分解尿素的细菌的分离和计数
土壤中分解尿素的细菌的分离与计数实验方案
土壤中分解尿素的细菌的分离与计数实验方案尿素是一种含氮有机化合物，广泛用作化肥和动物饲料。
土壤中的细菌可以通过分解尿素来获取氮元素，从而促进土壤微生物群落的生长和发展。
为了研究土壤中分解尿素的微生物群落，可以进行以下实验：
1.采集土壤样品，将其通过蒸馏水过滤器过滤，以去除大颗粒物和悬浮物。
2.将过滤后的土壤样品接种到含有尿素的培养基中，利用不同的培养条件(如温度、pH值、氧气含量等)筛选出适宜于生长的细菌。
3.将筛选出的细菌进行单一克隆培养，然后通过染色、显微镜观察和生化测试等方法对其进行鉴定和分类。
4.最后，可以利用计数板等设备对土壤中分解尿素的细菌进行计数。
实验步骤：
1.收集土壤样品，通过蒸馏水过滤器过滤。
2.制备含尿素的培养基，分别设置不同的培养条件，如温度、pH 值、氧气含量等。
3.将过滤后的土壤样品接种到培养基中，进行培养。
4.观察培养基中是否有细菌生长，记录细菌的数量和形态特征。
5.对生长的细菌进行单一克隆培养，然后进行鉴定和分类。
6.利用计数板等设备对土壤中分解尿素的细菌进行计数。
实验注意事项：
1.在实验过程中要注意卫生，避免污染。
2.制备培养基时要严格按照配方和操作步骤进行。
3.培养时要控制好温度、pH值、氧气含量等条件，以便筛选出适宜于生长的细菌。
4.鉴定和分类时要准确和细致，避免误判。
5.计数时要进行多次重复，以提高结果的精度和可靠性。
实验03土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
专题03土壤中分解尿素的细菌的分离与计数一、实验原理：（1）土壤中的细菌之所以能分解尿素是因为它们能合成尿酶。
（2）配置以尿素为唯一氮源的培养基，能够在这个培养基上生长的细菌就是能分解尿素的细菌。
二、操作步骤：(1)土壤取样①土壤要求：酸碱度接近中性且潮湿。
②取样部位：距地表约3～8 cm的土壤层。
(2)样品的稀释测定土壤中细菌的数量，一般选用1×104、1×105和1×106倍稀释的稀释液进行平板培养，当第一次做这个实验时可以将稀释的范围放宽一点。
(3)微生物的培养与观察①培养：根据不同微生物的需要，控制适宜的培养温度和培养时间。
细菌一般在30～37 ℃的温度下培养1～2 d。
②观察a．观察方法：每隔24 h统计一次菌落数目，选取菌落数目稳定时的记录作为结果。
b．记录菌落的特征：包括菌落的形状、大小和颜色等。
2、灭菌培养基：高压蒸汽灭菌法3、培养皿灭菌：干热灭菌法三、操作提示(1)无菌操作①取土样的用具在使用前都需要灭菌。
②实验操作均应在酒精灯火焰旁进行。
(2)做好标记：本实验使用的平板和试管较多，为避免混淆，最好在使用前做好标记。
例如，在标记培养皿时应该注明组别、培养日期和平板上培养样品的稀释度等。
(3)制定计划：对于耗时较长的生物实验，需要事先规划时间，以便提高实验效率，在操作时有条不紊。
土壤中分解尿素的细菌的分离与计数操作中需注意的问题(1)为了保证结果准确，一般选择菌落数在30～300的平板进行计数。
(2)恰当的稀释度是成功统计菌落数目的关键。
(3)为增强实验说服力与准确性，设计实验时，需要涂布至少三个平板作为重复组，目的是排除实验中偶然因素对实验结果的影响。
(4)分析实验结果时，要考虑重复组结果是否接近，如果相差太大，意味着操作有误，需重新实验。
(5)为防止培养时间不足导致菌落遗漏，在菌落计数时，每隔24 h统计一次菌落数目，选取菌落数目稳定时的记录作为结果。
土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
耐高温的酶
寻找
寻找 耐高温生物体 耐高温环境（热泉等）
