菌种确认标准操作规程
菌种划种LB琼脂平板检查标准操作规程
菌种划种LB琼脂平板检查标准操作规程菌种划种LB琼脂平板检查标准操作规程依据：《中华人民共和国药典》2005年版第三部。
范围：适用于大肠杆菌表达的重组人基因工程产品。
目的：检查该菌种的菌落形态是否与标准大肠杆菌菌落形态一致，并检查是否染有杂菌。
原理：将该菌种在LB琼脂平板上划线分离培养，以检查菌落形态以及是否染有杂菌。
内容：1 材料1．1 材料1．1．1 菌种：PBV888/DH5α，来源于主种子批或工作种子批。
1．1．2 注射用水：符合《中华人民共和国药典》2005年版的要求。
1．1．3 药品氯化钠 NaCl 分析纯琼脂粉分析纯酵母粉蛋白胨无水乙醇 CH3CH2OH 分析纯1．1．4 器皿平皿、三角烧瓶（3L）、量筒（1L）、玻棒、试剂瓶。
1．1．5 其它材料线绳、牛皮纸、硫酸纸、剪刀、接种环、煤气灯。
1．2 仪器设备生物安全台Ⅱ级A型安徽蚌埠净化设备厂恒温培养箱 HG303-5B型湖北省黄石市医疗器械厂扭力天平 TN-100B型上海第二天平厂2 方法2．1 准备工作2．1．1 生产环境：在十万级洁净间进行。
场地摘下“清场合格”标志牌，挂“使用中”标志牌。
2．1．2 器皿的洁净要求玻璃器皿经洗刷组处理完毕后，用硫酸纸及牛皮纸包好，用线绳系紧，送高压灭菌（121.3℃60分钟）。
脱脂棉用硫酸纸、牛皮纸包好，高压灭菌121.3℃60分钟。
2．1．3 调试仪器设备2．1．3．1确认扭力天平运行状态良好，已挂有“备用”标志牌。
2．1．3．2确认恒温培养箱运行状态良好已挂有“运行”标志牌。
2．1．3．3确认生物安全台运行状态良好已挂有“备用”标志牌。
2．2 溶液的配制2．2．1 LB琼脂培养基的配制1000ml摘下扭力天平“备用”标志牌，挂上“运行”标志牌。
用扭力天平称取酵母粉5克，蛋白胨10克，NaCl 10克，琼脂粉20克，倒入三角烧瓶中，加注射用水1000ml，用玻棒搅匀，分别用硫酸纸、牛皮纸包口，用线绳扎紧，标明名称、配制时间， 115.6℃30分高压灭菌。
检定菌保存、传代、使用、销毁标准操作规程
检定菌保存、传代、使用、销毁标准操作规程1．目的：规范药品微生物学检定用菌的管理，最大限度降低变异率，确保菌种的溯源性与稳定性，从而确保微生物学检验结果的准确可靠。
2．依据：ChP2010版（一部）、《中国药品检验标准操作规范》（2010年版）。
3．范围：本规程适用于检定用菌种的管理，包括菌种的申购、保存、传代、使用及销毁等。
4．责任:4.1.QC主管负责菌种的申购、接受、保存、分发.4。
2.微生物检验员负责菌种的确认、传代、使用及销毁。
5.相关文件及术语：5.1．术语标准菌种是指由中国药品生物制品检定所医学微生物菌种保藏管理中心提供的冷冻干燥菌。
传代用菌种是指用标准菌种制备的采用特定保存方法长期固定保存的菌种，用于传代及制备工作用菌种.工作用菌种是指用标准菌种或传代用菌种接种至普通琼脂斜面培养后,作为日常工作使用的菌种。
菌种的代是指将其接种至一新鲜培养基上或培养基内，每萌发一次即称为一代,从菌种保藏中心获得的冷冻干燥菌种为第0代。
6.标准：6.1．检定菌的申购QC主管每年根据检定菌种的使用情况(包括临时检验需要），提出购买计划，交由质量管理部部长审批后，向中检所菌种保藏中心或省（市）药检所购买冻干菌种(标准菌种);也可以直接向省（市）药检所购买传代用菌种，购买时，需询问与确定菌种的代数，以便传代时控制代数。
