免疫荧光通用操作规程
免疫荧光操作步骤及注意事项
免疫荧光操作步骤及注意事项免疫荧光技术是一种常用的免疫学研究方法，可以用于检测和定位抗原或抗体在细胞或组织中的表达和定位。
免疫荧光操作步骤及注意事项如下：步骤1：样品制备1.收集需要检测的细胞或组织样品。
2.如有需要，固定细胞或组织样品以保持其形态和抗原性。
3.如有需要，对组织样品进行切片以便于检测。
步骤2：抗体选择和标记1.根据需要选择合适的一抗和二抗，一抗用于识别目标抗原，二抗用于与一抗结合并携带荧光标记。
2. 选择合适的荧光染料或荧光标记，常用的有荧光素色素（FITC）、罗丹明（Rhodamine）等。
3.根据供应商指南或经典实验文献中的方法，进行抗体标记。
步骤3：荧光标记试剂的制备1.根据推荐的配方或说明书，在标记试剂的缓冲液中加入合适的荧光染料或荧光标记，并进行充分混匀。
2.如有需要，可以在标记试剂中加入其他辅助试剂以增强染色强度或减少非特异性结合。
步骤4：样品孵育1.将样品均匀分布在载玻片或孵育板上，并使其附着。
2.加入一抗和二抗的混合物，并在暗处孵育一段时间，通常在室温下孵育1-2小时或在4°C下孵育过夜。
3.如果需要，可以在抗体孵育结束后进行染色或共孵育其他标记试剂。
步骤5：洗涤1.在孵育结束后，用洗涤缓冲液洗涤样品，以去除未结合的抗体和其他杂质。
2.洗涤次数根据需要，通常进行3-5次洗涤，每次洗涤时间约5分钟。
步骤6：显微镜观察和成像1.将标本置于显微镜上，并使用荧光显微镜或倒置显微镜观察荧光信号。
2.使用合适的荧光滤光片或滤片盒，选择适当的波长来显现荧光染色。
3.根据需要，使用数字相机或图像分析软件进行图像采集和分析。
注意事项：1.仪器和试剂的准备与操作一定要在无菌和干净的条件下进行，以避免外源性污染或感染的发生。
2.使用抗体和试剂前请仔细阅读供应商提供的说明书，遵守推荐的使用和储存条件。
3.一抗和二抗的选取要慎重，确保其与目标抗原或抗体具有高度特异性。
4.荧光标记试剂的制备要注意在无菌和干净的条件下进行，避免污染或降低荧光标记效果。
免疫荧光IF操作规程
免疫荧光（IF）染色操作规程仪器设备1 18cm不锈钢高压锅和电炉2 医用微波炉3 水浴箱4 冰箱5 湿盒6 耐高温塑料切片架7 可调微量移液器8 定时器9 pH计试剂1 PBS(磷酸盐缓冲液pH7.2-7.4)2 柠檬酸盐缓冲液CBpH6.00.01mol/L1000ml配制柠檬酸三钠3g柠檬酸0.4g3 固定液配方：无水乙醇：氯仿：冰醋酸（6：3：1）组织处理程序1）组织进上述固定液12h后进组织处理程序→75%乙醇1小时→95%乙醇1小时→95%乙醇1小时→无水乙醇1小时→无水乙醇1小时→正丁醇30分钟→二甲苯30分钟→二甲苯30分钟石蜡1小时→石蜡1小时→石蜡1小时→包埋组织IF染色2）切片厚度5um，60度烤片2h，切片脱蜡，水化，依次为二甲笨Ⅰ→二甲苯Ⅱ→无水乙醇Ⅰ→无水乙醇Ⅱ→95%乙醇→90%乙醇→85%乙醇→75%乙醇各5M；3）1×PBS缓冲液（0.01 M，pH7.2）洗涤切片3×5M；4）组织抗原修复，先将切片专用耐高温高压切片架放好，然后放入柠檬酸盐液中（抗原修复液，0.01mol M，pH6.0），将高压锅封好放至普通电炉上加热，从开始加热至压力锅喷气约要15分钟，在普通高压锅嘴喷气后开始记时，时间1~2 M；5）取出抗原修复盒，待修复液自然冷却，此过程约20 M；6）PBS洗2～3次各5min（1×PBS缓冲液，0.01 M，pH7.2）；7）PBS洗2～3次各5min；8）滴加正常山羊血清封闭液,室温20min。
