PSAG12-ipt基因转化植株研究进展
植物蓝光反应的研究进展
植物向光素的研究进展钱善勤王忠顾蕴洁扬州大学农学院农学系植物学专业摘要：向光素是继光敏色素、隐花色素之后发现的又一种植物光受体，本文对今年来植物蓝光受体向光素方面的研究进展做一综述：（1）向光素是一个分子量120kD，能够结合FMN，且能够进行自动磷酸化作用的蓝光受体；（2）向光素是介导植物向光性运动、叶绿体移动与气孔开放等反应的主要蓝光受体；（3）向光素的在蓝光信号传导反应中能够启动生长素载体的运动，以及启动Ca2+流的运动，从而调节植物器官相关的生长运动。
关键词向光素蓝光受体向光性叶绿体移动气孔开放光是对植物调控作用最广泛、最明显的环境因子。
光作为环境信号，对植物的器官发生、形态建成、向性运动等方面都有深刻的影响（Pepper et al, 2001；Campbell and Liscum，2001；Briggs 和 Olney，2001）。
蓝光反应是植物光形态建成的重要反应之一，也是研究得最为广泛的一种反应。
蓝光反应的发现最早要追溯到1881年达尔文发现蓝光诱导的向光性反应。
蓝光反应主要包括植物的向光性运动，叶绿体移动和气孔开放等反应，而介导这三种反应的主要蓝光受体是向光素(Lin, 2002)。
向光素介导的植物蓝光反应一般包括三个基本步骤：（1）刺激感受（stimuli perception），即植物体感受细胞中的向光素接受单方向的光信号刺激；（2）信号转导（signal transduction），向光素把光信号刺激转化为物理或化学的信号；（3）运动反应（motor response），生长器官接受物理或化学的信号后，发生物理或生化反应，从而引发相应的生长反应。
以下就有关问题的研究进展进行介绍。
1 向光素的分子性质1988年，Gallagher等首先报道了蓝光能够激发豌豆黄化苗生长区一种120kD的质膜蛋白的磷酸化作用（Gallagher et al,1988）。
从野生型拟南芥黄化苗中分离出的这种120kD质膜蛋白进行光照，发现其发生强烈的磷酸化作用。
PGPR作用机制及其在农业上的应用研究进展
PGPR作用机制及其在农业上的应用研究进展PGPR是植物生长促进剂，全称为植物生长促进菌，是一类对植物具有积极生物学效应的微生物。
PGPR能够帮助植物吸收和利用养分，增强植物的耐逆性和免疫功能，促进植物生长和发育。
PGPR主要由具有固氮能力的细菌和真菌组成，如根瘤菌、枯草芽孢杆菌、溶磷菌等。
这些微生物能够与植物根系互作，通过产生植物生长激素、固氮、溶磷和抗生素等物质，改善植物的生长环境和生理状况。
PGPR的主要作用机制有以下几个方面：1. 生物促进剂：PGPR能够促进植物生长，增加植物根系的发育和生物量积累。
它们通过诱导植物合成生长激素，如IAA（吲哚-3乙酸）等，促进植物的根系生长和侧根分枝，增强植物的光合作用和养分吸收能力。
2. 固氮菌：PGPR中的一些细菌具有固氮能力，可以将大气中的氮气转化为植物可利用的氨氮，提供植物所需的氮源。
这样可以减少植物对土壤氮肥的依赖，降低农业生产成本，并对环境具有良好的影响。
3. 溶磷菌：PGPR中的一些细菌和真菌具有溶磷能力，可以分解土壤中的有机磷，转化为植物可利用的无机磷。
磷是植物生长的重要营养元素，提供植物所需的磷源有助于促进植物生长和发育。
4. 抗病菌：PGPR中的一些细菌和真菌具有抗菌活性，能够产生一些具有抗生活性的次生代谢产物，如抗生素和抗菌肽等。
这些物质可以抑制土壤中的一些病原微生物的生长和繁殖，降低病害的发生风险。
PGPR在农业上的应用研究已经取得了一些进展。
目前，PGPR已经广泛应用于蔬菜、水稻、小麦、玉米等作物的生产中，并取得了较好的效果。
应用PGPR可以增加植物的产量和品质，改善根系形态和养分吸收能力，增强植物的抗病能力。
PGPR还可以促进土壤微生物多样性，改善土壤酶活性，提高土壤质量和养分利用效率。
