Negative staining 阴性(负)染色法
负染色法负染色法negativestaining的染色处理过程主要并非针对菌
2.湿墨水法
（1）制菌液：加1滴墨水于洁净的载玻片上，挑少量菌体与其充分混合均匀。
（2）加盖玻片 放一清洁盖玻片于混合液上，然后在盖玻片上放一张滤纸，向下轻压，吸去多余的菌液。
（3）镜检：先用低倍镜、再用高倍镜观察。
结果：背景灰色，菌体较暗，在其周围呈现一明亮的透明圈即为荚膜。
结果：背景蓝紫色，菌体紫色，荚膜无色或浅紫色。
（五）实验作业：
绘出Bacillusmucilaginosus的形态图，并注明各部位的名称
（六）注意事项
1.加盖玻片时不可有气泡，否则会影响观察。
2.应用干墨水法时，涂片要放在火焰较高处并用文火干燥，不可使玻片发热。
3.在采用Tyler法染色时，标本经染色后不可用水洗，必须用20%CuSO4冲洗。
以油镜观察之。
（一）实验目的：学习细菌的荚膜染色法：
（二）实验原理：由于荚膜与染料间的亲和力弱，不易着色，通常采用负染色法染荚膜，即设法使菌体和背景着色而荚膜不着色，从而使荚膜在菌体周围呈一透明圈。由于荚膜的含水量在90%以上，故染色时一般不加热固定，以免荚膜皱缩变形。
（三）实验器材
1.活材料：培养3-5天的胶质芽胞杆菌（Bacillusmucilaginosus，俗称“钾细菌”）。该菌在甘露醇作碳源的培养基上生长时，荚膜丰厚。
最早由S.Brenner和R.Horne，（1959）用于病毒粒子的观察，以后利用此法很快地积累了病毒、细菌以及分层蛋白质的微细结构等方面的知识。
负染色法需要使用酸性染料来染色，如伊红或苯胺黑。因为细菌体表面带负电，而酸性染料的色原也带负电，所以色原只能将背景染色。没有染色的细胞在染色背景下就能很容易的观察到。在负染色法中，标本不需要热固定，细胞不会因为化学药物的影响而变形，对于不易染色的细菌或病毒也能观察。
磷钨酸负染色液(2%)
北京雷根生物技术有限公司
磷钨酸负染色液(2%)
简介：
负染色又称阴性染色，是由Hall 发现的相对于普通染色(即正染色)而言的染色技术。
其原理在于利用重金属盐包绕低电子密度的样品，增强样本四周的电子密度，造成细微结构之间的＂质量－厚度”差异，增强散射吸收反差磷钨酸负染色液(2%)适用于显示大分子、细菌、病毒、原生动物、噬菌体、细胞器、核酸大分子、蛋白质晶体及其他大分子材料等。
染色后的样品图像呈现透明的亮光，而背景图像呈黑色。
组成：
操作步骤(仅供参考)：
(一)滴染法
1、样品低速离心或采用其他方法浓缩样品，制成悬浮液并且使其达到一定浓度和纯度。
2、将样品悬浮液直接滴于带有支持膜的载网上静。
3、用滤纸条从液滴边缘吸去多余液体，稍干燥。
1、 滴加负染色液静置。
5、吸去多余染色液，自然干燥，进行显微镜观察。
(二)漂浮法
1、样品低速离心或采用其他方法浓缩样品，制成悬浮液并且使其达到一定浓度和纯度。
2、将带有支持膜的载网置于样品液滴上漂浮以沾取样品。
3、载网置于负染色液上漂浮。
4、吸去多余染色液，自然干燥，进行显微镜观察。
染色结果：
注意事项： 1、 目的样本尽量新鲜。
2、 样品应为均匀的悬浮液，其纯度和浓度应适宜，否则无法与染色剂之间产生特异和清晰
的结合反应。
编号 名称 DZ0035 Storage 磷钨酸负染色液(2%) 100ml RT
使用说明书 1份 样品 透明的亮光 背景 黑色。
负染色操作步骤-概述说明以及解释
负染色操作步骤-概述说明以及解释1. 引言概述部分的内容可以按如下方式编写：1.1 概述负染色是一种常用的细胞和组织样品处理技术，它常被应用于生物学和医学研究中，用于观察细胞和组织内部的结构和特征。
相比于传统的正染色方法，负染色操作具有一些独特的优势和特点。
