04 实验四 植物DNA的提取和鉴定(十六烷基三甲基溴化铵,CTAB)
CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）
CTAB（⼗六烷基三甲基溴化铵）⼗六烷基三甲基溴化铵别称西曲溴铵、溴棕三甲基铵、溴烷铵，鲸熔三甲基溴化铵；CTAB；CTMAB；HTAB；CTABr；分类季铵盐分⼦式 C16H33(CH3)3NBr分⼦量 364.446熔点: 250-237℃⽔溶性 13 g/L (20°C)纯度(含量) ＞99%性质本品呈⽩⾊或浅黄⾊结晶体⾄粉末状，易溶于异丙醇，可溶于⽔,震荡时产⽣⼤量泡沫，能与阳离⼦、⾮离⼦、两性表⾯活性剂有良好的配伍性。
具有优良的渗透、柔化、乳化、抗静电、⽣物降解性及杀菌等性能。
本品化学稳定性好，耐热、耐光、耐压、耐强酸强碱。
⽤途本品为天然、合成橡胶、硅油和沥青乳化剂；合成纤维、天然纤维和玻璃纤维的抗静电剂、柔软剂；护发素的调理剂；相转移催化剂；乳液起泡剂、表⾯活性剂，分析试剂，涤纶真丝化剂，⽪⾰加脂剂，它还⽤于助焊剂、焊锡膏⽣产⾥起表⾯活性剂作⽤，活性强，对亮点、虚焊、焊电饱满都有⼀定作⽤。
CTAB法提取DNA试剂：1）2×CTAB 提取液（PH 8.0）：2% CTAB，1.4MNacl，0.02MEDTA，0.1MTris-cl，0.2%巯基⼄醇。
即称取CTAB 2 g加蒸馏⽔40ml，加1M Tris-cl（PH8.0）10ml，0.5M EDTA（PH 8.0）4ml和5M NaCl 28ml,待CTAB溶解后⽤蒸馏⽔定容到100ml（提取前加⼊2%的巯基⼄醇，100ml加0.2ml巯基⼄醇）2）1M Tris-cl（PH 8.0）100 ml:12.11g Tris碱；ddH2O ，80ml；HCl，4.9 ml三者混匀充分溶解后，滴加浓盐酸调PH⾄8.0，定容⾄100ml3）0.5M EDTA（PH 8.0） 100ml：在80ml⽔中加⼊18.01g EDTANa2.2H2O搅拌溶解，⽤NaOH调PH⾄8.0（约2gNaOH颗粒），定容⾄100ml4）5M NaCl 100ml：称取29.22g NaCl ，⽤ddH2O定容到100ml5）3M NaAc 10ml：称取2.46g NaAc，⽤ddH2O定容到10ml操作步骤：1、称取1.0g幼嫩的叶⽚，在研钵中加⼊液氮预冷，将叶⽚放到液氮中研磨均匀，直⾄全部研磨⾄粉末，转⼊1.5ml离⼼管中，加⼊600 ul 65℃预热的CTAB溶液（⽤前加⼊2%的巯基⼄醇）2、将装有CTAB和样品的EP管放⼊65℃⽔浴，约1h3、冷却后，加⼊600ul 的酚：氯仿：异戊醇(25:24:1=300:288:12)，混匀，12000rpm，离⼼15min4、吸上清，装⼊⼀新的EP管5、加⼊600ul 氯仿：异戊醇（24:1=576:24），12000rpm。
CTAB法提取植物基因组DNA
CTAB法提取植物基因组DNACTAB法提取植物基因组DNACTAB法原理CTAB（Cetyl trimethyl ammonium bromide），⼗六烷基三甲基溴化铵，是⼀种阳离⼦去污剂，可溶解细胞膜，能与核酸形成复合物，具有从低离⼦强度溶液中沉淀核酸的特性。