未来的研究重点主要包括PGPR的发酵工艺和产业化技术的研究、PGPR在不同土壤类型和环境条件下的应用效果评价、PGPR与农药的配合应用研究等。
农杆菌介导PSAG12-IPT基因转化辣椒的研究
农杆菌介导PSAG12-IPT基因转化辣椒的研究李秋庆;陈国菊;曹必好;陈长明;雷建军【摘要】异戊烯基转移酶(Isopentenyl-Transferasas,IPT),也称作细胞分裂素合成酶,是植物中细胞分裂素合成的限速酶.IPT在转基因植株中超表达后,会使叶片中的细胞分裂素含量增加,从而延缓叶片衰老.但过高对植物的生长和育性都是有害的.如果将衰老特异性启动子(PSAG)与IPT基因融合,在它的驱动下表达,只有在叶片衰老时才表达合成分裂素,既能延缓衰老又不影响植物的生长发育.以pCAMBIA1301-PMI表达载体为基础载体,用衰老特异性启动子驱动目的基因IPT,用辣椒Flamingobill外植体作受体,采用农杆菌介导的方法转化辣椒,并利用甘露糖筛选体系对辣椒转化体进行筛选,对转基因植株进行分子生物学检测和抗衰老检测.结果表明,共获得82株抗性植株,PCR检测的阳性率约为50％.而在对T1代的PCR检测表明该基因能稳定遗传给下一代.这些经转化的植株具有叶片衰老延缓及植株生命周期延长等现象,花的衰老也有所延缓.T1的株高和侧芽萌发与对照相比无明显差异.【期刊名称】《辣椒杂志》【年(卷),期】2015(013)002【总页数】7页(P23-29)【关键词】辣椒;IPT基因;衰老特异性启动子;甘露糖;遗传转化【作者】李秋庆;陈国菊;曹必好;陈长明;雷建军【作者单位】华南农业大学园艺学院,广州510642;华南农业大学园艺学院,广州510642;华南农业大学园艺学院,广州510642;华南农业大学园艺学院,广州510642;华南农业大学园艺学院,广州510642【正文语种】中文农杆菌介导PSAG12－IPT基因转化辣椒的研究李秋庆陈国菊曹必好陈长明雷建军1（华南农业大学园艺学院，广州510642）摘要异戊烯基转移酶（Isopentenyl-Transferasas, IPT），也称作细胞分裂素合成酶，是植物中细胞分裂素合成的限速酶。
花粉管通道法转基因技术在果树上的研究进展
花粉管通道法转基因技术在果树上的研究进展果树的基因转化研究早在1988年，首先在核桃上取得突破，McGranahan等获得了转gus基因核桃再生植株。
此后，果树转基因工程研究日益发展，许多果树获得了转基因植株，但是与农作物的转基因工程研究相比，果树转基因工程还是远远处于落后状态。
最难转化的禾谷类，现在也已经有多种作物进入转基因的商业化生产阶段，而果树仅有一例转基因植物进入田间试验（方宏筠等，1999）。
我国在樱桃、草莓、苹果等果树转基因方面做了许多研究工作，并都获得了转化目的基因的转基因植株，特别是樱桃的转抗菌肽基因已由农业部批准进入田间实验，该项研究处于国际领先水平。
1988年第一株转基因核桃(Juglans regia L.)在美国诞生为利用基因工程改变果树特定性状、培育果树新品种奠定了实践基础。
相对于农作物而言，果树转基因技术及研发相对滞后转化体系仍有待进一步完善，但果树基因工程也有其突出的优势。
目前，我国已在荔枝、番木瓜、苹果、柑橘、梨、桃、香蕉、猕猴桃、葡萄、樱桃、草莓的果树上展开了遗传转化技术的研究，转化方法主要包括农杆菌介导法和基因枪轰击的方式，获得了部分转基因植株。
在果树等林木育种中，花粉管通道法的相关研究少有报道，仅见钟启宏等采用花粉管通道导入方法，将欧洲黑杨的一个克隆片段导入泡桐，最终获得了3株可含50μg/mL的Kan培养基上生长的幼苗。
侯立群（2000）等利用花粉管通道发进行核桃转基因研究，只是获得了畸形果植株，但尚未完成分子鉴定等。
山东农业大学张玲（2004）利用花粉管通道法对杏转化抗寒基因相关研究。