在负染色过程中，样本被浸泡在一种特定的染料溶液中，这种染料溶液往往是一种与样品的成分不相溶的物质。
负染色的关键在于利用染料的物理和化学性质，使其与样品发生作用，从而使样品的细节和特征得以显示。
负染色的操作步骤相对简单，但需要一定的技巧和经验。
本文将详细介绍负染色的操作步骤要点，旨在帮助读者快速掌握负染色技术并正确应用于实验中。
负染色的具体步骤将在接下来的章节中进行介绍，主要包括：样品制备、染料选择、染色操作、观察和分析等环节。
通过正确的操作步骤，可以获得清晰、可靠的负染色结果，从而进一步推进相关研究领域的发展。
总之，负染色作为一种常用的细胞和组织样品处理技术，具有独特的优势和特点。
本文将深入介绍负染色的操作步骤要点，希望能够为读者提供一份实用的参考，帮助其在实验中正确应用负染色技术。
文章结构部分的内容应该是关于整篇文章的组织结构和章节安排的介绍。
可以按照以下方式编写：文章结构：本文将按照以下结构进行叙述：1. 引言1.1 概述1.2 文章结构1.3 目的2. 正文2.1 负染色操作步骤要点12.2 负染色操作步骤要点23. 结论3.1 总结3.2 展望在引言部分，我们将简要说明本文的主题和目的，以及为什么负染色操作步骤的了解对于某些特定应用领域的重要性。
接下来的正文部分将分为两个要点，分别介绍负染色操作的具体步骤，包括所需材料、实验条件等重要信息。
通过对每个步骤要点的详细描述，读者将能够理解负染色操作的基本原理和实施方法。
最后，在结论部分，我们将对整篇文章进行总结，回顾负染色操作的关键步骤和要点，并展望未来在该领域的进一步研究和应用方向。
通过以上的文章结构安排，读者将能够清晰地了解整篇文章的内容组织和章节间的逻辑关系，从而更好地理解和掌握负染色操作步骤的相关知识。
微生物名词(全)
1．菌落(co1ony)：单个微生物细胞在适宜的固体培养基表面或内部生长、繁殖到—定程度形成的肉眼可见的、有一定形态结构的子细胞生长群体。
2．菌苔(lawn)：固体培养基表面众多菌落连成一片时所形成的微生物生长群体。
3．平皿(Petri dish)：由玻璃或透明塑料制成的圆形皿底和皿盖组成，皿盖可覆盖于皿底之上，防止空气中微生物的污染。
其英文名称是为纪念其发明者Richard Petri。
4．纯培养物(pure culture)：由一种微生物组成的细胞群体，通常是由一个单细胞生长、繁殖所形成。
5．培养基(culturemedium)：供微生物生长、繁殖的营养基质，根据其中固化剂含量的不同可分为固体、半固体、液体3种。
6．无菌技术(aseptic technique) 在分离、转接及培养纯种微生物时，防止其被环境中微生物污染或其自身污染环境的技术。
7．培养平板(cultureplate) 常简称为平板，指固体培养基倒人无菌平皿，冷却凝固后所形成的培养基平面。
8．稀释倒平板法(pour plate method) 将待分离的材料稀释后与已熔化并冷却至50℃左右的琼脂培养基混合，摇匀后制成可能含菌的培养平板，保温培养后分离得到的微生物菌落生长在固体培养基表面和里面。
9．涂布平板法(spread plate method) 在培养平板表面均匀涂布经过稀释的微生物悬液后，保温培养，在固体培养基表面得到生长分离的微生物菌落。
10．平板划线法(streakplatemethod) 用接种环在培养平板表面划线接种微生物，使微生物细胞数量随着划线次数的增加而减少，并逐步分开。
保温培养后，在固体培养基表面得到生长分离的微生物菌落。
11．稀释摇管法(dilutionshakeculturemethod) 将待分离的材料稀释后与已熔化并冷却至50~C左右的琼脂培养基混合，摇匀后用石蜡封盖，保温培养后分离得到的微生物菌落生长在琼脂柱中间。