小结：从自然界筛选目的菌株的原则：
根据微生物对生存环境的要求，到相应的环境中去寻找。
耐盐微生物
盐碱地等高盐的环境
冰川
耐寒微生物
分解石油的细菌
油田
2、 实验室中微生物的筛选 筛选原则：人为提供有利于目的菌株生长的条件(包括营 养、温度、pH等)，同时抑制或阻止其他微生物生长。
（二）制备培养基
制备选择培养基（尿素为唯一氮源） 制备牛肉膏蛋白胨培养基 思考：为什么要制备牛肉膏蛋白胨培养基？ （对照作用）
相同的菌液，在牛肉膏蛋白胨培养基上生长的菌落数目应 明显多于选择培养基上的数目，因此，牛肉膏蛋白胨培养基 可以作为对照，用来判断选择培养基是否起到了选择作用。
（三）稀释涂布平板
（1）测土壤中细菌数： 一般用104、105、106稀释液
（2）测放线菌： 一般用103、104、105稀释液 （3）测真菌数： 一般用102、103、104稀释液 以保证获得菌落数在30-300之间。
思考：（P24页左侧）
原因：不同微生物在土壤中含量不同
（三）稀释涂布平板
每个稀释度均用3个选择培养基和1个牛肉膏蛋白胨培养基 为保证计算结果准确 ①选择菌落数在30～300的平板上计数。 ②每个稀释度取3个或以上平板做重复组，其平均值。
三、设置对照 （三）设置对照：
（1）设置对照的目的： 是排除实验组中非测试因素对实 验结果的影响，提高实验结果的可信度。 （2）对照实验： 指除了被测试的条件外，其他条件都相同的实验。
请你通过设置对照实验，（P23页），帮助A同学排除上述两个可 能影响实验结果的因素。 可能原因 设置对照 实验结论 其他同学用与A同学 如结果与A同学一致，则证明 土样不同 相同土样进行实验 A无误；反之，则证明A同学 失误 若有菌落出现，则培养基被污染 培 养 基 污 染 或 将A同学的培养基不接种， 培 养 中 混 入 了 进行培养，作为空白对 若无菌落出现，则没污染 照 若菌落数和A同学一致，说明培养基 其他的含氮物 中混入了其他含氮物质，若菌落数 其他同学用A同学的培养 质) 与其他同学一致说明培养基中没有
土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
基础知பைடு நூலகம்：
（一）筛选菌株
KH2PO4
1.4g
NaH2PO4
2.1g
MgSO4`7H2O 葡萄糖
0.2g 10.0g
尿素 琼脂
选择培养基
1.0g 15.0g
培养基配方
思 考：该培养基对微生物具有选择作用吗？如果 具有，是如何进行选择的？
只有能够以尿素作为氮源的微生物才能在该培养基上生长
选择培养基：在微生物学中，将允许特定种
• 2.提示：反刍动物的瘤胃中含有大量的微生 物，其中也包括分解尿素的微生物。由于 瘤胃中的微生物多为厌氧菌，接触空气后 会死亡，因此分离其中能分解尿素的微生 物除了需要准备选择培养基外，还应参照 厌氧菌的培养方法进行实验设计。
分析P22实例:
你认为哪个同学的结果更接近真实值？你认 为这两位同学的实验需要改进吗？如果需要，如 何改进？
第一位同学没有重复实验(至少涂布3个平板)，结 果不具有说服力。
第二位同学有重复实验，但结果不一致（误差较 大），说明在操作过程中可能出现错误，需要重 新实验。
【例1】为了计数微生物的数量，一位同学在4
1、酚红培养基： 鉴定分解尿素的细菌。 原理：脲酶催化尿素分解成氨→培养基碱性增
强，PH升高→酚红指示剂，变红 2、伊红—美蓝培养基： 鉴定大肠杆菌。 原理：代谢产物与伊红-美蓝结合→菌落呈黑
色。
大肠杆菌在伊红美蓝琼脂(EMB)上典型特征
大肠杆菌呈黑色中心 ,有或无金属光泽
本课题知识小结:
课后练习
——利用血球计数板在显微镜下直接计数。
（2）活菌计数法——统计菌落数目
方法： 稀释涂布平板法。 原理：
