蛋白质电泳分离.

负极上，膜条与滤纸必须贴紧，平衡5分钟
后通电。调节电压至90-120V左右，电流强
度为0.4—0.6mA/cm，电泳时间40min-1h。
5.染色：电泳完毕后将膜条取下并放在染色
液中浸泡2-5分钟。
6.漂洗：将膜条从染色液中取出后移置到漂
洗液中漂洗3-4次至无蛋白区底色脱净为止，
可得到色带清晰的电泳图谱。
α α β γ
1-球蛋白
2-球蛋白
-球蛋白 -球蛋白
急慢性肾炎、肾病综合征、肾功能衰竭：白蛋白降低， α1、α2 和β球蛋白升高； 慢性活动性肝炎、肝硬化：白蛋白降低，β、γ球蛋白 升高； 急性炎症：α1、α2球蛋白升高； 慢性炎症：白蛋白降低、α2、γ球蛋白升高； 红斑狼疮、类风湿关节炎：白蛋白降低，γ球蛋白显著 升高； 多发性骨髓瘤：白蛋白降低，γ球蛋白升高，β 和γ 球蛋白区带之间出现“M”带。
醋酸纤维薄膜电泳法 分离血清蛋白质
4学时
一
通过实验使学生掌握电泳 的基本原理 掌握醋酸纤维素薄膜电泳法 分离血清蛋白的原理
一、 实验目的
二
三
熟悉薄膜电泳的基本操作
二、实验原理
1、电泳法
是指带电粒子在外电场的作用下，向 着与其电性相反的电极移动的现象。
如：不处于等电点的蛋白质分子带电荷。
R CH COOH NH2
3. 点样：把膜条从缓冲液中取出，夹在两层
粗滤纸内吸干多余的液体，然后铺在干净
的平皿盖上(粗糙面点样)，将毛细管在血
清中沾一下，封住上端，在载玻片的一端 均匀涂过，使样品连续、均匀、适量，把 载玻片在薄膜粗糙面上点样位置轻而温和 地印一下。
2cm
4.电泳：将薄膜粗糙面朝下，平行扣于电泳
槽支架的滤纸桥上，膜条点样的一端放在
OHH+ OHH+
R CH COOH NH3
+
R CH COONH3
+
R CH COONH2
pH<pI
阳离子
pH=pI
蛋白质的兼性离子
pH>pI
阴离子
2、电泳技术
是利用样品中各带电粒子在电场中的 迁移速度不同，从而对样品中分子进行分 离、鉴定、纯化和制备。
影响电泳迁移率的因素
外在因素 电场强度、 溶液的pH值、 溶液的离子强度、 电渗现象 内在因素 粒子所带净电 荷的量、大小 和形状


边流现象：点样板蘸取血清一边多一边少，导致区带
区带模糊：薄膜过湿，样品扩散迅速，导致样品分离
分离不清，出现边流现象。 不成区带。
锯齿状：薄膜用滤纸吸水过度（薄膜上出现白 斑）或未及时搭桥，导致薄膜过于干燥，使区带成
锯齿状。
区带倾斜：薄膜搭载滤纸上的位置歪斜，弯曲，
与电流方向不平行，或点样一边多一边少，区带容
五、实验结果与分析
预期结果
一般的染色后的薄膜上可显现清楚的五条 区带。从正极端起，依次为清蛋白、α1 球 蛋白、α2球蛋白、β球蛋白和γ球蛋白。


清蛋白
1
2


失败图谱的分析
拖尾状：点样量过多，被分离的血清蛋白不能分离成 有斑点：点样不均匀，不整齐，导致被分离的区带出 5条区带或产生拖尾。 现斑点。
4、血清蛋白的种类
血清中含有清蛋白、α-球蛋白、β-球蛋
白、γ-球蛋白和各种脂蛋白等。
pI 清蛋白 α1球蛋白 α 2球蛋白 β球蛋白 γ球蛋白 4.88 5.06 5.06 5.12 6.85-7.3 泳动度 (cm2/s.v) 5.9×10-5 5.14×10-5 4.1×10-5 2.8×10-5 1.0×10-5 分子量 (kD) 69 200 300 90-150 156-300
七、注意事项
1.保持薄膜清洁， 勿用手指接触薄膜表面，以免油污 或污物沾上，影响电泳结果。 2.加样时一定要呈直线、垂直、分布均匀，这样泳动 的区带整齐、不歪。
3.注意薄膜正负极不要搭反，注意簿膜的正反不要放反。 放的时候注意血样不要与滤纸接触了。 4.染色的同时也是蛋白质的固定，所以，不要将很多 蛋白条重叠在一起。
易泳斜。 区带重叠：在染色固定前，薄膜与薄膜之间重 叠，造成薄膜上还未固定的血清蛋白彼此粘连。 区带过密：电泳时电压，电流过小或时间不够，
造成区带未分离。
六、临床意义
血浆蛋白是血浆中最主要的固体成分，含量为 60～80g/L,大部分由肝脏合成。
正常值：
蛋白质
白蛋白
血浆中浓度
40～50g/L 2～4g/L 4～9g/L 6～11g/L 13～17g/L
3、电泳的分类
依据支持物的性质不同：
纸电泳、醋酸纤维素薄膜电泳、 琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳
醋酸纤维素薄膜电泳
醋酸纤维薄膜电泳是以醋酸纤维薄膜作 支持物的一种区带电泳技术。
该膜具有均一细密微孔结构，对分子移动阻
力小，作为区带电泳的支持物，它具有操作简便、 快速、样品需要量少，应用范围广等优点。不足 之处是分辨率比聚丙烯酰胺凝胶电泳低，薄膜厚 度小不适于做样品制备用。
PH8.6缓冲液中带负电荷
电泳后，将薄膜取出，经染色和漂 洗，薄膜上显示出五条区带，每条带 代表一种蛋白质。
结果示意图：
γ β α2 α1 清蛋白
三、实验器材与试剂 1.器材：
毛细管、培养皿、载玻片、 粗滤纸、镊子，烧杯，量筒，铅笔。
电泳仪、电泳槽、醋酸纤维素薄膜(2X8cm)、
2.试剂：
新鲜人血清（无溶血现象） PH8.6缓冲液：巴比妥1.66g、 巴比妥钠 12.76g、加水至1000ml，置4℃冰箱保存。 染色液：氨基黑10B 0.5g、 甲醇50ml、 冰醋 酸10ml、蒸馏水40ml，混匀溶解贮存。
漂洗液：95％乙醇45ml、冰醋酸5ml、蒸馏水 50ml、混匀。
五、实验过程
浸泡 电泳槽准备
点样
电泳 染色
脱色
1.浸泡：在薄膜粗糙面距一端2cm左右处
用铅笔轻轻划一条直线，表示点样位 置。将薄膜粗糙面向下，浸泡于PH8.6 的巴比妥缓冲液中至少十分钟，使之 完全浸泡透。
2. 电泳槽的准备 电泳槽有两个互相隔离的槽，各自装有 缓冲液，接不同的电极，红色为正极，黑 色为负极。每个槽上都有一根可移动的横 杆，滤纸的一头搭在横杆上，另一头浸入 缓冲液中，形成了滤纸桥。两杆之间的距 离调节到略小于醋酸纤维薄膜的长度，点 好样的醋酸纤维薄膜就搭在滤纸桥上。
5.通电完毕时，必须切断电源，以防触电事故。
八、思考题？