甩去多余液体。
9）滴加Ⅰ抗50μL（ KLK1 1：100，Bradykinin B2R 1：100）4℃过夜。
10）PBS洗3次各5min；11）滴加FITC标记的Ⅱ抗（ Rabbit ant Goat IgG/FITC, Goat anti Rabbit IgG/FITC）50μL，37℃ 40分钟；12) PBS洗3次各5min；13）荧光显微镜下观察、拍照。
细胞免疫荧光的方法(自己实践记录)
细胞免疫荧光I、步骤：一、固定：PBS 5min×3次振荡洗涤制作好的细胞爬片。
固定液覆盖细胞，RT 静置15min。
PBS 5min×3次振荡洗涤。
二、通透化：通透液覆盖细胞，RT 静置30min。
PBS 5min×3次振荡洗涤。
三、封闭：封闭液覆盖标本表面37℃孵育1h。
四、一抗孵育：一抗以合适浓度稀释PBS，覆盖标本表面。
4℃孵育过夜，第二天37℃复温1h。
PBS 5min×3次振荡洗涤。
五、二抗孵育：FITC标记二抗以合适浓度稀释于PBS，覆盖标本表面。
37℃避光孵育<60min。
PBS 5min×3次避光振荡洗涤。
六、染核：新鲜稀释Hoechst覆盖细胞表面，RT避光静置<10min。
PBS 5min×3次避光振荡洗涤。
七、封片：在干净的载玻片上滴一滴封片剂，将爬片的细胞面扣在封片剂上。
八、镜检，4℃避光保存。
II、注：1、细胞密度要合适，状态较好。
2、从孵育二抗开始要避光（关闭室内日光灯即可）。
3、完成后最好及时镜检，照相；分别用不同波长激发荧光，在Photoshop软件下合成一张图。
III、试剂配制：1、固定液：4%多聚甲醛/PBS：4g多聚甲醛，50～80mlPBS，加热至60℃，持续搅拌至完全溶解，（通常需滴加少许1n NaOH才能使溶液清亮），定容100ml，RT保存。
2、通透液：0.5 %(v/v)TritonX-100/PBS3、封闭液：正常山羊血清稀释于PBS；或商品化封闭液成品。
4、Hoechst：Hoechst33258即可。
5、封片剂：50%(v/v)甘油/PBS。
免疫荧光技术试验流程
免疫荧光技术试验流程免疫荧光技术（Immunofluorescence technique ）又称荧光抗体技术，是标记免疫技术中发展最早的一种。
它是在免疫学、生物化学和显微镜技术的基础上建立起来的一项技术。
很早以来就有一些学者试图将抗体分子与一些示踪物质结合，利用抗原抗体反应进行组织或细胞内抗原物质的定位。
以荧光抗体方法较常用。
用免疫荧光技术显示和检查细胞或组织内抗原或半抗原物质等方法称为免疫荧光细胞（或组织）化学技术。
免疫细胞荧光试验流程：1、细胞爬片制备1）、将盖玻片放入培养瓶或多孔板中2）、细胞生长实现60％后取出盖玻片3）、用PBS清洗盖玻片3次4）、将盖玻片（细胞面朝上）浸入冷丙酮或4％多聚甲醛或中性福尔马林中10至20分钟（盖上盖子以防止蒸发）5）、用PBS清洗盖玻片3次6）、将盖玻片放在滤纸上（细胞朝上）7）、干燥8—10小时，放入—20°C保管8）、试验前解冻爬片，在室温下用中性PBS浸泡10—15分钟注意：使用多聚甲醛和福尔马林固定可能会导致绿色光谱中的自发荧光。
在这种情况下，可以试验红色或红外的荧光素。