当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长 的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。
土壤中分解尿素的细菌的分离和计数
专题2 微生物的培养与应用课题2 土壤中分解尿素的细菌的分离和计数课题背景尿素是一种重要的农业氮肥。
但是，尿素不能直接被农作物吸收，只有当土壤中的细菌将尿素分解成之后，才能被植物吸收。
细菌为什么能分解尿素？怎样分解的？（写出化学反应式）一、基础知识（一）筛选菌株1、实验室微生物的筛选原理是什么？2、培养基（1）分析右边的培养基配方，回答：○1在该培养基的配方中，为微生物的生长提供碳源和氮源的分别是什么物质？○2分析该培养基的配方，想一想这种培养基对微生物是否有选择作用？如果具有，是如何进行选择的？（2）在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他微生物生长的培养基，称作。
（二）统计菌落数目测定微生物数目的常用方法：、1、显微镜直接计数法：（1）原理?利用特定细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下计算一定容积的样品中微生物的数量。
（2）显微镜直接计数法的缺点是什么？2、稀释涂布平板法（活菌计数法）（1）为什么通过测平板上的菌落数可以推测样品中的活菌数？（2）如何根据平板上的菌落数推测出每克样品中的菌株数？【例题】某同学在稀释倍数为106的培养基上测得平板上的菌落数的平均值为234，那么每毫升样品中菌落数是（涂布平板时所用稀释液的体积为0.1ml）（）A. 2.34X108B. 2.34X109C. 234D.23.4（3）统计的菌落数往往比活菌的实际数目高还是低？为什么？特别注意：统计结果一般用菌落数而不是活菌数来表示。
【实例分析1】两位同学用稀释涂布平板法测定同一土壤样品中的细菌数。
在对应稀释倍数为106的培养基中，得到以下两种统计结果。
1.第一位同学在该浓度下涂布了一个平板，统计的菌落数为230。
2.第二位同学在该浓度下涂布了三个平板。
统计的菌落数分别为21、212和256.该网学以这三个平板上菌落数的平均值163作为统计结果你认为哪位同学的结果接近真实值?你认为这两位同学的实验需要改进吗?如果需要，如何改进?【实例分析2】在做本课题的实验时，A同学从对应106倍稀释的培养基中筛选出大约150个菌落。
高中土壤中分解尿素的细菌的分离与计数及答案教案
高中土壤中分解尿素的细菌的分离与计数及答案教案YUKI was compiled on the morning of December 16, 2020课题2 土壤中分解尿素的细菌的分离与计数要点展示1．研究培养基对微生物的选择作用，进行微生物数量的测定。
2．能利用选择培养基分离细菌，运用相关技术解决生产生活中有关微生物的计数。
要点突破一、理论基础1．筛选菌株(1)实验室中微生物筛选的原理：人为提供有利于生长的条件(包括营养、温度、pH等)，同时或其他微生物生长。
(2)选择培养基：在微生物学中，将允许种类的微生物生长，同时和其他种类微生物生长的培养基，称作选择培养基。
（3）配制选择培养基的依据根据选择培养的菌种的生理代谢特点加入某种物质以达到选择的目的。
例如，培养基中不加入有机物可以选择培养微生物；培养基中不加入氮元素，可以选择培养；的微生物.加入高浓度的食盐可选择培养金黄色葡萄球菌等。
2．统计菌落数目（1）测定微生物数量的常用方法有和。
（2）稀释涂布平板法统计样品中活菌的数目的原理当样品的足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个。