由于果树，栽培环境复杂、生产周期长，且主要为风媒传粉植物，与作物相比，在影响树种自身遗传多样性等方面，其潜在的生态风险性可能更大。
随着果树转基因成功事例逐年增加，转基因果树的生态安全性问题也越发受到重视。
由于花粉管通道法进行转化的供体可以是植物总DNA，即利用自然界现有的具目的性状的外源DNA或基因进行遗传转化，其实质相当于远缘杂交。
细胞分裂素合成关键基因ipt应用研究进展
细胞分裂素合成关键基因ipt应用研究进展作者：皮照兴廉玉利李依娜孟德勇来源：《中国科技纵横》2016年第17期【摘要】本文介绍了细胞分裂素的种类和生物合成过程，阐述了异戊烯基转移酶是细胞分裂素生物合成过程中的重要限速酶，其编码基因ipt已被克隆并在植物基因工程得到广泛应用。
重点综述了转化ipt基因可增加植物内源细胞分裂素的含量，在延缓叶片衰老、提高作物产量、诱导单性结实、抗旱、抗病虫害、抗寒等方面起到了显著作用，并分析了ipt基因在植物基因工程中应用研究方向。
【关键词】细胞分裂素异戊烯基转移酶基因工程【Abstract】In this paper， the species and biosynthetic process of cytokinins are introduced. Isopentenyl-transferases catalyze the rate-limiting step of cytokinin biosynthesis， and its coding genes have been cloned and used widely in plant genetic engineering .The overview of the ipt gene transformation can be increased endogenous cytokinin content which has significant effect in retard leaf senescence， increase crop yield， induced parthenocarpy， drought resistance， disease resistance and insect resistance， cold resistance and other aspects.At the same time， the paper analyzed the application and research direction of the ipt gene in plant gene engineering.【Key words】Cytokinin； Isopentenyl-transferase gene （ipt）； genetic engineering细胞分裂素是植物生长发育过程中五大类植物生长调节剂之一，在促进细胞分裂和扩大、诱导器官分化、延缓叶片衰老进程以及在种子萌发和逆境应答等重要生理生化反应方面均发挥着重要的作用。
用in planta方法转化甘蓝型油菜
Ξ基金项目 :国家转基因专项 (J00A200821) 和武汉市重点科技攻关项目 (20002001006) 。 作者简介 :徐光硕 (1978 - ) ,男 ,植物分子生物学与生物化学专业硕士研究生 ; 3 通讯作者 (Corresponding author) :孟金陵 (1948 - ) ,男 ,农学
以提取的植株叶片总 DNA 为模板 ,根据 npt Ⅱ 基 因 的 表 达 序 列 设 计 并 合 成 引 物 5′2CGTAAAG2 CACGAGGAAGC23′和 5′2AATGAACTCCAGGACGAGG2 3′。设计 PCR 反应的总体积为 20 μL ,其中模板 500 ng ,dNTP 0. 2 mmol·L - 1 ,引物浓度 0. 5μmol·L - 1 。将 各组分均匀混合在 9 600 热循环仪上进行 PCR 反 应 :94 ℃3 min ;94 ℃1 min ,68 ℃1 min ,72 ℃2 min , 35 个循环 ;72 ℃延伸 10 min ;4 ℃保存 ,通过凝胶电泳 检测 PCR 扩增片段 。