2、破膜1）、0.1％Triton孵育10min2）、PBS洗涤3次，每次3分钟3、抗原修复1）、用滤纸擦干细胞爬片2）、在爬片上加入如胰蛋白酶或其它酶抗原修复液3）、在室温下孵育10分钟4）、用PBS洗涤3次，每次10分钟4、封闭1）、在爬片上加入5％BSA封闭液（种属与二抗来源相同）2）、37°C孵育30分钟3）、甩掉多余的液体并用滤纸擦干（不需要洗涤）5、一抗孵育1）、用抗体稀释液稀释一抗，实现抗体制造商介绍的浓度2）、将稀释的抗体（介绍浓度：0.4μg至2μg）加到爬片上，4°C孵育过夜3）、用PBS洗涤3次，每次15分钟6、二抗孵育1）、用抗体稀释液稀释生物素化的二抗2）、将稀释的抗体加到爬片上，37°C孵育30分钟3）、用PBS洗涤3次，每次8分钟7、染色1）、爬片上滴加稀释好的SABC—FITC或SABC—Cy3试剂2）、37°C孵育30分钟（避光）3）、用PBS洗涤2次4）、滴加DAPI染液，避光孵育10min5）、用PBS洗涤3次6）、用抗荧光衰减封片剂封片，荧光显微镜下察看结果。
免疫荧光实验步骤大全
免疫荧光实验步骤大全免疫荧光实验是一种常见的实验技术，用于检测特定抗原和抗体的相互作用。
本文将介绍免疫荧光实验的详细步骤，以供参考。
实验材料准备：- 试验样本（包括细胞或组织）- 抗原或抗体- 包含荧光素的二抗- PBS缓冲液- 荧光显微镜- 封片胶实验步骤：1. 样本制备- 如果是细胞样本，在培养皿中培养并观察细胞的形态和生长状态。
- 如果是组织样本，将组织切片并进行固定，然后反复用PBS缓冲液进行洗涤。
2. 抗原或抗体的固定- 将样本固定在载玻片上，可以使用正硫酸盐和乙醇来进行固定。
- 固定后用PBS缓冲液进行洗涤，以去除多余的固定试剂。
3. 孵育抗原或抗体- 在固定后的样本上加入适量的抗原、抗体或荧光素标记的二抗。
- 在室温下或4摄氏度下孵育一定的时间，以实现抗原和抗体的特异结合。
4. 洗涤- 使用PBS缓冲液洗涤固定后的样本，可多次洗涤以去除非特异性结合。
5. 荧光显微镜观察- 将载玻片放置在荧光显微镜上，调整荧光滤镜组合以观察荧光信号。
- 使用合适的放大倍率观察细胞或组织中特定的抗原或抗体信号。
6. 影像采集与分析- 使用相机或图像采集系统记录荧光显微镜观察到的图像。
- 使用图像分析软件对图像进行处理和分析，如测量荧光强度、定量特定抗原或抗体的表达水平等。
7. 结果和讨论- 分析实验结果，比较不同样本之间的差异。
- 讨论实验结果与研究假设的一致性，并可进行进一步的实验验证。
8. 结论- 总结实验结果，并得出相应的结论。
- 可以进一步讨论实验结果在相关领域的应用和意义。
9. 实验清理- 定期清洗和消毒实验室工作区域和仪器设备，以确保实验环境的卫生和安全。
以上是免疫荧光实验的基本步骤，每一步都需要仔细操作和控制实验条件。
在实验过程中，要注意遵守实验室安全操作规范，确保自己和他人的安全。
希望本文对您的科研工作有所帮助！。
细胞免疫荧光标准操作流程
细胞免疫荧光细胞免疫荧光标准操作流程标准操作流程
20×20盖玻片清洗干净后，无水乙醇浸泡过夜，载玻片置于无水乙醇中浸泡，待用；
1. 爬片；目标细胞（如：转染24h 的细胞）胰酶消化后，用新鲜培养基吹打悬浮；取出盖玻片，酒精灯火焰灼烧至乙醇燃烧干净，盖玻片平放在6孔板内，接种细胞至六孔板，5%CO2培养箱37C 培养24h，细胞贴附在盖玻片上。
2. 收片；细胞贴附24h 后，去除培养基，加入预冷PBS 洗片，重复一次。
3. 固定；加入1ml 预冷的4%多聚甲醛，覆盖盖玻片，冰上孵育10-15min，PBS 洗片3次。
4. 透化；加入0.5ml 遇冷的0.5%Triton-100，冰上孵育5min ，PBS 洗片3次，吸尽表面液体。
5. 封闭；常温下，加入2ml 含10%FBS 的PBS ，孵育1h ，PBS 洗片1次。
6. 一抗孵育；稍晾干盖玻片，加入100ul 稀释好的一抗，室温孵育2h ，PBS 洗涤3次。
