免疫荧光通用操作规程

免疫荧光通用操作规程

冰冻切片的免疫荧光

1，动物组织直接OCT包埋，或灌流后的组织30%蔗糖溶液4℃过夜后，OCT包埋。-20℃保存3月，-80℃长期保存。请勿保存于液氮。2，冰冻切片机切片至少10um，空气干燥2分钟后，-20℃储存

3，切片从-20取出后，在通风橱放10-30分钟以去除水汽，4%PFA 固定15分钟，或-20℃丙酮固定15分钟置通风橱2小时

4, 1XPBS清洗玻片，3X5min 从此请保持玻片湿润

5，有时，抗原修复3小时会得到更好的结果。为此请：选用稳定的抗原修复方式（真空负压.微波修复.高压修复.隔水加热.电炉加热）…关注修复的温度，时间（抗原修复时在有效的温度范围内所持续的时间），抗原修复液必须遵循自然降温规律，使用足量的抗原修复液…选择不同PH值的修复液（A液枸盐酸缓冲液PH6.0，B液EDTA-Na缓冲液PH8.0，C液枸盐酸缓冲液PH4.5）

6，室温封闭1小时

封闭液：5%BSA+10%二抗种属来源的正常血清in 1xPBS

条件封闭液：1%BSA+3%二抗种属来源的正常血清in 1xPBS（细胞因子，无需封闭的蛋白

7，一抗4℃过夜

请用封闭液稀释一抗

8, 第二天Wash,1XPBS, 2x1min

9,二抗，1:1000 （alexa系列）1:300（dyelight )in封闭液，避光室温1小时

10, Wash,1XPBS, 3x5min

11, DAPI 染核5min，

12，DDW Rinse

13，抗淬灭剂封片，（避免气泡）避光置于通风橱过夜

14，干片后4℃保存

石蜡切片的免疫荧光

1，动物组织取出后经固定-脱水-包埋（见随后操作步骤)，制成石蜡包块

2，组织学染色切片厚度2um，免疫荧光染色切片厚度至少6um，切片复水：58℃20min-

xylene 2x10min-

100%EtoH2x10min

95%EtoH2x10min-

70%EtoH10min-，DDW5min

4, Rinse 玻片1xPBS, 从此请保持玻片湿润

5，抗原修复过夜。为此请：选用稳定的抗原修复方式（真空负压.微波修复.高压修复.隔水加热.电炉加热）…关注修复的温度，时间（抗原修复时在有效的温度范围内所持续的时间），抗原修复液必须遵循自然降温规律，使用足量的抗原修复液…选择不同PH值的修复液（A液枸盐酸缓冲液PH6.0，B液EDTA-Na缓冲液PH8.0，C液枸盐酸缓冲液PH4.5）

6，室温封闭1小时

封闭液：5%BSA+10%二抗种属来源的正常血清in 1xPBS

条件封闭液：1%BSA+3%二抗种属来源的正常血清in 1xPBS（细胞因子，无需封闭的蛋白

7，一抗4℃过夜

请用封闭液稀释一抗，如果没有二抗种属来源的正常血清，细胞因子用1%BSA封闭，同时一定要有一个阴性对照。

8, 第二天Wash,1XPBS, 2x1min

9,二抗，1:1000 （alexa系列）1:300（Dyelight )in封闭液，避光室温1小时

10, Wash,1XPBS, 3x5min

11, DDW Rinse , DAPI 染核5min，

12，DDW Rinse

13，抗淬灭剂封片，（避免气泡）避光置于通风橱过夜

14，干片后4℃保存

备注：多重荧光染色原则

A:尽量选择不同种属来源的一抗：可同时染

B:如果种属来源相同的一抗：可顺次染色，

抗原修复: O/N

第一个一抗：4℃O/N , 第二天对应二抗@RT 1hr 红光

短暂地封闭

第二个一抗：@RT 2hr，对应二抗@RT 1hr 绿光

：

DAPI

封片

备注：对照实验

A:阴性对照：组织免疫荧光必做

相同标本：只加荧光二抗:排除非特异性染色

不同样本：采用确定不含一抗对应抗原的标本验证荧光信号的特异性B：阳性对照：采用确定含有一抗对应抗原的标本

TUNEL与免疫荧光共染时

细胞的免疫荧光

1，细胞生长贴壁到80%融合，倒掉细胞培养液

2，Rinse，用固定剂rinse一到两次

3，首选4%多聚甲醛固定15min ，0.2%TritonX-100 打孔5-10min；或者选用不同的固定方式：

甲醇（分析纯or HPLC)-20℃10min

丙酮（HPLC）-20℃10min

4%多聚甲醛+0.2%TritonX-100 10min

4%多聚甲醛+0.2%Saponins10min 细胞核核膜

4%多聚甲醛15min + -20℃甲醇5min 细胞膜

4%多聚甲醛15min + -20℃丙酮5min 细胞骨架/微管蛋白

4%多聚甲醛10min @RT+4 ℃10min+ -20℃甲醇1min 细胞膜+胞浆蛋白+细胞核

4, Wash,1xPBS,2x1min 从此请保持细胞湿润

5, 室温封闭1小时

封闭液：5%BSA+10%二抗种属来源的正常血清in 1xPBS

条件封闭液：1%BSA+3%二抗种属来源的正常血清in 1xPBS 6，一抗4℃过夜

请用封闭液稀释一抗

7, 第二天Wash,1XPBS, 2x1min

8,二抗，1:1000 （alexa系列）1:300（Dyelight )in封闭液，避光室温1小时

9, Wash,1XPBS, 3x5min, DDW Rinse

10, DAPI 染核5min，

11，DDW Rinse

12，抗淬灭剂封片，（避免气泡）避光置于通风橱过夜

13，干片后4℃保存