在模式植物拟南芥中曾一直采用依赖于植物组 织培养的低效的遗传转化方法进行转基因实验 。 1993 年 ,Bechtold 等发明了截然不同于离体方法的 in planta 转化法 。他们将生成的花序剪掉 ,再用根 癌农杆菌通过真空渗入拟南芥花萼 ,几天后将新产 生的花序剪掉 ,重新用农杆菌浸泡 ,让之后的花正常 发育结实[1] 。每枝经过处理的植株可以获得 10 个 转基因种子 (占所有种子的 0. 4 %) 。Clough 和 Bent
青蒿素的化学全合成.总结
青蒿素的合成与研究进展纲要：青蒿素是当前生界上最有效的治疗疟疾的药物之一，存在活性好、毒副作用小、市场需求大、根源窄等特色。
当前，青蒿素的获取门路主要有直接从青蒿中提取、化学合成和生物合成。
本综述将针对最近几年来青蒿素的发展特色及合成方法进行阐述。
重点词：青蒿素；合成方法；研究进展青蒿素是中国学者在20 世纪70 年月初从中药黄花蒿( Artem isia annua L1 )中分别获取的抗疟有效单体化合物,是当前生界上最有效的治疗脑型疟疾和抗氯喹恶性疟疾的药物 , 对恶性疟、间日疟都有效 , 可用于凶险型疟疾的急救和抗氯喹病例的治疗。
青蒿素还拥有克制淋巴细胞的增殖和细胞毒性的用1；拥有影响人体白血病 U937 细胞的凋亡及分化的作用2；还拥有部分逆转 MCF-7/ARD 细胞耐药性作用3；还拥有克制人胃癌裸鼠移植瘤的生长的作用4；还拥有必定的抗肿瘤作用 5 等。
除此以外，青蒿素及其衍生物还拥有生物抗炎免疫作用、生物抗肿瘤作用、克制神经母细胞瘤细胞增殖的作用等。
世界卫生组织确立为治疗疟疾的首选药物, 具有迅速、高效、和低毒副作用的特色。
6 。
因在发现青蒿素过程中的优秀贡献，屠呦呦先后被授与2011 年度拉斯克临床医学研究奖和2015 年诺贝尔医学奖。
1青蒿素的理化性质及根源青蒿素的分子式为 C15H22O5, 相对分子质量为 282. 33。
是一种含有过氧桥构造的新式倍半萜内酯，有一个包含过氧化物在内的 1， 2， 4-三烷构造单元，它的分子中还包含 7 个手性中心，合成难度很大。
中国科学院有机所经过研究，解决了架设过氧桥难题，在 1983 年达成了青蒿素的全合成。
青蒿素也有一些弊端 , 如在水和油中的溶解度比较小 , 不可以制成针剂使用等。
2青蒿中提取青蒿素青蒿素是从菊科植物黄花蒿中提拿出来的含有过氧桥的倍半萜内酯类化合物，在治疗疟疾方面拥有起效快、疗效好、使用安全等特色。
当前主要的提取方法有溶剂提取法、超临界提取法、超声波萃取法、微波萃取法、其余萃取法等。
高级植物生理学01植物衰老
植物衰老一、植物衰老植物衰老是植物生命科学研究领域的核心问题之一。
无论是在器官水平上还是在个体水平上，衰老都是一个高度有序的被调控的过程。
植物叶片衰老是一种程序性的细胞死亡(Programmed cell death , PCD)，是叶片发育的最终阶段。
它除了代表生命周期的终结之外,在发育生物学上也有着重要的意义。
在这段时期内，植物在成熟叶片中积累的物质，将被分解并运送至植物其他生长旺盛的部位。
叶片衰老是一种受遗传和外界因子(如日照、病害、遮荫、高温、干旱和水涝等逆境) 影响的高度程序化过程(Thomashe Stoddarj，1982)。
对于产生种子的作物，包括绝大多数农作物,衰老引起的叶片同化功能的减退极大程度地限制了作物产量潜力的发挥；对蔬菜作物亦会造成采后损失，叶片和根系早衰是造成结实率偏低、空秕率较高的现象的主要原因，水稻品种存在理论上推算水稻如果推迟1天衰老，可是水稻增产2％左右。