6.2．检定菌的接收菌种到达实验室后,由QC主管接收菌种，检查其名称和数量，以及每一支的完整性，同时将菌种的所有信息，填写在《检定菌接收记录》（附表1）上,内容包括：名称、数量、编号(无编号者按检定菌种的编号原则编号)、代数、来源、接收日期、接收人等，并将其暂贮存于4～8℃冰箱中,在一周内必须完成转种。
6。
3．检定菌的保存6.3。
1．工作用菌种的保存工作用菌种采用斜面低温保存法.将菌种接种在适宜的固体斜面培养基上，待菌生长充分以后，转移至4~8℃冰箱中保存.此法仅用于工作用菌种的短期保存，并应随时检查其污染杂菌和变异等情况,发现异常情况，经应灭活处理后销毁。
微生物菌种、毒株和样本标准操作程序与流程
病原微生物菌（毒）种和样本的标准操作规程流程1．目的：对本实验室菌种、毒种的申购、保存、保管、领用、处理等各个环节实行有效的监督控制,防止意外事故发生，确保疾病预防与控制检验业务及科研教学工作.2．适用范围及菌种、毒种专职管理人员适用于本科微生物实验室菌种、毒株的管理；菌种、毒种专职管理人员:于瑞芳、侯恩言3．职责①微生物实验室负责菌、毒种的出入库保管、保存及处理等日常管理。
②科室指定2名菌种、毒种库管理人员承担菌、毒种日常管理.③科室负责人负责一、二类菌、毒种的出入库和向上级索取及对下级发送的审核.④技术管理层批准本实验室一、二类菌、毒种的出入库和向上级索取及对下级发送的审批。
4．工作程序⑴报送及入库①当微生物实验室检出菌、毒株应及时报送市疾病预防控制中心。
②新发现的菌、毒种,要做好原始记录，逐级报送进行复核确认，报送时须2人参加.③一、二类菌、毒种入库前,科室审核，技术管理层批准后入库④个人不得擅自保留菌、毒种，必须由科室进行统一编号、登记入库管理⑤菌、毒种入库时， 2名菌、毒种保管人员须认真做好菌毒种的编号、登记工作。
⑵日常管理①保管人员由于瑞芳、侯恩言2名检验人员组成。
②菌、毒种入库时，保管人员应及时验收,统一编号，填写《菌、毒种登记表》③严禁随意将菌、毒种置于非菌、毒种专用保存场所,应做到三专（专室、专柜、专锁）。
④菌、毒种库由2名保管人员双锁管理，铁门与锁必须牢固有效，发现损坏须及时报修。
未经各科室负责人同意，不得擅自将钥匙委托他人代管。
⑤菌、毒种保管人员应定期对库内温度、湿度、通风及冰箱、冰柜等菌、毒种保藏设备运转情况进行检查，并做好记录.⑥菌、毒种保管人员根据菌、毒种的保存期限，及时通知分管病种的检验人员进行传代,定期鉴定，并详细记录在《菌、毒种登记表》⑦菌、毒种保管人员发现菌、毒种发生变异和死亡,应及时向科室负责人报告，并填写《菌、毒种登记表》。
科室须将变异及死亡的一、二类菌、毒种通报技术管理层。
菌种检定操作规程
菌种检定操作规程
《菌种检定操作规程》
一、目的
菌种检定操作规程旨在规范菌种检定过程，确保检定结果准确可靠，保障实验室菌种质量。
二、适用范围
本规程适用于各类实验室对菌种进行检定的操作。
三、设备和试剂
1. 必备设备：无菌工作台、培养箱、平板计数器等。
2. 必备试剂：琼脂培养基、生理盐水、甘油等。
四、菌种检定操作流程
1. 取样准备：将待检菌种进行悬浮液制备或直接取样，保证单一菌种在接种时的质量。
2. 培养基接种：将取样溶液均匀涂敷于琼脂培养基表面，将琼脂培养基放入培养箱进行培养。
3. 孵化：将接种后的琼脂培养基置于培养箱中，进行相应的温度和时间的培养。
4. 菌落计数：使用平板计数器对菌落进行计数，记录结果。
5. 结果分析：根据计数结果，对菌种进行鉴别和鉴定。
五、结果确认与报告