当降低溶液盐浓度到⼀定程度（0.3 mol/L NaCl）时，CTAB-核酸的复合物从溶液中沉淀，通过离⼼就可将其与蛋⽩，多糖类物质分开，在经过有机溶剂抽提，去除蛋⽩，多糖，酚类等杂质。
最后通过⼄醇或异丙醇沉淀DNA，⽽CTAB溶于⼄醇或异丙醇⽽除去在⾼离⼦强度的溶液中(>0.7mol/L NaCl)，CTAB与蛋⽩质和多聚糖形成复合物，不能沉淀核酸。
CTAB溶液在低于15℃时会形成沉淀析出，因此，在将其加⼊冰冷的植物材料之前必须预热，且离⼼时温度不要低于15℃。
另外，它还能保护DNA不受内源核酸酶的降解。
主要试剂与溶液的配制：PVP（聚⼄烯吡咯烷酮K30）巯基⼄醇氯仿︰异戊醇（24︰1）异丙醇70%⼄醇Tris-苯酚RNaseA⽆⽔⼄醇CTAB 溶液：CTAB——20g/LNaCl（58.44）——1.4 mol/L（81.816g）EDTA（292.25）——10 mmol/L（2.9225g）Tris（121.14）——100 mmol/L（12.114g）pH 8.01×TE 缓冲液：EDTA（292.25）——1 mmol/L（0.29225g）Tris（121.14）——10 mmol/L（1.2114g）pH 8.0NaAC溶液：NaAC（82.03）——3mol/L（246.09g）pH 4.0植物总DNA的提取1、取适量⽢薯新鲜叶⽚，⽤液氮迅速研磨，中间加PVP（聚⼄烯吡咯烷酮K30）少许，成粉末后转⼊10mL的离⼼管中，放⼊液氮或-80℃冰箱储存（在研磨样品时，研的细和研的粗，提出的DNA量可以相差⼏倍，所以，在液氮保护的很好的情况下尽量多研磨⼏次）。
CTAB法提取植物总DNA
关于CTAB法提取基因组DNA，原理CTAB法原理CTAB(hexadecyltrimethylammonium bromide,十六烷基三甲基溴化铵)，是一种阳离子去污剂,具有从低离子强度溶液中沉淀核酸与酸性多聚糖的特性。
在高离子强度的溶液中(>0.7mol/L NaCl)，CTAB与蛋白质和多聚糖形成复合物，只是不能沉淀核酸。
通过有机溶剂抽提，去除蛋白，多糖，酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来。
CTAB提取缓冲液的经典配方Tris-HCl (pH8.0)提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏；EDTA螯合Mg2+或Mn2+离子，抑制DNase活性；NaCl 提供一个高盐环境，使DNP充分溶解，在于液相中；CTAB 溶解细胞膜，并结合核酸，使核酸便于分离；β-巯基乙醇是抗氧化剂，有效地防止酚氧化成醌，避免褐变，使酚容易去除PVP(聚乙烯吡咯烷酮)是酚的络合物，能与多酚形成一种不溶的络合物质，有效去除多酚，减少DNA中酚的污染；同时它也能和多糖结合，有效去除多糖。
用酚抽提细胞DNA时，有什么作用？使蛋白质变性，同时抑制了DNase的降解作用。
用苯酚处理匀浆液时,由于蛋白与DNA 联结键已断,蛋白分子表面又含有很多极性基团与苯酚相似相溶。