二、植物叶片衰老的指标最明显的外观标志是叶色由绿变黄、脱落，而在细胞水平上表现为叶绿素含量下降，蛋白质含量下降，光合磷酸化能力降低，膜脂过氧化加剧，游离氨基酸积累，腐胺含量上升而精胺含量下降，细胞分裂素含量下降，脱落酸含量上升,多种酶活性改变等等。
许多大分子物质如蛋白质、膜脂、RNA等降解形成的N素等营养物质被转运至幼嫩的叶片、发育中的种子，加以重新利用和储存。
叶片衰老最明显的表现就是叶绿素逐渐消失，并伴随着黄化以及叶片的最终脱落（Leshem，1981）。
叶绿素a比叶绿素b下降得快，叶绿素含量以及叶绿素a/b 比值可作为衰老的1个指标。
聂先舟等（1989）报道水稻离体叶片随着离体天数的增加，叶绿素含量下降，衰老加深。
从衰老过程中叶绿体超微结构的变化也可以看出叶绿体随年龄而逐渐解体。
因而有人提出叶绿素分解是衰老的原发过程及衰老的真正标志。
随着小麦叶片的衰老，叶绿素的破坏加强，且叶绿素a破坏率高于叶绿素b，衰老过程中积累的超氧阴离子(O-2)能直接引发叶绿素的破坏及特异性地破坏叶绿素a，致使叶绿素分解破坏和叶绿素a/b值下降。
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PSAG12-ipt基因转化植株研究进展张根良1,2 王文泉2(1华南热带农业大学农学院, 儋州571737;2中国热带农业科学院热带生物技术研究所, 海口571101)摘要: 叶片衰老是一种程序性死亡过程; ipt ( isopentenyl transferas ) 基因转化植株, 可以催化调控内源细胞分裂素合成, 延缓转化株叶片衰老。
SAG12 基因启动子能够控制ipt 基因在植株下部衰老叶片中表达。
介绍了ipt 基因和SAG12 基因启动子的来源和应用, 以及PSAG12-ipt基因的产生和转化植株在国内的研究概况。
关键词: SAG12 ipt 细胞分裂素叶片衰老叶片衰老是一种典型的细胞程序性死亡, 它表现在叶绿素、脂类、蛋白质和RNA 的减少, 有助于提高植物的适应性; 它可以作为作物选择的一个重要指标来增加作物的遗传改良潜力。
目前, 对于叶片衰老的机制已经在生理生化、分子水平得到一定的阐明, 获得了一些与衰老有关的基因。
并且发现在衰老进程中, 植物激素, 包括生长素、赤霉素、乙烯、脱落酸和细胞分裂素起着非常重要的作用。
其中, 细胞分裂素作为植物衰老过程中的一个关键因子得到了广泛的关注。
已有研究通过转化ipt 基因增加植物内源的细胞分裂素, 可以延缓植物叶片的衰老, 增强植物对非生物逆境的抗性。
ipt 基因来源于土壤农杆菌( Agrobacterium tumefaciens) 的Ti 质粒, 编码一种异戊烯基转移酶, 催化和调控细胞分裂素的合成。
Medford( 1989) 等[1]利用ipt 基因转化烟草和拟南芥, 用来源于玉米的hsp70 作为热诱导启动子,调控ipt 基因的表达, 受热激诱导后的转基因植物表现出叶片衰老的延迟, 细胞分裂素显著增加, 但没有诱导的转基因植物在细胞分裂素增加后, 出现了许多影响生长和发育的有害症状, 如侧芽的脱落, 茎杆和叶面积的减少, 根生长的停止等。
Gan 和Amasino( 1995)[2]采用了一种全新的策略来转化ipt基因, 利用细胞分裂素的自调控来减缓转基因烟草叶片的衰老, 而不改变其它的表型性状; 转化的ipt基因处于高度特异的-与衰老相关启动子SAG12 的控制之下, 融合的PSAG12-ipt 基因只在衰老的底部成熟叶片中表达。
简要介绍了ipt基因编码特性和SAG12 启动子在ipt 表达中的作用, 以及表达基因在转化植株中的应用。
1 叶片抗衰老基因ipt 的产生和作用植物激素在植株生长和发育中具有重要的作用, 其中细胞分裂素参与了细胞分裂的调控、延缓衰老和促进侧芽的生长; 这使研究学者试图通过改变内源细胞分裂素含量来控制这些过程。
但是植物本身的细胞分裂素合成相关基因并没有分离得到,使得根癌农杆菌中的ipt 基因得到了广泛的关注。