微生物学名词解释集锦沈萍版
微生物习题集第一章绪论一、术语或名词1．微生物(microorganism)因太小，一般用肉眼看不清楚的生物。
这些微小生物包括：无细胞结构不能独立生活的病毒、亚病毒(类病毒、拟病毒、朊病毒)；具原核细胞结构的真细菌、古生菌以及具真核细胞结构的真菌(酵母、霉菌、蕈菌等)、单细胞藻类、原生动物等。
但其中也有少数成员是肉眼可见的。
2．微生物学(microbiology)研究肉眼难以看清的称之为微生物的生命活动的科学，分离和培养这些微小生物需要特殊技术。
3．分子微生物学(molecular microbiology)在分子水平上研究微生物生命活动规律的科学。
4．细胞微生物学(cellular microbiology)重点研究微生物与寄主细胞相互关系的科学。
5．微生物基因组学(microbic genomics)研究微生物基因组的分子结构、信息含量及其编码的基因产物的科学。
6．自生说(spontaneous generation)一个古老的学说，认为一切生命有机体能够从无生命的物质自然发生的。
7．安东·列文虎克(AntonyvanLeeuwenhoek，1632—1723)荷兰商人，他是真正看见并描述微生物的第一人，他利用自制放大倍数为50～300倍的显微镜发现了微生物世界(当时被称之为微小动物)，首次揭示了一个崭新的生物世界——微生物界。
8．路易斯·巴斯德(Louis Pasteur，1822—1895)法国人，原为化学家，后来转向微生物学研究领域，为微生物学的建立和发展做出了卓越的贡献，成为微生物学的奠基人。
主要贡献：用曲颈瓶实验彻底否定了“自生说”，从此建立了病原学说，推动了微生物学的发展；研究了鸡霍乱，发现将病原菌减毒可诱发免疫性，以预防鸡霍乱病；其后他又研究了牛、羊炭疽病和狂犬病，并首次制成狂犬疫苗，证实其免疫学说，为人类防病、治病做出了重大贡献；分离到了许多引起发酵的微生物，并证实酒精发酵是由酵母菌引起的，也发现乳酸发酵、醋酸发酵和丁酸发酵都是不同细菌所引起的，为进一步研究微生物的生理生化和工业微生物学奠定了基础。
革兰氏染色实验
革兰氏染色实验革兰氏染色（Gram Staining）是用来鉴别细菌的一种方法：这种染色法利用细菌细胞壁上的生物化学性质不同，可将细菌分成两类，即革兰氏阳性（Gram Positive）与革兰氏阴性（Gram Negative）。
(这种染色法是由一位丹麦医生汉斯·克里斯蒂安·革兰于1884年所发明)。
未经染色之细菌，由于其与周围环境折光率差别甚小，故在显微镜下极难观察。
染色后细菌与环境形成鲜明对比，可以清楚地观察到细菌的形态、排列及某些结构特征，而用以分类鉴定。
阳性紫色，阴性红色革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌：革兰氏阳性菌：葡萄球菌属（主要是金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌等）、链球菌属（肺炎链球菌、草绿色链球菌、肠球菌等）、白喉杆菌、炭疽杆菌、破伤风杆菌、蜡样芽孢杆菌等，其中，金黄色葡萄球菌、肠球菌等为临床重要的病原菌。
革兰氏阴性菌：埃希氏菌属、枸橼酸菌属、假单胞菌属（绿脓杆菌等）、莫拉菌属（卡他莫拉菌等）、奈瑟菌属（淋球菌、脑膜炎双球菌等）、不动杆菌属（鲍曼不动杆菌、罗菲不动杆菌等）、克雷伯菌属（主要是肺炎克雷伯杆菌）、沙门氏菌属、志贺氏菌属（痢疾杆菌等）、黄杆菌属、变形杆菌属、军团菌属、耶尔森菌属、嗜血杆菌属（杜克雷嗜血杆菌、流感嗜血杆菌等）、产气杆菌属、霍乱弧菌、阴沟肠杆菌等。