1. 只有经过两名以上实验人员的确认，结果方可出具。
2. 将检定结果填写在检定记录表上，并进行备份存储。
六、质量控制
1. 定期对实验室设备和试剂进行检验、校正。
2. 定期进行内部质量控制，对检定结果进行复核和比对。
七、附则
1. 对于异常情况的处理：出现异常结果时，要及时进行排查并记录处理过程。
2. 本规程未尽事宜，由实验室主管负责进行详细规定。
以上即为《菌种检定操作规程》的内容，希望各实验室严格按照此规程进行菌种检定工作，确保实验室菌种质量及检定结果的准确性。
菌种鉴定标准操作规程
菌种鉴定标准操作规程目的：建立菌种鉴定标准操作规程范围：适用于******鉴定标准操作职责：内容：1整体操作步骤1.1纯化、分离待鉴定菌用接种环挑取待鉴定菌落或少许含菌溶液到相应的培养基上（如TSA），划线分离，以出现微生物单菌落为止。
1.2挑取纯化后的单菌落，进行革兰染色、镜检，以确定待鉴定菌的革兰属性。
1.3如镜检结果为革兰阴性杆菌，则先进行发酵实验。
如发酵实验结果为阴性，则选用API20NE试剂条进行鉴定；如发酵实验结果为阳性，则在经过细胞色素氧化酶实验后选用API20E试剂条进行鉴定。
1.4如镜检结果为革兰阳性球菌，则先进行过氧化氢酶实验。
如实验结果为阴性则选用API Strep试剂条进行鉴定，如实验结果为阳性则选用API Staph试剂条进行鉴定。
1.5假如镜检结果为革兰阳性杆菌并且有内生芽胞，则选用API 50CHB试剂条进行鉴定；否则，根据运动性实验和过氧化氢酶实验结果选用API Coryne或其他试剂条进行鉴定。
1.6选定正确的试剂条以后，根据不同的API试剂条的标准操作规程准备接种物，进行接种、培养等操作并将结果形成数码，用API鉴定软件鉴定或查询待检菌的名称均可。
鉴定结果应记录，必要时，给出相应解释。
2革兰氏染色2.1染色剂的配制2.1.1结晶紫染色液：甲液：结晶紫 1.0g95%的酒精20ml乙液：草酸铵0.8g水80ml将甲液和乙液混合均匀，静置48h使用，置密闭棕色瓶中储存。
2.1.2碘液：碘 1.0g碘化钾 2.0g水300ml配制时先用3～5ml水将碘化钾溶解，再加入碘，用力摇匀，使之全部溶解后，再加水稀释至300ml，摇匀，分装在棕色瓶中储存。
2.1.3稀石碳酸红溶液:碱性品红 1.0g石碳酸 5.0ml95%乙醇10.0ml配制时用乙醇溶解碱性品红，然后加入石碳酸溶液，使用时加水稀释至100ml，摇匀。
2.2操作:2.2.1涂片：用接种环挑取液体培养物中菌体在载玻片上涂成薄层，固体培养物则先在载玻片上滴一滴蒸馏水或生理盐水，用接种环挑取少量菌体在载玻片上涂成薄层。
16srrna鉴定菌株的标准操作规程
16srrna鉴定菌株的标准操作规程1. 准备工作：清洗实验室器具、准备培养基和试剂、保持操作环境的无菌状态。
2. 提取细菌样品：从菌落、液体培养基或环境样品中选择一个菌落较纯净的菌株。
使用无菌操作工具，在无菌条件下，用菌液或菌落均匀涂抹于无菌平板上。
3. 培养菌株：将无菌平板培养基转移到适合该菌株生长的培养条件下。
通常情况下，大多数菌株可以在37℃下培养24小时后获得足够的菌量。
4. 提取菌株的16S rRNA基因：使用合适的菌株提取方法提取菌株的总DNA，并使用PCR方法扩增16S rRNA基因。
PCR 反应条件可根据实验室的标准方法或相关文献进行设置。
5. 准备电泳样品：将扩增的16S rRNA基因产物与DNA分子量标记物一同混合，通过琼脂糖凝胶电泳进行分离和检测。