1984 年Akiyoshi 等从根癌农杆菌中将编码异戊烯基转移酶( ipt)的基因分离了出来, 并阐明了异戊烯基转移酶是细胞分裂素生物合成步骤中的一个关键限速酶, 它促使△2-磷酸PPi 与AMP 结合形成磷酸AMP, 接着被快速转化成异戊烯基腺苷和异戊烯基腺嘌呤; 经过细胞分裂素氧化酶作用最终分别形成玉米素核苷和玉米素ipt 基因从农杆菌中分离, 导入植物基因组中所产生转基因植株, 观察发现组织细胞分裂素含量增加, 叶片衰老延迟。
但是植株形态也发生了变化; 例如转基因植株芽不萌发, 没有顶端优势, 叶片小而圆, 不形成根等。
引起这些变化的主要原因就是ipt 基因在植株中的表达没有控制, 使细胞分裂素合成过剩, 从而影响了植株的生长。
为了解决植物组织中细胞分裂素过量表达的问题, 研究学者用了许多组织特异性启动子和可诱导启动子来表达外源ipt 基因, 如热激启动子、铜诱导启动子等, 均获得了相应的抗衰老植株; 这些转基因植株能够产生正常的根系, 但植株通常矮小, 并且有大量腋生芽。
激素分析显示, 转基因植株内的激素水平仍高于对照植株的激素水平。
这些研究仅局限于实验室, 限制了抗衰老遗传转化工程在农业生产上的应用。
2 SAG12 启动子在转ipt 植株中的应用1994 年Lohman 等从拟南芥中分离得到一组衰老相关基因( SAGs) , 研究证明其中编码半胱氨酸蛋白酶的SAG12 基因表达产物只存在植物下部衰老叶片中, 在嫩叶中并没有发现。
说明SAG12 具有高度的衰老特异表达特性。
SAG12 基因启动子( PSAG12) 活性受到叶片衰老过程和细胞分裂素含量的调控。
当叶片开始衰老、细胞分裂素含量下降时, PSAG12 被激活, SAG12 基因表达; 随着叶片细胞分裂素含量的增加, 叶片衰老进程被抑制, PSAG12 又逐渐被抑制。
因此, 人们开始利用PSAG12 来控制ipt 基因的表达。
根据PSAG12 衰老特异表达特性, 使ipt 基因在PSAG12 驱动下在植物衰老叶片中表达, 有效调控内源细胞分裂素含量, 在不影响植株正常发育的前提下, 达到延缓叶片衰老的目的。
1995 年Gan 等把SAG12 特异启动子与ipt 构建形成PSAG12-ipt 嵌合基因, 通过根癌农杆菌介导转化烟草获得转基因植株。
经研究发现这种新型转基因植株与野生型相比, 叶片衰老明显延迟, 花数和生物量也有所增加; 但形态方面无明显差别, 根系发育完全, 顶端优势得到保持, 在生理方面也表现出光合作用延长。
同时, 还对PSAG12-ipt 和PSAG12-gus转化株的GUS 活性进行了比较。
结果表明, 前者的GUS 活性的提高明显比后者缓慢, 说明PSAG12-ipt 自调控系统确实起到了自动调节的作用。
PSAG12-ipt 自调控系统具有低水平表达、自动调节表达的优点, 不需要耗费巨大的人力物力, 就可能实现延缓作物衰老, 提高产量。
这些都为转基因植株农业推广奠定了基础。
3 PSAG12-ipt 转化植株和衰老调控编码细胞分裂素生物合成限速步骤合成酶———异戊烯基转移酶( isopentenyl-transferases) 的基因首先在根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)中得到鉴定,被称为ipt基因。
随着拟南芥(Arabidopsis)基因组测序工作的完成, 对ipt 基因又有了新的了解。
研究表明, 拟南芥的异戊烯基转移酶是被一个小的多基因家族编码, 其结构与细胞腺苷酸异戊烯基转移酶和tRNA 异戊烯基转移酶相似。
进行基因产物的生化分析还揭示了ADP 和ATP 是反应的优先底物[11]。
在对植物叶片衰老研究过程中, 根据差异筛选和减扣杂交等检测手段, 发现衰老叶片的RNA 总量下降, 特别是rRNA 水平剧烈下降[12]。
