．Conclusion Purified neurons with neurite outgrowth states can be acquired by this method.［Key words ］Fetal rats ；Hippocampus neurons ；NSE staining ；Culture 海马神经元细胞培养是研究神经细胞生物学特性和外源干扰因素作用（细胞因子）的有效细胞模型，其在神经生物学，发育生物学体外实验研究中已被广泛应用[1-3]．然而，要获得纯度较高，生长状态较好的海马神经元也不是一件易事．本实验长期从事海马神经细胞生物特性及其应用研究，故需建立该细胞模型．鉴于胚胎来源的细胞生长状态较成年动物来源者好[4，5]．本实验建立大图1培养海马神经元（×200）Fig.1Cult ur ed hippocampus neur ons（×200）A:24h；B:5d；C:11d.第32卷昆明医学院学报18鼠胚胎源性海马神经元的体外培养纯化方法，观察其生长特性．1材料与方法1.1海马细胞获细胞悬液制备与细胞培养SD孕鼠腹腔注射麻醉后，开腹取子宫获取胎鼠．无菌条件下，取断头置75%乙醇进一步消毒，生理盐水冲洗后打开颅骨去除大脑皮质，暴露海马．取出海马，去除被膜，用组织剪剪碎组织，0.125%胰蛋白酶37℃消化15min，1000 r/min离心10min去上清，加血清终止反应．PBS洗3次收集组织，用吸管反复吹打30～50次制成细胞悬液，计数细胞，调整细胞密度为6×105个/mL按种于24孔培养板．继续培养2h让成纤维细胞差速先贴壁后，将培养液移入另一培养板继续培养纯化神经元．1.2形态学观察显微镜下于24h，5d、11d，15d分别观察细胞生长状态．描记神经突起生长情况．1.3免疫组织化学染色为证明培养细胞是神经元，采用神经元特异标记物神经元特异烯醇化酶进行染色．免疫组化染色步聚如下：（1）将培养细胞用100%乙醇固定10min，PBS洗5min×3次．3%H2O2室温孵育30min去除内源性过氧化物酶．PBS洗5min×3次；5%羊血清（0.3%Triton PBS配制）室温封闭30min以减少排特异背景染色．加第一抗体神经元特异烯醇化酶（chemicon，1:1000）4℃冰箱孵育18～24h．PBS洗5min×3次，加入二步法PV9000试剂I，37℃孵育30min；PBS洗5mi-n×3次．加入PV9000试剂II37℃孵育30min．PBS洗5min×3次，DAB综色反应显色．70%，80%，90%，100%I，100%II梯度酒精透水；二甲苯I，II透明2次，每次30min，中性树胶封片．镜下观察染色部位．2结果2.1胎鼠海马神经元形态学变化从胚胎内取出的胎鼠海马神经元用胰蛋白酶消化后接种于培养板，在显微镜下观察可见：细胞呈球型，胞体透明，折光性好．接种24h后，细胞开始贴壁，但生长不快，至第5天才可见神经元长出明显突起，有的有胞体1倍长，有的则较短．继续培养至第11天观察，神经细胞胞体形态未发生明显变化，但神经突起明显增长，相互联成网状．突起可达胞体4～5倍长，与5d组比神经突起长度明显增加．15d时细胞生长状态较好，与11d比类似，但神经突起长度和进度进一步增加（见图1）．CA B2.2免疫组织化学染色结果神经元特异烯醇化酶染色显示，培养海马神经元胞体和突起均呈阳性染色，说明培养细胞是神经元（见图2）.3讨论本实验中，笔者观察了大鼠胚胎源性海马神经元的体外生长过程，发现胎鼠海马神经元体外图2海马神经元特异烯醇化酶染色（×400）Fig.2Enolase specific st aining for neur ons in hippocampus （×400）李玉，等．胎鼠海马神经元培养及其鉴定19第5期生长良好．尽管头3d 生长缓慢，但是第5天已可见清晰的神经突起，有的长达胞体2倍以上．通过与本室另一组培养成年海马神经元的实验比较，发现胎鼠海马神经较成年海马神经元生长块，且纯度较高．特别是通过差速2h 贴壁纯化后，5d 就凡乎看不到成纤维细胞生长．由于本实验中培养的海马神经元较为干净，且5d 时细胞之间尚未联成网状，故计数和测量神经突起均较容易，是研究其外源因素干预促进突起生长的良好时期．而随着培养时间延长，至第11天时，细胞生长呈现网状边接，神经细胞生长状态良好，胞体和突起清晰可持续．由于此时神经元突起刚好生长联成网状，因此将其用于研究抑制神经突起生长干扰因素较为可行．本实验建立的海马神经元体外细胞模型为研究海马细胞体外生物学特性和加入细胞因子研究其对神经元生长的影响[6，7]奠定了基础．本实验中，为了鉴定培养神经元的特异性，我们用神经元特异烯醇化酶染色进行鉴定神经元，结果发现培养细胞均是阳性，说明培养细胞是神经元．神经元特异烯醇化酶是神经元的特异标记物[8]，已广泛用于神经细胞鉴定．从本实验结果看，所培养细胞是神经元，而且纯度较高．本实验不仅获得了纯度较高的海马神经元，而且其生长良好，可用于神经元存活和神经生长的相关研究．［参考文献］［1］王英，车宇，苗建亭，等．新生大鼠海马神经元原代培养方法的实验研究.细胞与分子免疫学杂志［J ］．细胞与分子免疫学杂志，2003，19（2）：197－198．［2］周明，聂箐，吕诚，等．一种大鼠海马神经元的原代培养方法［J ］．南昌大学学报（医学版），2010，50（3）：1－3．［3］TANAKA H ．Culturing hippocampal neurons ［J ］．Nippon Yakurigaku Zasshi ，2002，119（3）：163－166.［4］李劲涛，黄桂琴，王廷华，等．GFP 转基因胚胎小鼠海马神经元培养方法的建立［J ］．昆明医学院学报，2006，27（6）：23－26．［5］刘佳，罗湘颖，杨志敏，等．新生大鼠中枢神经系统不同区域细胞生长的形态学比较研究［J ］．昆明医学院学报，2006，27（6）：27－29．［6］M ARCONI P ，SIM ONATO M ，SZUCCHINI G ，et al ．Re-plication-defective herpes simplex virus vectors for neurotrophic factor gene transfer in vitro and in vivo ［J ］．Gene therapy ，1999，6（5）：904－910.［7］张惊宇，赵节绪．表达大鼠脑源性神经营养因子腺相关病毒（rAAV-BDNF ）对体外培养海马神经元保护作用的研究［J ］．中国免疫学杂志，2008，24（12）：1100－1102．［8］陈瑞庆．冰冻切片检测大鼠脊髓组织NSE 和NF 的表达［J ］．福建医药杂志，2009，31（5）：77－78．（2011－03－14收稿）。