7. 二抗孵育；同上
8. 染核；加入0.5ml DAPI 工作液（1ug/ml ，PBS 稀释），覆盖盖玻片，室温孵育5min 。
9. 封片；PBS 洗片三次后，晾干，同时晾干载玻片后，滴上30ul 封片剂，盖上盖玻片，待观察。
Long Qi 2011-11-2。
免疫荧光(IF)实验操作步骤及详细说明
免疫荧光（IF）实验操作步骤及详细说明一、试剂和溶液10X PBS：80g NaCl，2g KCl, 14.4g Na2HPO4 和2.4g KH2PO4 加1L 纯水，调pH 至7.4 洗涤液：1× PBS：纯水稀释10X PBS；1× PBST：含0.05% Tween-20 的1×PBS 固定液：4%多聚甲醛：4g 多聚甲醛溶于100ml PBS 通透液：0.1% triton-100 封闭液：PBS 配制的3% BSA 抗体稀释液：一抗稀释液：3% BSA；二抗及鬼笔环肽稀释液：1X PBS；DAPI: 纯水稀释二、实验步骤1.细胞爬片：将盖玻片在酒精灯上灼烧片刻灭菌，铺在12 孔板中，然后接种细胞，置于37℃，5% CO2 培养箱过夜，待细胞形态完全伸展开并且处于健康状态，细胞密度为40%-50%（做爬片的细胞一般是复苏细胞传代2 代后的细胞）；2.洗涤：倒掉细胞培养液，1×PBS 轻微振荡洗涤2 次,每次5min；3.固定：4%多聚甲醛固定细胞，室温放置20min,倒掉多聚甲醛，加入适量PBS；4.冻存：-20℃保存（如果直接使用，可跳至7）；5.解冻：常温下放置30 min；6.洗涤：PBS 轻微振荡洗涤2 次,每次5min；7.通透：加入适当体积的通透液室温放置10min。
（若蛋白为膜表达则无需此步）8.洗涤：PBS 轻微振荡洗涤2 次,每次5min；9.封闭：加入适当体积的封闭液，室温放置30 min；10.一抗孵育：倒掉封闭液，加入适当体积及浓度的一抗，37℃孵育60min；11.洗涤：PBST 轻微振荡洗涤3 次,每次5min；12.二抗孵育：加入适当体积及稀释比的荧光二抗，37℃避光孵育50 min；（如果一抗是荧光素标记的则无需此步）；13.洗涤：PBST 轻微振荡洗涤3 次,每次5min；14.核染色：加入适当体积及稀释比的核染料DAPI 室温反应10min （如果无需加鬼笔环肽，可洗涤后跳至16）；15.洗涤：PBST 轻微振荡洗涤3 次,每次5min；16.细胞骨架染色：此步骤只针对有细胞核定位的项目；加入反应体积为0.2ml，适当稀释比的鬼笔环肽，避光37℃孵育60 min 或4℃孵育过夜；17.洗涤：PBST 轻微振荡洗涤2 次,每次5min，纯水轻微振荡洗涤5min；18.封片：取干净的载玻片，分别标记和编号，在载玻片上滴加适量防荧光猝灭封片剂，用镊子取出盖玻片，细胞面朝下，盖在载玻片上；19.荧光显微镜观察，记录结果。
免疫荧光实验的实验操作步骤及注意事项
免疫荧光1.免疫荧光所用玻片的处理(1) 玻片的规格：圆形18mm×18mm可放入12孔盘；(2) 处理方法：将玻片一片一片的放入1M的盐酸中，65度浸泡过夜，每一遍均要一片一片的清洗，第一遍用流动的自来水冲洗，，其余在盆里清洗，要洗5次以上，再用蒸馏水洗，同样的方法洗5次以上，再用超声，低功率，一小时。
完后再用蒸馏水洗5遍，洗完以后放入95%的乙醇中长期保存。
临用时，在酒精灯上过一下，使玻片上残余的乙醇燃烧，干燥后放入12孔板。
2. 铺板子如细胞难以贴壁（如293T）或需观察细胞骨架的相关指标，需用多聚赖氨酸处理玻片。
多聚赖氨酸1ml，置于37度孵箱30-60min，吸干液体，用DDW洗三遍，吸干液体，紫外照射5-10min，晾干。