6. 电泳分析：将准备好的电泳样品注入琼脂糖凝胶孔中，进行电泳分析。
根据相对位置和迁移速度，确定16S rRNA基因的大小。
7. 分离目标DNA带：使用无菌操作工具，在琼脂糖凝胶上切割目标DNA带。
8. 提取目标DNA带：使用合适的目标DNA提取方法，从琼脂糖凝胶上提取目标DNA带。
9. DNA序列测定：将提取的目标DNA带进行测序，可以委托测序机构进行测序，也可以使用实验室的测序设备进行测序。
10. 序列分析：使用生物信息学工具对测序结果进行分析，包括序列比对、物种鉴定和进化分析等。
11. 物种鉴定结果的确认：将测序结果与数据库中的已知序列进行比对，确定菌株的物种鉴定结果。
12. 数据和结果的解释：根据测序结果和数据库比对结果进行数据分析和结果解释。
上述是针对16S rRNA基因进行鉴定的一般操作流程，具体操作规程可能因实验室的要求和设备的不同而有所差异。
实施过程中应始终保持无菌操作，确保结果的准确性和可靠性。
微生物菌种、毒株和样本标准操作程序与流程
病原微生物菌（毒）种和样本的标准操作规程流程1．目的：对本实验室菌种、毒种的申购、保存、保管、领用、处理等各个环节实行有效的监督控制，防止意外事故发生，确保疾病预防与控制检验业务及科研教学工作。
2．适用范围及菌种、毒种专职管理人员适用于本科微生物实验室菌种、毒株的管理；菌种、毒种专职管理人员：于瑞芳、侯恩言3．职责①微生物实验室负责菌、毒种的出入库保管、保存及处理等日常管理。
②科室指定2名菌种、毒种库管理人员承担菌、毒种日常管理。
③科室负责人负责一、二类菌、毒种的出入库和向上级索取及对下级发送的审核。
④技术管理层批准本实验室一、二类菌、毒种的出入库和向上级索取及对下级发送的审批。
4．工作程序⑴报送及入库①当微生物实验室检出菌、毒株应及时报送市疾病预防控制中心。
②新发现的菌、毒种，要做好原始记录，逐级报送进行复核确认，报送时须2人参加。
③一、二类菌、毒种入库前，科室审核，技术管理层批准后入库④个人不得擅自保留菌、毒种，必须由科室进行统一编号、登记入库管理⑤菌、毒种入库时， 2名菌、毒种保管人员须认真做好菌毒种的编号、登记工作。
⑵日常管理①保管人员由于瑞芳、侯恩言2名检验人员组成。
②菌、毒种入库时，保管人员应及时验收，统一编号，填写《菌、毒种登记表》③严禁随意将菌、毒种置于非菌、毒种专用保存场所，应做到三专（专室、专柜、专锁）。
④菌、毒种库由2名保管人员双锁管理，铁门与锁必须牢固有效，发现损坏须及时报修。
未经各科室负责人同意，不得擅自将钥匙委托他人代管。
⑤菌、毒种保管人员应定期对库内温度、湿度、通风及冰箱、冰柜等菌、毒种保藏设备运转情况进行检查，并做好记录。
⑥菌、毒种保管人员根据菌、毒种的保存期限，及时通知分管病种的检验人员进行传代，定期鉴定，并详细记录在《菌、毒种登记表》⑦菌、毒种保管人员发现菌、毒种发生变异和死亡，应及时向科室负责人报告，并填写《菌、毒种登记表》。
科室须将变异及死亡的一、二类菌、毒种通报技术管理层。
菌种操作规程[精选]
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子斜面接种及培养
¡ 子斜面接种由两人操作 ，一人为主操作 ，一人为辅操作。 首先将子斜面和母斜面的双层纱布解去 ，将绳子和纱布 放在超净台左边待用 。主操作将母斜面和子斜面的棉塞 逐个打开 ，并在酒精灯火焰上烧瓶口至无水雾为止。
