标准储备菌株纯度确认标准操作规程

1.目的：建立标准菌种确认标准操作规程，以减少菌种污染和生长特性的改变，保证实验结果的可靠性和准确性。

2.范围：微生物限度实验室所用标准储备菌株。

3.职责：QC主管生测员对本规程的实施负责。

4.依据：中国药典2015年版四部通则。

5.内容：5.1.实验菌株5.1.1 标准菌株5.1.1.1 标准菌株应来自认可的国内或国外菌种收藏机构。

5.1.1.2 标准菌株经过复活并在适宜的培养基中生长后，即为标准储备菌株。

5.1.1.3 标准储备菌株应进行纯度和特性确认。

5.1.2 工作菌株5.1.2.1 标准储备菌株可用于定期转种（每3个月）或制备工作菌株。

5.1.2.2 工作菌株的传代次数应严格控制，不得超过5代（从菌种收藏机构获得的标准菌株为第0代），以防止过度的传代增加表型变化的风险。

因此必要时，应对工作菌株的纯度和特性进行确认。

5.2 菌种确认试验的主要内容5.2.1 菌种的纯度确认5.2.1.1 纯度检测：是指通过适当的方法检测菌种是否为纯培养物。

5.2.1.2 实验内容⑴菌落形态：在特定的培养基上，将待检测培养物稀释涂布或平板划线，适宜培养后，用一平板上的单菌落的大小、形状、颜色、质地、光泽等是否相似；对于两种或以上形态的出发菌株，应再分别挑取单菌落划线或稀释涂布培养，检测是否重复出现相同特征。

⑵镜检特征：对数生长期的培养物革兰氏染色反应应呈现一致性；细胞形状、大小、荚膜、芽孢等特征应相似。

5.2.2 菌种的特性确认5.2.2.1 生化试验各种微生物具有各自的独特的酶系统，因而在代谢过程中所参与的物质分解和合成代谢的产物也不同，这些代谢产物又具有不同的生化特征。

根据此特征，利用生物化学方法来鉴定不同的微生物的试验即为微生物的生化试验。

5.3 菌种的确定方法用无菌的接种环粘取培养物，在相应的培养基平板上划线分离单个菌落，并在适宜条件下培养。

培养后观察是否具有典型的菌落形态，然后挑取单一纯菌落，进行革兰染色、镜检，观察其染色特性及菌形。

再做生化试验或使用菌种鉴定系统进一步鉴定菌种。

5.3.1 大肠埃希菌的确认5.3.1.1 菌落形态⑴取大肠埃希菌新鲜培养物至胰酪大豆胨液体培养基中，经35℃培养18～24小时后，形成菌膜，管底有粘液状沉淀，培养物有粪臭味。

⑵取上述培养物接种于麦康凯琼脂平板上，35℃培养18～24小时后，观察结果。

⑶麦康凯琼脂平板上菌落形态呈鲜桃红色或微红色，菌落中心呈深桃红色，圆形，扁平，边缘整齐，表面光滑，湿润。

5.3.1.2 革兰染色、镜检⑴革兰染色以接种环沾取无菌水于洁净的载玻片上，取麦康凯琼脂平板上的菌落，制成均匀涂片，自然或微温晾干，再通过火焰2～3次干燥固定。

滴加结晶紫染液，染色1分钟，水洗。

滴加碘液，媒染1分钟，水洗，用滤纸吸干余水。

滴加95%乙醇，脱色20～30秒，至流出液无色，水洗。

滴加沙黄染液，复染1分钟，待干后，镜检。

⑵染色结果：革兰阳性菌呈蓝紫色；革兰阴性菌呈红色。

⑶镜检结果：两端钝圆的短小直杆菌，单个或成对，革兰阴性，无芽孢，多有鞭毛。

以周身鞭毛运动或不运动，许多菌株有荚膜和微荚膜。

5.3.1.3 生化试验⑴靛基质试验 (I) 取麦康凯琼脂平板上的菌落，接种于蛋白胨水培养基，培养24～48小时，沿管壁加入靛基质试液数滴，轻轻摇动试管。

液面成玫瑰红色为阳性，呈试剂本色为阴性。

98%的大肠埃希菌靛基质试验为阳性。

一般24h即可出现阳性结果，以无菌操作先从管中取出1或2ml培养液进行检查，如靛基质是阴性，余下的蛋白胨水培养基再培养24h，作靛基质试验。

⑵甲基红试验(M) 取麦康凯琼脂平板上的菌落,接种于缓冲葡萄糖胨水培养基,培养48±2小时,于培养液中加入甲基红指示液2～3滴（约每1ml培养液加指示液1滴），轻微摇动，立即观察。