相反, 某些基因则在衰老开始后, 表达量反而逐渐升高; 这类基因被称为SAG 基因。
目前已经从拟南芥等植物中克隆出了大约30 多中SAG 基因, 但只有其中一小部分表现出高度的衰老特异性, 如从拟南芥中克隆出的SAG12、SAG13[10]和从欧洲油菜( Brassicanapus) 中克隆出的LSC54 。
这些基因的功能有的已经被证实与衰老细胞内的大分子物质的降解转运有关, 如编码核酸酶、蛋白酶、酯酶、谷氨酰胺合成酶等的基因。
用带有来源于拟南芥的衰老相关基因SAG12启动子和新霉素磷酸转移酶( NPT II) 选择基因的双元质粒作为载体, 将克隆自土壤农杆菌Ti 质粒的ipt 基因导入双元质粒构建表达载体。
利用构建的含ipt 基因的表达载体通过农杆菌介导法、基因枪法等途径转化植株, 按照规定的程序获得转基因株系[14]。
获得的转基因植株还要通过PCR、Southern杂交等对所转ipt 基因的稳定性进行检测; 通过GUS活性和细胞分裂素含量分析, 证明抑制衰老的自我调节系统在转基因植株中得到表达。
当叶片开始衰老时, SAG12 基因启动子( PSAG12)被激活, 表达ipt 基因合成细胞分裂素; 通过细胞分裂素抑制核糖核酸酶、脱氧核糖核酸酶、蛋白酶等的活性, 延缓核酸、蛋白质、叶绿体等的降解; 同时细胞分裂素可促使营养物质向应用部位移动。
4 PSAG12-ipt 对植株的生理影响PSAG12-ipt 转基因植株除了延缓下部叶片衰老外, 其他形态学和野生型对照基本相同, 如株高、叶型、侧芽萌发等。
但是转基因植株种子萌发和幼苗生长相对比较缓慢。
这可能是由于在植株早期生长时, 所转基因被激活所引起的。
研究还发现, PSAG12-ipt 转基因植株茎干变粗, 茎干内部的水含量也相应增加。
已知细胞分裂素可以增加内部还原性糖的含量[15]。
因此, 这些还原性糖的积累可能会导致渗透压的增加, 促使植物吸水和细胞膨胀, 最终使得茎干变粗和茎干内水量增加。
已有研究表明, 植物中细胞分裂素的积累与植物的N 状态紧密相关[16]。
但是缺氮对PSAG12-ipt 植株并没有太大的影响。
在缺少氮和硝酸盐的条件下,植株仍然保持绿色。
研究表明, 转基因植株生长培养基去氮5~10d 后, 检测发现植株内氮含量减少了70%, 但并没有显著抑制植株的生长, 也没有发现黄化的叶片[17]。
PSAG12-ipt 的这种反作用为作物育种提供了一个新的机遇。
转PSAG12-ipt 基因还可以延缓由水涝胁迫所引起的衰老[18]。
当水涝胁迫消除后, 转基因株系糖、叶绿素、细胞分裂素和脱落酸的恢复都比野生型迅速; 转基因植株根部细胞分裂素积累更快。
5 PSAG12-ipt 基因转化植株在国内的研究国内对作物衰老调控的研究, 以前一直局限在宏观上。
随着国外PSAG12-ipt 基因的产生和应用, 近几年国内也对此基因进行了植株转化和利用, 并在作物遗传育种上取得了可喜的成绩。
1998 年付永彩等[19]利用基因枪法把带有特异衰老基因SAG12 启动子的ipt 基因导入水稻, 并用PCR、Southern 杂交等证明外源基因稳定性。
通过GUS 活性、细胞分裂素含量的分析以及T1 代转基因植株成熟期的形态观察, 证明PSAG12-ipt 基因在部分转基因水稻中表达, 叶片衰老受到明显抑制。
随着研究的深入, 国内通过对青菜[20]和油菜[21等植株的基因转化, 都证实PSAG12-ipt 延缓叶片衰老, 增长叶片利用光能的时间, 使之积累了大量的光合产物。
通过对转PSAG12-ipt 基因水稻叶片中叶绿体的类囊体、嗜锇体等超微结构变化研究[22], 也说明叶片衰老抑制基因PSAG12-ipt 在转化植株中的表达可明显延缓叶片衰老, 较长时间保持叶片绿色。
2004 年奚亚军等[23]利用花粉管通道法将叶片衰老抑制基因PSAG12-ipt 导入普通小麦, 获得了 2 株叶片早衰现象得到明显改善的转基因植株。