蛋白分子溶于酚相，而DNA 溶于水相。
使用酚的优点：1.有效变性蛋白质；2抑制了DNase的降解作用。
缺点：1.能溶解10-15%的水，从而溶解一部分poly(A)RNA。
2.不能完全抑制RNase的活性。
氯仿的作用？氯仿：克服酚的缺点；加速有机相与液相分层。
最后用氯仿抽提：去除核酸溶液中的迹量酚。
（酚易溶于氯仿中）用酚-氯仿抽提细胞基因组DNA时，通常要在酚-氯仿中加少许异戊醇，为什么？异戊醇：减少蛋白质变性操作过程中产生的气泡。
异戊醇可以降低表面张力，从而减少气泡产生。
另外，异戊醇有助于分相，使离心后的上层含DNA的水相、中间的变性蛋白相及下层有机溶剂相维持稳定。
植物DNA的提取与测定
植物DNA的提取与测定一、目的随着基因工程等分子生物学技术的迅速发展及广泛应用，人们经常需要提取高分子量的植物DNA，用于构建基因文库、基因组southern 分析、酶切及克隆等，这是研究基因结构和功能的重要步骤。
本实验目的是学习从植物材料中提取和测定DNA 的原理并掌握CTAB 提取DNA 的方法，进一步了解DNA 的性质。
二、原理细胞中的DNA 绝大多数以DNA-蛋白复合物（DNP）的形式存在于细胞核内。
提取DNA 时，一般先破碎细胞释放出DNP，再用含少量异戊醇的氯仿除去蛋白质，最后用乙醇把DNA 从抽提液中沉淀出来。
DNP与核糖核蛋白（RNP）在不同浓度的电解质溶液中溶解度差别很大，利用这一特性可将二者分离。
以NaCl 溶液为例：RNP在0.14mol/L NaCl中溶解度很大，而DNP 在其中的溶解度仅为纯水中的1％。
当NaCl 浓度逐渐增大时，RNP的溶解度变化不大，而DNP 的溶解则随之不断增加。
当NaCl 浓度大于1mol/L 时，DNP的溶解度最大，为纯水中溶解度的2 倍，因此通常可用1.4mol/L NaCl 提取DNA。
为了得到纯的DNA 制品，可用适量的RNase 处理提取液，以降解DNA 中搀杂的RNA。
关于植物总DNA 的提取主要有两种方法：1．CTAB 法：CTAB（十六烷基三甲基溴化铵，hexadecyltrimethylammonium bromide, 简称CTAB）：是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，它能与核酸形成复合物，在高盐溶液中（0.7mol/LNaCl）是可溶的，当降低溶液盐的浓度到一定程度（0.3 mol/L NaCl）时从溶液中沉淀，通过离心就可将CTAB 与核酸的复合物同蛋白、多糖类物质分开，然后将CTAB 与核酸的复合物沉淀溶解于高盐溶液中，再加入乙醇使核酸沉淀，CTAB 能溶解于乙醇中。
2．SDS 法：利用高浓度的阴离子去垢剂SDS（十二烷基磺酸钠，Sodium dodecyl sulfate, 简称SDS）使DNA 与蛋白质分离，在高温（55～65℃）条件下裂解细胞，使染色体离析，蛋白变性，释放出核酸，然后采用提高盐浓度及降低温度的方法使蛋白质及多糖杂质沉淀，离心后除去沉淀，上清液中的DNA用酚/氯仿抽提，反复抽提后用乙醇沉淀水相中的DNA。
04 实验四 植物DNA的提取及纯度浓度鉴定.