¡ 主操作用无菌铲将母斜面上的孢子和菌丝刮下 ，接种于 子斜面中 ，利用子斜面的冷凝水，将孢子和菌丝打散 ， 均匀涂布于子斜面表面 ，然后塞上棉塞 ，用双层纱布扎 口 ，并将接种铲在肉汤培养基中蘸一下做无菌试验，将 肉汤放置36～38℃培养间培养 。一支母斜面接种一般接 1～2支子斜面。
脱脂牛奶的制备
¡ 将买来的新鲜牛奶倒入离心管中以3000转/分离心 15分钟 ，去掉上层的脂 ，下层即为脱脂牛奶。
¡ 脱脂好的牛奶倒入试管（。18×200mm）或250mL
三角瓶中 ，置消毒锅中灭菌 ，灭菌温度110℃、时 间20分钟。 ¡ 按10%的抽样率抽取灭菌好的脱脂牛奶作无菌实验， 每支肉汤倒入约1mL左右的牛奶 。然后置37℃恒温 间培养48h观察肉汤变化情况 ，判定是否染菌 ，如 无染菌 ， 即可使用。
母瓶菌丝的制备
¡ 母瓶培养基配方
成 份 葡萄糖 酵母粉
PH
配 比 3%
1.5%
8.2～8.8
规 格 分析纯 符合酵母粉验收标准
¡ 配制称量时 ，一般将不溶或难溶物质（如酵母粉等） 和易溶解物分开称 ，根据母瓶培养基配方称取所需 葡萄糖和酵母粉重量，葡萄糖用蒸馏水溶解 ，酵母 粉直接按配比分装于三角瓶内。
母瓶接种及培养
¡ 母瓶接种由两人操作 ，一人为主操作子斜面 ，一人为辅操作母瓶， 主操作用接种铲取孢子于茄氏瓶中 ，一支铲子只能用于一只子斜 面 ，将3～5支子斜面的孢子接入装有80mL无菌水的带玻璃珠三 角瓶中 ，放置摇床上180～220转/分钟摇10～15分钟制成孢悬液。
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1．目的
建立菌种确认标准操作规程，以减少菌种污染和生长特性的改变，保证实验结果的可靠性和准确性。
2．依据《中国药典》2010版二部
3．范围本规程适用于质量控制实验室所用标准储备菌株。
4．责任质量部，质量控制实验室
5．内容
5.1试验菌株
大肠埃希菌（Escherichia coli）[CMCC(B)44 102]
金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）[CMCC(B)26 003]
枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）[CMCC(B)63 501]
白色念珠菌（Candida albicans）[CMCC(F)98 001]
黑曲霉（Aspergillus niger）[CMCC(F)98003]
5.1.1标准菌株
5.1.1.1
标准菌株应来自认可的国内或国外菌种收藏机构。
5.1.1.2
标准菌株经过复活并在适宜的培养基中生长后，即为标准储备菌株。
5.1.1.3
标准储备菌株应进行纯度和特性确认。
5.1.2
工作菌株
5.1.2.1
标准储备菌株可用于制备每月或每周一次转种的工作菌株
5.1.2.2
工作菌株的传代次数应严格控制，不得超过 5 代（从菌种收藏机构获得的标准菌株为第0代），以防止过度的传代增加表型变化的风险。
因此必要时，应对工作菌株的纯度和特性进行确认。
5.2菌种确认试验的主要内容
5.2.1菌种的纯度确认
5.2.1.1
纯度检测：是指通过适当的方法检测菌种是否为纯培养物。
5.2.1.2
试验内容
①菌落形态：在特定的培养基上，将待检测培养物稀释涂布或平板划线，适宜培养后，同一平板上的单菌落的大小、形状、颜色、质地、光泽等是否相似；对于两种或以上形态的出发菌株，应再分别挑取单菌落划线或稀释涂布培养，检测是否重复出现相同特征。