液面成红色或橘红色为阳性，呈黄色为阴性。

⑶乙酰甲基甲醇生成试验(V-P) 取麦康凯琼脂平板上的菌落，接种于缓冲葡萄糖胨水培养基,培养48±2小时，于2ml培养液中加入α-萘酚乙醇试液1ml,混匀，再加40%氢氧化钾试液0.4ml,充分振摇，在30分钟内出现红色为阳性，无红色反应色为阴性。

⑷枸橼酸盐利用试验(C) 取麦康凯琼脂平板上的菌落，接种于西蒙氏柠檬酸盐琼脂培养基斜面上，培养2～4天。

培养基斜面上有菌苔生长，培养基由绿色变为蓝色时为阳性，培养基颜色无改变，无菌苔生长为阴性。

⑸乳糖发酵试验取麦康凯琼脂平板上的菌落，接种于乳糖发酵管，培养小时，观察产酸（指示剂为酸性品红者为红色；指示剂为溴麝香草酚蓝者为黄色），产气（小倒管内有气泡，气泡无论大小都是产气）。

为避免迟缓发酵乳糖产生假阴性，亦可接种5%乳糖发酵管。

绝大多数迟缓发酵乳糖的细菌，可于24小时出现阳性，或适当延长培养时间。

5.3.2 金黄色葡萄球菌的确认5.3.2.1 菌落形态⑴取金黄色葡萄球菌新鲜培养物至胰酪大豆胨液体培养基中，经35℃培养18～24小时后，呈均匀浑浊生长，繁殖较多时易产生沉淀，沉淀易被摇散。

⑵取上述培养物划线接种于甘露醇氯化钠琼脂平板上，培养24～72小时观察结果。

⑶菌落形态金黄色，圆形凸起，边缘整齐，外围有卵磷脂分解的乳浊圈，菌落直径1～2mm。

5.3.2.2 革兰染色、镜检⑴革兰染色以接种环沾取无菌水于洁净的载玻片上，取甘露醇氯化钠琼脂平板上的菌落，制成均匀涂片，自然或微温晾干，再通过火焰2～3次干燥固定。

滴加结晶紫染液，染色1分钟，水洗。

滴加碘液，媒染1分钟，水洗，用滤纸吸干余水。

滴加95%乙醇，脱色20～30秒，至流出液无色，水洗。

滴加沙黄染液，复染1分钟，待干后，镜检。

⑵染色结果：革兰阳性菌呈蓝紫色；革兰阴性菌呈红色。

⑶镜检结果：为革兰阳性球菌，菌体呈球形或略椭球形，菌体短小，菌体大小不一。

无芽孢，一般不产生荚膜。

排列呈不规则的葡萄状，亦可呈单个、成双或短链状排列。

5.3.2.3 生化试验⑴触酶试验取甘露醇氯化钠琼脂平板上的菌落，接种至TSA斜面上，培养24小时。

取TSA上的菌落置于洁净的载玻片上，然后滴加3%的过氧化氢数滴，长气泡为阳性，否则为阴性。

（原理：具有过氧化氢酶的细菌，能催化过氧化氢生成水和氧，出现气泡）5.3.3.1 枯草芽孢杆菌的确认5.3.3.1 菌落形态⑴取枯草芽孢杆菌新鲜培养物至胰酪大豆胨液体培养基中，经35℃培养18～24小时后，液体培养基表面呈片状生长。

⑵取上述培养物划线接种于胰酪大豆胨琼脂平板上，培养24～72小时观察结果。

⑶菌落为灰色，干燥、皱缩、无典型卷发状。

1.3.3.2 革兰染色、镜检⑴革兰染色以接种环沾取无菌水于洁净的载玻片上，取胰酪大豆胨琼脂平板上的菌落，制成均匀涂片，自然或微温晾干，再通过火焰2～3次干燥固定。