实验前一天将含2-3×10^4细胞的单细胞悬液铺种在放有盖玻片的十二孔盘中一个孔中（要保证有单个细胞）。
每个条件做两个复孔，待细胞贴壁12~24h后，用于实验分析；3. 固定用PBS洗涤细胞3 次(注意免疫荧光所用的PBS，均为常温的)，吸干，4%的PFA 1ml/ 孔于室温固定10min ；4. 防淬灭吸出PFA ，注意不能使细胞干燥，用PBS 洗3 次，加入1ml 的50mM 氯化铵于室温孵育10min，吸出氯化铵，PBS 洗3 遍，2-3min/次；(此步可省略)5. 通透加入1ml 的0.1%Triton X-100，10min，吸出Triton，用PBS 洗3 次，2-3min/次；6. 封闭加入1ml 3%的BSA（PBS配）封闭，室温1h，可在摇床上晃动，吸出BSA ，用PBS 洗10min；7. 一抗一般稀释比例为1：200-1：500，将抗体（BSA配；双染各加20μl ，单染加40μl ）加到封口膜上，将盖玻片从十二孔盘中取出，吸干多余的水分，有细胞的一面接触抗体，室温>1h 或4°C 过夜（效果好），将玻片重新放回到十二孔板中，有细胞的一面朝上，用PBS 洗4 次，10min/次；8.二抗稀释比例一般为1：400（BSA配），操作同一抗，避光室温反应1h, 将玻片重新放回到用锡纸包裹的十二孔盘中，有细胞的一面朝上，PBS 洗3 次，10min/ 次；9. DAPI染细胞核一般浓度为1μg/ml，每个盖玻片需20ul ，操作同一抗，避光于室温反应10min，将玻片重新放回到用锡纸包裹的十二孔盘中，有细胞的一面朝上，PBS 洗3 次，10min/ 次；10.封片把封片剂（mowoil）滴在载玻片上，每片15μl，将有细胞的面朝下，勿有气泡。
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免疫荧光通用操作规程
冰冻切片的免疫荧光
1，动物组织直接OCT包埋，或灌流后的组织30%蔗糖溶液4℃过夜后，OCT包埋。
-20℃保存3月，-80℃长期保存。
请勿保存于液氮。
2，冰冻切片机切片至少10um，空气干燥2分钟后，-20℃储存
3，切片从-20取出后，在通风橱放10-30分钟以去除水汽，4%PFA 固定15分钟，或-20℃丙酮固定15分钟置通风橱2小时
4, 1XPBS清洗玻片，3X5min 从此请保持玻片湿润
5，有时，抗原修复3小时会得到更好的结果。
为此请：选用稳定的抗原修复方式（真空负压.微波修复.高压修复.隔水加热.电炉加热）…关注修复的温度，时间（抗原修复时在有效的温度范围内所持续的时间），抗原修复液必须遵循自然降温规律，使用足量的抗原修复液…选择不同PH值的修复液（A液枸盐酸缓冲液PH6.0，B液EDTA-Na缓冲液PH8.0，C液枸盐酸缓冲液PH4.5）
6，室温封闭1小时
封闭液：5%BSA+10%二抗种属来源的正常血清in 1xPBS
条件封闭液：1%BSA+3%二抗种属来源的正常血清in 1xPBS（细胞因子，无需封闭的蛋白
7，一抗4℃过夜
请用封闭液稀释一抗
8, 第二天Wash,1XPBS, 2x1min
9,二抗，1:1000 （alexa系列）1:300（dyelight )in封闭液，避光室温1小时
10, Wash,1XPBS, 3x5min
11, DAPI 染核5min，
12，DDW Rinse
13，抗淬灭剂封片，（避免气泡）避光置于通风橱过夜
14，干片后4℃保存
石蜡切片的免疫荧光
1，动物组织取出后经固定-脱水-包埋（见随后操作步骤)，制成石蜡包块