②镜检特征：
对数生长期的培养物革兰氏染色反应应呈现一致性；细胞形状、大小、荚膜、芽孢等特征应相似。
5.2.2菌种的特性确认
5.2.2.1
生化试验：各种微生物具有各自的独特的酶系统，因而在代谢过程中所参与的物质分解和合成代谢的产物也不同，这些代谢产物又具有不同的生化特征。
根据此特征，利用生物化学方
法来鉴定不同的微生物的试验即为微生物的生化试验。
5.3 菌种的确定方法
用无菌接种环粘取培养物，在相应的培养基平板上划线分离单个菌落，并在适宜条件下培养。
培养后观察是否具有典型的菌落形态，然后挑取单一纯菌落，进行革兰氏染色、镜检，观察其染色特性及菌形。
再做生化试验或使用菌种鉴定系统进一步鉴定菌种。
5.3.1大肠埃希菌的确认
5.3.1.1菌落形态
5.3.1.1.1取大肠埃希菌新鲜培养物至营养肉汤培养基中，经35℃培养18～24h后，形成菌膜，管底有粘液状沉淀，培养物有粪臭味。
5.3.1.1.2取上述培养物接种于曙红亚甲蓝琼脂(EMB)琼脂平板和麦康凯琼脂平板上，35℃培养18～24h后，观察结果。
①曙红亚甲蓝琼脂(EMB)
琼脂平板上菌落形态呈紫黑色、浅紫色、蓝紫色或粉红色,菌落中心呈深紫色或无明显暗色中心，圆形，稍凸起，边缘整齐，表面光滑、湿润，常有金属光泽。
②麦康凯琼脂平板上菌落形态呈鲜桃红色或微红色，菌落中心呈深桃红色，圆形，扁平，边缘整齐，表面光滑，湿润。
5.3.1.2革兰染色、镜检
5.3.1.2.1革兰染色
①以接种环沾取无菌水于洁净载玻片上，取菌落形态（①、②）的培养物少许，制成均匀涂片，自然或微温，再通过火焰2～3次干燥使固定。
②滴加结晶紫染液，染色1min，水洗。
③滴加碘液，媒染1min，水洗，以滤纸吸干余水。
④滴加95﹪乙醇，脱色20～30s，至流出液无色，水洗。
⑤滴加沙黄染液，复染1min，待干后，镜检。
5.3.1.2.2染色结果应是：革兰阳性菌呈蓝紫色：革兰阴性菌呈红色。
5.3.1.2.3镜检结果应是：两端钝圆的短小直杆菌，单个或成对，革兰阴性，无芽孢，多
有鞭毛，以周身鞭毛运动或不运动，许多菌株有荚膜和微荚膜。
5.3.1.3生化试验
5.3.1.3.1
靛基质试验（I）：取菌落形态（①、②）的培养物接种于蛋白胨水培养基中，培养24-48h，沿管壁加入靛基质试液数滴，轻轻摇动试管，液面呈玫瑰红色为阳性，呈试剂本色为阴性。
5.3.1.3.2甲基红试验（M）：取菌落形态（①、②）的培养物接种于磷酸盐葡萄糖胨水培养基中，培养48+2h，于培养液中加入甲基红指示液2～3滴（约1ml培养液加指示液1滴），轻微摇动，立即观察，呈鲜红色或橘红色为阳性，呈黄色为阴性。
5.3.1.3.3乙酰甲基甲醇生成试验（V-P）：取菌落形态（①、②）的培养物接种于磷酸盐
葡萄糖胨水培养基中，培养48+2h，于2ml培养液中加入α-萘酚乙醇试液1ml，混匀，再加40%氢氧化钾试液0.4ml，充分振摇，在4h（通常在30min）内出现红色应判为阳性，无红色反应为阴性。
5.3.1.3.4枸橼酸盐利用试验（C）：取菌落形态（①、②）的培养物接种于枸橼酸盐培养基斜面上，培养2-4天，培养基斜面有菌苔生成，培养基由绿色变为蓝色时为阳性，培养基颜色无改变、无菌苔生长为阴性。
5.3.1.3.5乳糖发酵试验：取菌落形态（①、②）的培养物接种于乳糖发酵管，培养24-48h，观察产酸（指示剂为酸性品红者为红色：指示剂为溴麝香草酚蓝者为黄色），产气（小倒
管内有气泡，气泡无论大小都是产气）。
5.3.2金黄色葡萄球菌的确认