实验步骤
10mL CTAB分离缓冲液加入50mL 离心管中， 在65℃水浴中预热。 取剪碎的植物叶片适量，置于预冷的研钵中， 倒入液氮，尽快将叶片研碎。 将约1g叶片粉末加入预热的CTAB分离缓冲 液中，轻轻转动混匀，65℃保温30分钟。 加10mL氯仿-异戊醇（24：1），轻轻混匀。 室温，4000 rpm离心10分钟。
异丙醇 氯仿-异戊醇（24：1） 液氮 70%乙醇
TE 缓冲液
10mmol/L Tris-HCL （pH7.4） 1mmol/L EDTA
思考题
本实验中CTAB、EDTA、巯基乙醇的 作用是什么？ 吸取样品、抽提应注意什么？为什么？ 提取DNA时除去蛋白质的方法有哪些？
用一开口较大的滴管将上层水相吸入另一干 净的50mL离心管中，加入等体积的异丙醇， 轻轻混匀，使核酸沉淀下来 用玻璃棒将丝状DNA搅起，转移至10mL 70％乙醇中，浸泡洗涤10分钟 用玻璃棒取出DNA沉淀，室温下干燥 将DNA沉淀溶于0.5 mL TE缓冲液中
DNA纯度和浓度鉴定
取100uL DNA溶液（剩余的DNA溶液放 在-20℃保存），用TE缓冲液稀释20，50 和100倍，测定A260和A280
实验四
植物DNA的提取与鉴定
实验原理
真核生物DNA与蛋白质结合，以核蛋白的 形式存在于细胞核内 在提取DNA时，通过研磨破坏细胞壁和细 胞膜，释放出核蛋白
实验原理
在浓氯化钠溶液（1～2 mol／L）中， DNA核蛋白的溶解度很大，RNA核蛋 白的溶解度很小。
在稀氯化钠溶液（0.14 mol／L）中， DNA核蛋白的溶解度很小，RNA核蛋 白的溶解度很大。 利用不同浓度氯化钠溶液将DNA核蛋白 或RNA核蛋白从样品中分别抽提出来。
十六烷基三甲基溴化铵亲水基
十六烷基三甲基溴化铵亲水基一、引言十六烷基三甲基溴化铵（简称CTAB）是一种常见的阳离子表面活性剂，具有优良的表面活性、乳化性、分散性等性能，广泛应用于各个领域。
本文将对CTAB的性质、应用、制备与纯化、发展趋势等方面进行探讨，以期为相关人员提供参考。
二、十六烷基三甲基溴化铵的基本性质1.分子结构CTAB的分子结构由长链烷基和三个甲基组成，其中一个甲基带有溴原子。
其分子式为C19H40BrN，相对分子质量为309.3。
2.亲水基性质CTAB分子中含有季铵盐基团，具有较强的亲水性。
在水溶液中，CTAB分子会离解成阳离子，与水分子形成氢键，使其具有良好的溶解性。
3.溶解性CTAB在水、醇等极性溶剂中具有良好的溶解性。
随着温度的升高，溶解度逐渐增大。
此外，CTAB在不同浓度的溶液中，溶解度也有所不同。
三、应用领域1.表面活性剂CTAB作为阳离子表面活性剂，具有良好的表面活性，可用于制备洗涤剂、清洁剂等日常用品。
2.乳化剂CTAB在油水体系中具有良好的乳化性能，可用于制备乳液、涂料等产品。
3.分散剂CTAB能有效分散固体颗粒，提高颗粒在水性体系中的稳定性，广泛应用于造纸、陶瓷、建材等行业。
四、产品制备与纯化1.制备方法CTAB的制备方法主要有两种：一是烷基化反应，二是季铵化反应。
烷基化反应是将长链烷基溴化物与氢氧化钠反应生成CTAB；季铵化反应是将长链烷胺与氢氧化钠、溴化钠反应制备CTAB。
2.纯化工艺CTAB的纯化工艺主要包括重结晶、溶剂萃取等。
重结晶是将CTAB溶液加热、冷却、过滤得到纯品；溶剂萃取则是利用CTAB在不同溶剂中的溶解度差异，进行多次萃取以提高纯度。
五、发展趋势与展望1.市场需求随着科技的进步和环保要求的提高，CTAB在各个领域的应用将持续扩大，市场需求不断增长。
2.技术创新为满足环保、节能等要求，CTAB的制备工艺和应用技术将不断优化和创新，包括绿色合成、高效应用等方面。