革兰氏阴性菌在院内感染中的细菌感染中占了大约65%，且大多菌株容易对抗菌药物耐药，产生“新德里金属酶”（NDM-1）的绝大多数细菌都是革兰氏阴性菌（主要是大肠杆菌、鲍曼不动杆菌和肺炎克雷伯杆菌）。
革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌是利用革兰氏染色法来鉴别的两大类细菌。
大多数化脓性球菌都属于革兰氏阳性菌，它们能产生外毒素使人致病，而大多数肠道菌多属于革兰氏阴性菌，它们产生内毒素，靠内毒素使人致病。
细胞形态和结构细胞的基本结构包括细胞壁和原生质体两部分。
原生质体位于细胞壁内，包括细胞膜（细胞质膜）、细胞质、核质和内含物。
负染色技术1
异常反差原理： 异常反差原理：
用PTA 对氧化鎂晶体染色时，发现氧化鎂晶体发生 对氧化鎂晶体染色时，发现氧化鎂 了异常反差。在电镜下观察时发现， 了异常反差。在电镜下观察时发现，在同一视野内凡 包绕着的氧化鎂晶体全部变为透明（白色） 是被 PTA 包绕着的氧化鎂晶体全部变为透明（白色） 的晶体， 染色的氧化鎂 的晶体，未被 PTA 染色的氧化鎂晶体则呈现不透明 暗黑色）晶体。这种异常反差可能是因PTA PTA在电 的（暗黑色）晶体。这种异常反差可能是因PTA在电 子束照射下，负荷电子在标本周围形成了静电场， 子束照射下，负荷电子在标本周围形成了静电场，它 起到一个“静电小透镜”的作用， 起到一个“静电小透镜”的作用，把电子聚焦于样品 使样品中的电流密度得到加强， 上，使样品中的电流密度得到加强，结果样品图象的 亮度加强，使不透明的氧化鎂晶体变成透明了。 亮度加强，使不透明的氧化鎂晶体变成透明了。
(五).注意的问题 五 注意的问题
1).悬液样品的纯度 悬液样品的纯度 2).悬液样品的浓度 悬液样品的浓度 3).样品和染液的均匀分布问题 样品和染液的均匀分布问题 • 使用分散剂 • 亲水性处理 4).样品悬液和染色液的酸碱度问题 样品悬液和染色液的酸碱度问题 5).染色的时机 染色的时机
负染色剂及其适用的PH范围
负染色剂 磷钨酸钾 醋酸铀 甲酸铀 钼酸铵 钨酸锂 硼酸钨钠 浓度 % 2 0.1~1 0.5~1 2.0~3 2 2 PH范围 PH范围 6.0—7.0 4.0—5.2 4.0—5.2 7.0—7.4 6.0—7.5 5.5—7.0 醋酸氨 醋酸氨
样品缓冲液
醋酸氨
•
负染色可观察样品的范围：um~nm 负染色可观察样品的范围 球状 7 nm 链状 直径 2 nm
超氧化物歧化酶活性正、负染色方法的比较
超氧化物歧化酶活性正、负染色方法的比较超氧化物歧化酶（SOD）是帮助人体抗衰老的最重要的一种内源性酶，它的活性直接反映了细胞的氧化应激状态。
在实验室研究中，研究人员常常使用染色方法研究SOD活性。
正负染色方法是目前最被广泛应用的SOD活性评价工具。
本文的主题是比较正负染色方法对SOD活性的测定效果。
一、正染色方法正染色方法是检测SOD活性最常用的方法，它可以还原多巴胺（MPO）以检测SOD活性。
该方法利用可能影响细胞性状的MPO所产生的单套抗原作为正染色技术，通常在聚脲凝胶上展示。
它是一种由单一细胞提供协助的染色法：其中MPO可能将过氧化物（如丙二醛）氧化为过氧化氢，进而破坏SOD的活性，也称为SOD检查试验。
二、负染色方法负染色方法检测的是细胞氧化应激状态，它与高通量技术结合在一起，采用某种氧化物来定量检测SOD活性。
氯硝基酚（PT）是一种常用的氧化剂，具有高抗氧化性，当它在酶活性环境中受到过氧化物的氧化作用时，它会发生质变，从而使其可以被检测。
它的变化可以用像素提供的可用结果来建立统计模型，从而评估细胞的SOD活性。