5.3.2.1菌落形态
5.3.2.1.1取金黄色葡萄球菌新鲜培养物至营养肉汤培养基中，经35℃培养18～24h后，
呈均匀浑浊生长，繁殖较多时易产生沉淀，沉淀易被摇散。
5.3.2.1.2取上述培养物划线接种于甘露醇氯化钠琼脂平板和卵黄氯化钠琼脂平板上培养24～27h观察结果。
①甘露醇氯化钠琼脂平板上菌落形态金黄色，圆形凸起，边缘整齐，外围有黄色环,菌落直径0.7-1mm。
②卵黄氯化钠琼脂平板上菌落形态金黄色，圆形凸起，边缘整齐，外围有卵磷脂分解的乳浊圈，菌落直径1-2mm。
5.3.2.2革兰染色、镜检
5.3.2.2.1革兰染色（见大肠埃希菌检查法5.3.1.2）
5.3.2.2.2镜检结果：为革兰阳性球菌，菌体呈球形或略呈椭圆形，菌体较小，菌体大小不一。
无芽孢，一般不产生荚膜。
排列呈不规则的葡萄状，亦可呈单个、成双或短链状排列。
5.3.2.3生化试验
5.3.2.3.1血浆凝固酶试验
试管法：取无菌试管（10mm×10mm）2支，各加入血浆和0.9%无菌氯化钠溶液（1：1）0.5ml，1支加入营养肉汤培养液0.5ml作为阳性对照：另一支加入无菌营养肉汤0.5ml作为阴性对照。
两管同时置37℃水浴或恒温培养箱，3h后开始检查，以后每隔适当时间观察一次，直至24h。
检查时，轻轻将试管倾斜（动作勿大），仔细观察。
①阳性对照管：血浆和无菌水混合液加金黄色葡萄球菌营养肉汤培养物，在3h后开始观察直至24h。
结果：血浆凝固。
②阴性对照管：血浆和无菌水混合液加稀释液，在3h后开始观察直至24h。
结果：血浆流动自如。
5.3.3枯草芽孢杆菌的确认
5.3.3.1菌落形态
5.3.3.1.1取枯草芽孢杆菌新鲜培养物至营养肉汤培养基中，经35℃培养18～24h后，呈浑浊生长。
5.3.3.1.2取上述培养物划线接种于营养琼脂平板上，培养24～27h
观察结果：菌落为灰色、干燥、皱缩、无典型卷发状。
5.3.3.2革兰染色、镜检
5.3.3.2.1革兰染色（见大肠埃希菌检查法
5.3.3.2.2
镜检结果：革兰阳性芽孢杆菌芽孢为椭圆到柱状，位於菌体中央或稍偏，芽孢形成后菌体不膨大。
5.3.4白色念珠菌的确认
5.3.4.1菌落形态
5.3.4.1.1取白色念珠菌新鲜培养物至沙氏葡萄糖肉汤培养基中，经35℃培养24～48h后，呈浑浊生长。
5.3.4.1.2取上述培养物划线接种于沙氏葡萄糖琼脂培养基平板上，经30～35℃培养24～48h （必要时延长至72 小时）观察结果：呈乳白色偶见淡黄色，表面光滑有浓酵母气味，
培养时间稍久则菌落增大，颜色变深、质地变硬或有皱摺。
5.3.4.1.3取上述（5.3.4.1.2）培养物接种至白色念珠菌显色培养基平板上，经30～35℃培养24～48h（必要时延长至72 小时）观察结果：平板上为绿色或翠绿色的菌落生长。
5.3.4.2革兰染色、镜检及芽管试验
取上述（5.3.4.1.3）培养物接种至1%聚山梨酯80-玉米琼脂培养基上，培养24～48h。
取培养物进行染色，镜检及芽管试验。
5.3.4.2.1革兰染色（见大肠埃希菌检查法5.3.1.2）
5.3.4.2.2芽管试验：挑取1%聚山梨酯80-玉米琼脂培养基上的培养物，接种于加有一滴血清的载玻片上，盖上盖玻片，置湿润的平皿内，置35～37℃培养1～3h，置显微镜下观察，可见到由孢子长出短小芽管。
5.3.4.2.3
镜检结果：革兰阳性芽孢杆菌芽孢为厚膜孢子、菌丝、芽管。
5.3.5
黑曲霉菌的确认
5.3.5.1
镜检：可见孢子，菌丝。