通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。
为了保证结果准确，一般选择菌落数在的平板进行计数。
此外，测定微生物数量的常用方法还有直接计数。
3．设置对照设置对照的主要目的是排除实验组中对实验结果的影响，提高实验结果的。
例如为了排除培养基是否被杂菌污染了，需以培养的培养基作为空白对照。
二、实验设计关于土壤中某样品细菌的分离与计数实验操作步骤如下：1．取样：从肥沃、湿润的土壤中取样。
应先 3 cm左右，再取样，将样品装入事先准备好的中。
2．制备：准备牛肉膏蛋白胨培养基和选择培养基将菌液稀释相同的倍数，在牛肉膏蛋白胨培养基上生长的菌落数目应明显选择培养基上的数目，因此，牛肉膏蛋白胨培养基可以作为，用来判断选择培养基是否起到了选择作用。
3．微生物的与观察将10g土样加入盛有90 mL无菌生理盐水的锥形瓶中(体积为250 mL)，充分摇匀，吸取上清液，转移至盛有的生理盐水的无菌大试管中，将土样以1、101、102……依次等比稀释至107稀释度，并按照由107～103稀释度的顺序分别吸取进行平板涂布操作。
2.2 土壤中分解尿素的细菌的分离和计数
（一）筛选菌株
3、选择培养基
根据微生物的特殊营养要求或其对某化学、物理因素的抗性不
同，配制的允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他
种类微生物生长的培养基。
本课题使用的选择培养基
物理特性：固体培养基 功能特性：选择培养基
例：用稀释涂布平板法测定同一土壤样品中的细菌数，在对应 稀释倍数为106的培养基中，得到以下几种统计结果，正确的是
(D )
A．涂布了一个平板，统计的菌落数是230
B．涂布了两个平板，统计的菌落数是215和261，取平均值238
C．涂布了三个平板，统计的菌落数分别是21、212和256，取平 均值163
【解析】稀释倍数为106，0.1 mL稀释液的菌落数的平均值为234，则每 毫升样品中菌落数就为234/0.1×106=2.34×109。
（二）统计菌落数目
2.间接计数法→活菌计数法
（1）原理：当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一 个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。
（2）常用Байду номын сангаас法：稀释涂布平板法。
葡萄糖
10.0g
不缺能乏分氮解源尿的素培，养缺基乏—氮—源分而离不固能氮生微长生物
尿素 琼脂
1.0g 15.0g
发在育无繁氧殖条，件而下受的到普抑通制培，养所基以—用—此分培离厌氧型将和上兼述性物质厌溶氧解型后微，用生蒸物馏水
养基就能够选择出分解尿素的微生物。
定容到1000mL。
例：下列能筛选出分解尿素的细菌的培养基是( A )
但A同学认为自己选用土壤样品不同导致结果不同，但是A同学没 有设计对照，拿不出让同学信服的证据。你能通过设置对照，帮助A同 学排除上述两个可能影响因素吗？
《土壤中分解尿素的细菌的分离与计数》教学反思
《土壤中分解尿素的细菌的分离与计数》教学反思引言：在本次实验课中，我们进行了土壤中分解尿素的细菌的分离与计数的实验。
通过分离土壤样品中的细菌，培养和计数，探究了土壤中细菌的多样性及其对尿素的降解能力。
在教学过程中遇到了许多困难和挑战，同时也获得了宝贵的经验和教训。
下面我将对本次实验课进行反思，总结教学中的收获和不足之处，并提出改进和完善的建议。
一、教学收获：1. 实践操作能力的培养通过本次实验，学生们不仅了解到细菌分离和计数的基本方法，还提高了实践操作能力。
在分离细菌和培养计数的过程中，学生们需要仔细观察、耐心操作，不断调整实验条件和方法，才能获得准确的结果。