3.环保要求未来，CTAB的生产和应用将更加注重环保，致力于降低能耗、减少污染，实现可持续发展。
CTAB法提取植物DNA
清洗
• 将上清液再次离心，去除其中的杂质和蛋白质。 将得到的上清液转移到新的离心管中。
DNA的纯化与溶解
在上清液中加入等体积的异丙醇，混 匀后放置一段时间，使DNA沉淀下来。
将清洗后的DNA晾干，然后加入适量 的TE缓冲液溶解DNA。此时可以得到 高质量的植物DNA样品，可用于后续 的实验或保存备用。
利用ctab法提取的DNA进行遗传多样性 分析，有助于了解植物种群的遗传结构和 演化历程。
在植物育种中的应用
分子标记辅助育种
利用ctab法提取的DNA进行分子标 记辅助育种，能够快速准确地鉴定优 良基因型，提高育种效率。
转基因育种
通过ctab法提取的DNA可以用于构建 基因，为转基因育种提供重要的 基因资源。
DNA浓度测定
根据DNA溶液的吸光度值，计算DNA的浓度。
DNA完整性评估
通过电泳检测DNA片段的大小和完整性，评估DNA的质量。
04 ctab法提取植物DNA的 应用与展望
在植物遗传研究中的应用
基因定位
通过ctab法提取的DNA可用于基因定位 ，确定基因在染色体上的位置和功能。
VS
遗传多样性分析
实验过程中的安全注意事项
实验操作安全
在实验过程中，应遵循实验室安全规定，避免交 叉污染和意外事故的发生。
防护措施
佩戴实验服、手套、口罩等防护用品，确保实验 操作人员的安全。
化学品使用
正确使用和处理实验过程中涉及的化学试剂，避 免对实验操作人员造成伤害。
实验结果的判定与评估
DNA纯度检测
通过紫外分光光度计检测DNA溶液的A260/A280值，判断DNA 的纯度。
参考文献3
CTAB法提取植物DNA的步骤包括将植 物组织研磨成粉末，加入预热的缓冲 液和CTAB，混合均匀后进行离心，取 上清液加入乙醇沉淀，离心后取出 DNA进行洗涤和干燥。在提取过程中 需要注意避免交叉污染和样品间的混 淆。
植物基因组dna的提取实验报告
植物基因组dna的提取实验报告植物基因组DNA的提取实验报告。
植物基因组DNA的提取是分子生物学实验中的一项重要步骤，对于研究植物的遗传特性和基因表达具有重要意义。
本实验旨在通过提取植物细胞中的DNA，为后续分子生物学实验提供基础支持。
在本次实验中，我们选择了小麦叶片作为实验材料，采用CTAB法提取植物基因组DNA，并对提取的DNA进行质量评估。
首先，我们收集了新鲜的小麦叶片样品，并将其置于液氮中迅速冷冻保存，以保持DNA的完整性。
接着，将叶片样品磨成细末状，并加入预冷的CTAB提取液中，进行细胞破裂和DNA的溶解。
随后，通过酚/氯仿提取法分离DNA与蛋白质，最终得到DNA的沉淀物。
在实验过程中，我们注意到了一些关键的操作细节。
首先，样品的冷冻保存和研磨过程需要迅速进行，以防止DNA的降解。
其次，在加入CTAB提取液后，充分混合样品并保持恒温，有助于细胞破裂和DNA的溶解。
最后，在进行DNA的沉淀时，需要注意避免将上清液一同转移，以保证提取得到的DNA纯度。
提取得到的DNA样品经过紫外分光光度计检测，结果显示其纯度较高，吸光比值（A260/A280）约为1.8，符合DNA的纯度要求。
随后，我们进行了琼脂糖凝胶电泳实验，观察到明显的DNA条带，并通过对照DNA分子量标准品的迁移情况，初步评估了提取得到的DNA片段大小。
通过本次实验，我们成功地提取到了小麦叶片样品中的基因组DNA，并对其质量进行了评估。
下一步，我们将利用提取得到的DNA样品，开展进一步的分子生物学实验，包括PCR扩增、基因克隆等，以深入研究小麦的遗传特性和基因表达。