2，组织学染色切片厚度2um，免疫荧光染色切片厚度至少6um，切片复水：58℃20min-
xylene 2x10min-
100%EtoH2x10min
95%EtoH2x10min-
70%EtoH10min-，DDW5min
4, Rinse 玻片1xPBS, 从此请保持玻片湿润
5，抗原修复过夜。
为此请：选用稳定的抗原修复方式（真空负压.微波修复.高压修复.隔水加热.电炉加热）…关注修复的温度，时间（抗原修复时在有效的温度范围内所持续的时间），抗原修复液必须遵循自然降温规律，使用足量的抗原修复液…选择不同PH值的修复液（A液枸盐酸缓冲液PH6.0，B液EDTA-Na缓冲液PH8.0，C液枸盐酸缓冲液PH4.5）
6，室温封闭1小时
封闭液：5%BSA+10%二抗种属来源的正常血清in 1xPBS
条件封闭液：1%BSA+3%二抗种属来源的正常血清in 1xPBS（细胞因子，无需封闭的蛋白
7，一抗4℃过夜
请用封闭液稀释一抗，如果没有二抗种属来源的正常血清，细胞因子用1%BSA封闭，同时一定要有一个阴性对照。
8, 第二天Wash,1XPBS, 2x1min
9,二抗，1:1000 （alexa系列）1:300（Dyelight )in封闭液，避光室温1小时
10, Wash,1XPBS, 3x5min
11, DDW Rinse , DAPI 染核5min，
12，DDW Rinse
13，抗淬灭剂封片，（避免气泡）避光置于通风橱过夜
14，干片后4℃保存
备注：多重荧光染色原则
A:尽量选择不同种属来源的一抗：可同时染
B:如果种属来源相同的一抗：可顺次染色，
抗原修复: O/N
第一个一抗：4℃O/N , 第二天对应二抗@RT 1hr 红光
短暂地封闭
第二个一抗：@RT 2hr，对应二抗@RT 1hr 绿光
：
DAPI
封片
备注：对照实验
A:阴性对照：组织免疫荧光必做
相同标本：只加荧光二抗:排除非特异性染色
不同样本：采用确定不含一抗对应抗原的标本验证荧光信号的特异性B：阳性对照：采用确定含有一抗对应抗原的标本
TUNEL与免疫荧光共染时
细胞的免疫荧光
1，细胞生长贴壁到80%融合，倒掉细胞培养液
2，Rinse，用固定剂rinse一到两次
3，首选4%多聚甲醛固定15min ，0.2%TritonX-100 打孔5-10min；或者选用不同的固定方式：
甲醇（分析纯or HPLC)-20℃10min
丙酮（HPLC）-20℃10min
4%多聚甲醛+0.2%TritonX-100 10min
4%多聚甲醛+0.2%Saponins10min 细胞核核膜
4%多聚甲醛15min + -20℃甲醇5min 细胞膜
4%多聚甲醛15min + -20℃丙酮5min 细胞骨架/微管蛋白
4%多聚甲醛10min @RT+4 ℃10min+ -20℃甲醇1min 细胞膜+胞浆蛋白+细胞核
4, Wash,1xPBS,2x1min 从此请保持细胞湿润
5, 室温封闭1小时
封闭液：5%BSA+10%二抗种属来源的正常血清in 1xPBS
条件封闭液：1%BSA+3%二抗种属来源的正常血清in 1xPBS 6，一抗4℃过夜
请用封闭液稀释一抗
7, 第二天Wash,1XPBS, 2x1min
8,二抗，1:1000 （alexa系列）1:300（Dyelight )in封闭液，避光室温1小时
9, Wash,1XPBS, 3x5min, DDW Rinse
10, DAPI 染核5min，
11，DDW Rinse
12，抗淬灭剂封片，（避免气泡）避光置于通风橱过夜
13，干片后4℃保存。