这样的实践操作对学生们的动手能力和实验技能有着很好的锻炼作用。
2. 培养团队合作意识在本次实验中，学生们需要相互协作，共同完成分离和计数的工作。
通过小组之间的合作、帮助和交流，学生们深刻体会到了团队合作的重要性。
在实验过程中，学生们能够相互帮助、相互学习，形成了良好的团队合作氛围。
3. 提高科研素养本次实验的设计是基于科学研究的需求，学生们通过实际操作，探究土壤中分解尿素的细菌的多样性和降解能力。
通过实验，不仅锻炼了学生的科研思维和探究能力，还激发了学生对科学研究的兴趣，提高了他们的科研素养。
二、教学不足：1. 实验操作流程不够清晰在实验操作中，有些学生对细菌分离和计数的操作流程理解不够清晰，容易产生混淆或错误。
这可能是因为在实验前对操作流程说明不够详细，或者在实验中没有进行及时的指导和纠正。
所以，未来需要对实验操作流程进行更为详细和清晰的说明，确保学生能够正确理解并掌握实验操作的要领。
2. 实验设备材料准备不充分在实验过程中，有时由于实验设备和材料准备不充分，导致实验进度受到了一定的影响。
培养基配制和消毒的耗时较长，部分设备不够齐全等。
这些问题的存在导致了实验操作的不顺利，影响了实验效果。
今后需要提前做好实验设备和材料的准备工作，确保实验能够顺利进行。
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每克样品中的菌落数＝(C÷V)×M
其中，C代表某一稀释度下平板上生长的平 均菌落数，V代表涂布平板时所用的稀释液 的体积(ml)，M代表稀释倍数。
注意事项
①为了保证结果准确，一般选择菌落数在30— —300的平板上进行计数。
条件对照：给对照组施以部分实验因素，但不是所要研究的 处理因素。 自身对照：对照组和实验组都在同一研究对象上进行。 相互对照：不单设对照组，而是几个实验组相互对照。
A同学统计的菌落数为150个,而其他 同学统计的结果为50个.
A同学的结果与其他同学不同，可能的 解释有哪些呢?
一是由于土样不同；
二是由于培养基污染或操作失误。
◆如果得到了2个或2个以上菌落数目在30——300的平板， 则说明稀释操作比较成功，并能够进行菌落的计数，如 果同一稀释倍数的三个重复的菌落数相差较大，表明试 验不精确，需要重新实验。
㈤.微生物的培养与观察
培养不同微生物往往需要不同培养温度。 细菌：30～37℃培养1～2d 放线菌：25～28℃培养5～7d 霉菌：25～28℃的温度下培养3～4d。
/kg）是不同的。例如在干旱土壤中的上层样本 中：好氧及兼性厌氧细菌数约为2 185万，放线 菌数约为477万，霉菌数约为23.1万。
结论：为获得不同类型的微生物，就需要按不
同的稀释度进行分离，同时还应当有针对性地 提供选择培养的条件。
㈣.取样涂布
◆实验时要 对培养皿作 好标记。注 明培养基类 型、培养时 间、稀释度、 培养物等。
4、培养基选择分解尿素的微生物的原理
培养基的氮源为尿素，只有能合成脲酶的微生物 才能分解尿素，以尿素作为氮源。缺乏脲酶的微 生物由于不能分解尿素，缺乏氮源而不能生长发 育繁殖，而受到抑制，所以用此培养基就能够选 择出分解尿素的微生物。
选择培养基：在微生物学中，将允许
特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止 其他种类微生物生长的培养基。
芽孢杆菌、小球菌、假单胞杆菌、克氏杆菌、 棒状杆菌、梭状芽孢杆菌，某些真菌和放线菌 也能分解尿素。
4、课题目的 ①从土壤中分离出能够分解尿素的细菌 ②统计每克土壤样品中究竟含有多少这样的细菌
一.研究思路 ㈠.筛选菌株
㈡.统计菌落数目 ㈢.设置对照
㈠.筛选菌株