滴加结晶紫染液，染色1分钟，水洗。

滴加碘液，媒染1分钟，水洗，用滤纸吸干余水。

滴加95%乙醇，脱色20～30秒，至流出液无色，水洗。

滴加沙黄染液，复染1分钟，待干后，镜检。

⑵镜检结果：革兰阳性芽孢杆菌芽孢为椭圆到柱状，位于菌体中央或稍偏，芽孢形成后菌体不膨大。

5.3.4 白色念珠菌的确认5.3.4.1 菌落形态⑴取白色念珠菌新鲜培养物至沙氏葡萄糖液体培养基中，经35℃培养24～48小时后，液体呈浑浊生长。

⑵取上述培养物划线接种于沙氏葡萄糖琼脂平板上，经35℃培养24～48小时（必要时延长至72小时）观察结果。

⑶菌落呈乳白色偶见淡黄色，表面光滑有浓酵母气味，培养时间稍久则菌落增大，颜色变深、质地变硬或有皱褶。

⑷取沙氏葡萄糖琼脂平板上的培养物接种至念珠菌显色培养基平板上，经35℃培养24～48小时（必要时延长至72小时）观察结果。

⑸平板上为绿色或翠绿色的菌落。

5.3.4.2 革兰染色、镜检取念珠菌显色培养基平板上的培养物进行革兰染色，镜检。

⑴革兰染色以接种环沾取无菌水于洁净的载玻片上，取念珠菌显色培养基平板上的菌落，制成均匀涂片，自然或微温晾干，再通过火焰2～3次干燥固定。

滴加结晶紫染液，染色1分钟，水洗。

滴加碘液，媒染1分钟，水洗，用滤纸吸干余水。

滴加95%乙醇，脱色20～30秒，至流出液无色，水洗。

滴加沙黄染液，复染1分钟，待干后，镜检。

⑵镜检结果：革兰阳性芽孢杆菌芽孢为厚膜孢子、菌丝、芽管。

5.3.5 黑曲霉菌的确认5.3.5.1 镜检：可见孢子，菌丝。

5.3.6 铜绿假单胞菌的确认5.3.6.1 菌落形态⑴取铜绿假单胞菌新鲜培养物至胰酪大豆胨液体培养基中，经35℃培养18～24小时后，液面可形成菌膜，细菌在深层发育不良，呈微浑浊或透明状，菌液上层为蓝绿色。

⑵取上述培养物划线接种于溴化十六烷基三甲铵琼脂平板上，培养18～24小时观察结果。

⑶菌落形态呈扁平、无定形、周边扩散、表面湿润，灰白色，周围时有蓝绿色素扩散。

5.3.6.2革兰染色、镜检⑴革兰染色以玻璃棒沾取无菌水于洁净的载玻片上，取溴化十六烷基三甲铵琼脂平板上的菌落，制成均匀涂片，自然或微温晾干，再通过火焰2～3次干燥固定。

滴加结晶紫染液，染色1分钟，水洗。

滴加碘液，媒染1分钟，水洗，用滤纸吸干余水。

滴加95%乙醇，脱色20～30秒，至流出液无色，水洗。

滴加沙黄染液，复染1分钟，待干后，镜检。

染色结果：革兰阳性菌呈蓝紫色；革兰阴性菌呈红色。

⑵镜检结果：为革兰阴性、无芽孢杆菌。

单个、成对或短链状排列。

5.3.6.3 生化试验用无菌玻璃棒轻轻接触单个典型菌落表面中心，沾取培养物，接种至胰酪大豆胨琼脂斜面上，培养18～24小时，⑴氧化酶试验将洁净滤纸片置于平皿内，用无菌玻璃棒沾取上述斜面上生长的菌落涂于滤纸片上，滴加新配置的1%二盐酸二甲基对苯二胺试液。

（在30秒内若培养物呈粉红色并逐渐变为紫红色为阳性，否则为阴性。

）注：1. 验菌落（苔）必须新鲜，陈旧培养物反应结果不可靠2. 实验宜采用玻璃棒或木棒挑取菌（苔），避免与铁、镍等金属接触，不可用普通接种针（环），否则易出现假阳性。

可以用白金材料。

3. 试剂宜新鲜配制放置过久二盐酸二甲基对苯二胺氧化变色不可用。

4. 反应需在有氧条件下就行，勿滴加试剂过多，以免浸泡培养物使之与空气隔绝，呈假阴性反应。

⑵绿脓菌素试验取TSA斜面培养物接种于绿脓菌素测定琼脂用培养基，培养24小时，观察斜面有无色素。

有色素，在试管内加三氯甲烷3～5ml，以无菌玻璃棒搅碎培养基并充分振摇，。

使培养物中的色素完全萃取在三氯甲烷内。

静止片刻，待三氯甲烷分层，用无菌吸管将三氯甲烷移至另一试管中，加入盐酸试液（1mol∕L）约1ml，振摇后静置片刻。

（若在盐酸层出现粉红色为阳性，无粉红色为阴性。

）试验可用未接种的绿脓菌素测定用琼脂培养基斜面作为阴性对照。

若培养基斜面无色素产生，于室温培养1～2天，再按上法试验，凡经再次检验，绿脓菌素试验仍为阴性应继续做一下试验。

⑶硝酸盐还原产气试验取TSA上的培养物，接种于硝酸盐胨水培养基中，置35℃培养24小时。