三、正负染色方法的比较正染色方法和负染色方法都可用于检测SOD活性，比较其异同如下：正染色方法是利用多巴胺（MPO）作为正染色因子，通常在聚脲凝胶上展示，能够清楚地反映出单个细胞之间SOD活性的差异，是SOD活性检测中更为常用的方法。
负染色方法则是利用氯硝基酚（PT）作为抑制染色因子，通过氧化剂的质量变化而可以检测到SOD的活性，这一方法本质上是一种高通量技术，可以在短时间内大量地同时开展实验，适合于大规模SOD活性检测。
总之，正负染色方法都可以应用于检测SOD活性，不同之处在于检测方法、抗氧化因子及所能反映出的细胞氧化应激差异等方面，可根据实验需要任意选择。
同时，研究者们还可以开发出新的技术和方法，更有效地测定SOD活性。
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• 實驗注意事項
– 進行細菌的染色時，樣本於玻片上之塗抹務求 均勻，以免影響染色的效果。 – 進行陰性染色法時，染色前皆必須先確定玻片 樣本呈現乾燥之狀態方可進行染色，否則易影 響實驗之最終結果。 – 進行陰性染色法時，染劑固定步驟不宜以熱固 定的方式進行，需以自然風乾的方法操作。
• 實驗結果
– 請畫出以陰性染色法觀察之菌體。
• 材料與儀器
– Bacteria
• 大腸桿菌(Escherichia coli) • 金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus) • 枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)
– Staining agent
• Nigrosine
– An acidic stain which can not be stained onto bacterial cell membrane which contain negative-charged particles.
• 染色：將製備完成之玻片樣本置於染色架上，加上一 滴染劑，在加上一滴水，以接種環於塗抹菌體於染色 液中，靜置約3~5分鐘，使菌體上色。 • 可用另一張載玻片，輕放在染液上，將其染液拉開。 • 於無菌操作台內風乾。
• 乾燥：將玻片上多餘的水分輕輕甩乾，並利用濾紙將 其吸乾，接著置於無菌操作台內使其自然風乾（此時 不進行火烤加熱風乾，而以自然風乾為主）後備用。 • 鏡檢：先以低倍數光學顯微鏡找出菌體，然後再逐步 換成高倍數接物鏡最終以油鏡進行菌體的觀察並繪圖 記錄之。
• 討論
– 比較不同菌種間的異同處
– 設備儀器及其他用具
• • • • • • • • • 光學顯微鏡 酒精燈 載玻片 接種環 蒸餾水 染色架 濾紙 75%酒精 乳頭滴管
• 步驟與方法
– 陰性染色法
– 陰性染色法
•以下4步驟：
– 玻片塗抹：取出已經消毒之載玻片，通過酒精燈上之火焰 以徹底滅菌。
Negative staining 陰性 (負)染色法
12th chapter P 73
• 目的
– 學習如何將微生物進行玻片塗抹製成樣本，並 藉由進行細菌的簡單染色法及陰性染色法之方 式，來觀察微生物之菌體形態，藉以了解微生 物染色之目的及原理。
• 原理
– 陰性染色法與簡單染色法相反，其原理為利用 帶有負電荷的酸性染料如墨汁及尼羅辛染劑進 行染色，由於菌體本身帶負電之關係，會與負 電荷的酸性染劑互相排斥，故菌體並不會染上 顏色，因此未經染色之細菌即可藉由染色後之 背景而顯現出來，藉此觀察其大小與型態，由 於此種染色之方法並非針對細菌菌體本身而是 針對其背景進行染色，故又稱為間接染色法。 – 常用的染色劑為印度墨水 (India ink)或苯胺黑 (Nigrosine)。 – Similar with capsule staining.