1、实例： DNA多聚酶链式反应是 一种在体外将少量DNA 大量复制的技术，此项 技术要求使用耐高温 （930C）的TaqDNA聚 合酶。 原因：因为热泉温度70～800C，淘汰了绝大 多数微生物只有Taq细菌被筛选出来。
[三]样品的稀释
◆应在火焰旁称取土壤10g。 ◆在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁进行
◆分离不同的微生物采用不同的稀释度 原因：不同微生物在土壤中含量不同 目的：保证获得菌落数在30～300之间、适于计数 的平板
为什么分离不同的微生物要采用不同的稀释度？
原因：土壤中各类微生物的数量（单位：株
3、土壤中分解尿素的细菌的分离与计数所需培养基：
KH2PO4 NaH2PO4 MgSO4`7H2O
葡萄糖
1.4g 2.1g 0.2g 10.0g
尿素
1.0g
琼脂
15.0g
①从物理性质看此培养基属于哪类？从功能上属
于哪类培养基？
固体培养基 选择培养基
②在此培养基中哪些作为碳源、氮源？
碳源：葡萄糖、尿素 氮源：尿素
㈡板，在显微镜下计算一定容积里 样品中微生物的数量。
缺点
不能区分死菌与活菌； 不适于对运动细菌的计数； 需要相对高的细菌浓度； 个体小的细菌在显微镜下难以观察；有时候 需要染色
2.间接计数法 （1）常用方法：稀释涂布平板法。
（2）原理：当样品的稀释度足够高时，培养基表
启示：寻找目的菌种时要根据它对生存环境的 要求，到相应的环境中去寻找。
2、实验室中微生物的筛选原理：
人为提供有利于目的菌株生长的条件(包括营 养、温度、pH等)，同时抑制或阻止其他微生 物生长。
要分离一种微生物，必须根据该微生物的特点，包 括营养、生理、生长条件等；配置合适的培养基 方法： ⑴抑制大多数微生物生长 ⑵造成有利于该菌生长的环境， 结果：培养一定时间后，该菌数量上升，再通过稀 释涂布平板法等方法对它进行纯化培养分离。
2.提示：选择每个平板上长有30—300个 菌落的稀释倍计算每克样品的菌数最合适。 同一稀释倍数的三个重复的菌落数不能相 差悬殊，如相差较大，表示实验不精确。
㈢.设置对照：
设置对照的主要目的是排除实验组中非测试因素 对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。
设置对照的方法：
空白对照：不给对照组任何处理因素。
方案一：由其他同学用与A同学相同土样进行实验 结果预测：如果结果与A同学一致，则证明A无误； 如果结果不同，则证明A同学存在操作失误或培养 基的配制有问题。
②为了减少误差可将同一稀释度涂布三个或三 个以上的平皿中，经涂布，培养计算出菌落平 均数。
③统计的菌落往往比活菌的实际数目低。
④涂布平板法所选择的稀释度很重要，一般以 三个稀释度中的第二个稀释度所出现的平均菌 落数在50个左右为最好。
微生物的培养与观察
三.结果分析与评价
1.通过对照实验，若培养物有杂菌污染， 菌落数偏高；若培养物混入其他氮源，则 菌落形态多样，菌落数偏高，难以选择出 分解尿素的微生物。
面生长的一个菌落，来源于样品稀释 液中的一个活菌，通过统计平板上的 菌落数，就能推测出样品中大约含有 多少活菌。
二.实验的具体操作
㈠.土壤取样
从肥沃、湿润的土壤中取样。先铲去表层 土3cm左右，再取样，将样品装入事先准备好的 信封中。 ◆取土样用的小铁铲和盛土样的的信封在使用 前都要灭菌。
㈡.制备培养基： 制备以尿素为唯一氮源的选择培养基。
题2土壤中分解尿素的细菌的分离和计
一、课题背景
1、尿素的利用
尿素是一种重要的农业氮肥。尿素不能直接被农 作物吸收。土壤中的细菌将尿素分解成氨之后才 能被植物利用。
2、细菌利用尿素的原因
土壤中的细菌分解尿素是因为它们能合成脲酶
脲酶
CO(NH2)2 +H2O
NH3 + CO2
3、常见的分解尿素的微生物