本次实验为我们提供了可靠的DNA样品，为后续实验奠定了坚实的基础。
总之，植物基因组DNA的提取是分子生物学研究中的重要步骤，本次实验通过CTAB法成功提取了小麦叶片样品中的DNA，并对其进行了质量评估。
提取得到的DNA样品具有较高的纯度和完整性，为后续实验提供了可靠的基础支持。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
植物DNA的提取与鉴定
实验原理
真核生物的DNA与组蛋白结合，以DNA核
蛋白的形式存在于细胞核内。
在提取DNA时，通过研磨破坏细胞壁和细 胞膜，释放出DNA/L NaCl中，DNA核蛋白的溶
解度大，RNA核蛋白的溶解度小。
在0.14 mol/L NaCl中，DNA核蛋白溶解 度小，RNA核蛋白溶解度大。
提取DNA的量：0.75-2.5 mg；
质量鉴定：A260/A280比值1.80-2.00，合格。
紫外光吸收法鉴定DNA纯度和浓度
核酸的紫外吸收260 nm，蛋白质280 nm
DNA的A260/A280约1.8，RNA的约2.0 50 ug/mL DNA溶液，A260 = 1.0 40 ug/mL RNA溶液，A260 = 1.0
实验步骤
将10 mL CTAB提取液加入50 mL 离心管中，在 65℃水浴中预热； 约50 g（全班共用）植物叶片，置于预冷的研钵中， 倒入液氮，充分研磨10 min； 每组取2-3 g叶片粉末，加入预热的CTAB提取液中， 混匀，65℃保温30 min； 加10 mL氯仿-异戊醇，轻柔充分振荡3-5 min。 5000 rpm离心5 min。
用紫外分光光度计测定A260和A280；
计算DNA的含量； 鉴定DNA的纯度。
试 剂
CTAB提取液
2.0% CTAB （十六烷基三甲基溴化铵）
1.4 mol/L NaCl 20 mmol/L EDTA 100 mmol/L Tris-HCl（pH8.0） 0.2% 巯基乙醇
CTAB
CTAB是阳离子去污剂，能使蛋白质变性， 还能与核酸形成特异的核酸-CTAB复合物。
思考题
本实验中CTAB、EDTA、巯基乙醇、
Tris各有什么作用？
吸取样品、抽提时应注意什么？为什么？
在提取DNA时，有哪些方法可以除去蛋 白质？
实验结果（2015）
2-3勺充分磨碎的小白菜叶片；
提取的DNA溶于100 mL TE；
测定：A260值0.15-0.50； 浓度：7.5-25 ug/mL；
去除蛋白质的方法
①氯仿-异戊醇使蛋白质变性，离心除去变
性蛋白；
②十二烷基硫酸钠（SDS）使蛋白质变性，
与核酸分离，从材料中提取出DNA； ③苯酚使蛋白变性，离心分层，后者停留 在酚层内。
破坏DNA完整结构的因素
①化学因素：pH4.0-11.0稳定，否则变性
降解； ②物理因素：DNA是长链线状分子，机械 剪切作用会使分子断裂； ③酶的作用：DNA酶降解DNA分子。
用塑料滴管将上清吸入另一支50 mL离心管中，加 入等体积的异丙醇，轻柔充分混匀，静置5 min； 用玻棒将絮状DNA沉淀搅起，置于10 mL 70％乙 醇中浸泡5 min；（如果沉淀量很少，5000 rpm离 心5 min，弃上清，用 10 mL 70％乙醇中浸泡沉淀
5 min）
将DNA沉淀在室温干燥5-8 min； 将DNA沉淀溶于100 mL TE缓冲液中；
核酸-CTAB复合物可溶于 ≥ 0.7 mol/L NaCl的高盐溶液。
液氮：研磨 氯仿-异戊醇（24:1）：蛋白质变性 异丙醇：沉淀DNA 70%乙醇：脱盐
TE缓冲液
10 mmol/L Tris-HCl （pH7.4） 三羟甲基氨基甲烷，维持弱碱性 1.0 mmol/L EDTA
抑制DNA酶活性