番茄灰霉病内生拮抗菌的筛选及抑菌物质研究
番茄灰霉病菌抗药性及抗药性控制研究的开题报告
番茄灰霉病菌抗药性及抗药性控制研究的开题报告题目：番茄灰霉病菌抗药性及抗药性控制研究一、研究背景和意义番茄灰霉病是一种广泛分布的病害，能够在番茄等多种植物上引起严重危害。
目前，化学防治是控制番茄灰霉病的主要方法。
然而，由于长期使用同一种或同一类杀菌剂，导致灰霉病菌产生抗药性，致使防治效果下降，增加了防治的难度。
因此，为了有效控制番茄灰霉病，研究番茄灰霉病菌的抗药性及抗药性的控制方法，具有重要的理论和现实意义。
这有利于优化防治措施，提高生产效益，降低防治成本，促进农业可持续发展。
二、研究内容和方法1.研究内容(1) 番茄灰霉病菌抗药性鉴定：从不同地区的灰霉病菌分离出不少于50份菌株，通过测定这些菌株的对不同杀菌剂的敏感度，探究灰霉病菌的抗药性状况。
(2) 分析抗药性形成的原因：通过比较不同抗药菌株与不易产生抗药性菌株在基因组中的差异，探索灰霉病菌抗药性形成的原因。
(3) 探究灰霉病菌的生物学特性：测定菌株的产孢量、侵染速度等指标，探究灰霉病菌不同药敏菌株的生物学特性与对药剂的抗性之间的相关性。
(4) 研究抗药性控制方法：通过筛选有效的抗菌剂或者结合化学药剂与生物剂（如拮抗菌）的联合使用，探究抗菌剂抗药性的控制方法。
2.研究方法(1) 分离纯化灰霉病菌菌株，并进行药效测定。
(2) 利用PCR扩增灰霉病菌抗药相关基因，并比较抗药菌株与不易产生抗药性菌株在基因组中的差异。
(3) 测定菌株的产孢量、侵染速度等指标，探究灰霉病菌不同药敏菌株的生物学特性。
(4) 筛选和测试抗菌剂或者结合化学药剂与生物剂（如拮抗菌）的联合使用，探究抗菌剂抗药性的控制方法。
三、预期研究结果(1) 建立灰霉病菌抗药性鉴定的实验方法。
(2) 筛选出具有控制灰霉病菌抗药性的有效药剂。
(3) 揭示灰霉病菌抗药性的形成机制，为后续的抗药性控制提供理论依据。
(4) 探究灰霉病菌生物学特性与对药剂抗性之间的相关性，利用这一结论建立更为科学的灰霉病防治策略。
番茄灰霉病菌拮抗稀有放线菌的分离及其抑菌物质分析
active substances were perform ed bet*ween the aseptic ferm entation brotii of strains witii significant antifun
gal activity. T he antifungal
products from fermentation brotii of rare actinomycetes were identi
resolution flight mass spectrom etry. T he results showed that 13 antifungal actinom ycetes were isolated.
S A 3 2 ，S A 3 3 ，S A 3 7 ，S A 3 9 ，SA45 and SA51 had antagonistic effects against tiie growtii and spore germ ina
采 自 辽 宁 各 地 的 放 线 菌 中 筛 选 植 物 病 原 真 菌 拮 抗 放 线 菌 ，通 过 孢 子 萌 发 生 长 法 和 系 统 发 育 树 分 析
番 茶 灰 霉 病 菌 拮 抗 放 线 菌 的 抑 菌 活 性 和 分 类 地 位 ，测 试 高 抑 菌 活 性 菌 株 无 菌 发 酵 液 活 性 物 质 的 稳
ty. T he antifungal activityand taxonomic status of antagonistic actinom ycetes against Botrytis cinerea were
analyzed by spore
germination metiiod and phylogenetic tree construction. Comparison
番茄灰霉病拮抗菌B26抑菌蛋白的分离纯化与鉴定
2 结果与分析
2. 1 硫酸铵敏感性测定 B2 6菌 株发 酵菌 液的 上清 液经 硫 酸铵 处 理后 对
灰霉病菌不表现抑菌活性, 沉淀溶解液对灰霉病菌 却有较强的抑菌作用, 并且活性显著强于硫酸铵沉 淀前的菌液上清 液原液。这说明 B26菌株 培养液 产生的 抗 菌物 质可 以 通过 硫 酸铵 沉 淀 得以 浓 缩
从图 1中可以看出, 抗菌物质的抑菌活性随硫 酸铵饱和度的提高而增加, 当硫酸铵饱和度提高到 50% 时抑菌活性达到最大值, 以后再增加硫酸铵的 浓度时抑菌活性下降, 说明该抗菌物质用 50% 饱和 度的硫酸铵沉淀效果最好。
2. 2 抑菌蛋白的分离纯化 2. 2. 1 DEAE- 纤维素 ( DEAE - 52) 离子交换层析 分步洗脱并配合核酸蛋白质检测仪在 280 nm 的波
) 98 )
江苏农业科学 2008年第 5期
长下检测结果显示, 在 280 nm 波长下共有 3个蛋白 洗脱峰出现, 分别为 0、0. 3、0. 6 m ol /L NaC l的洗脱 液洗脱出来的。收集各个洗脱峰脱盐并检测其抑菌 活性, 结果表明, 只有 0. 3 m o l/L NaC l洗脱液洗脱出 来的蛋白具有抑菌活性 (图 2) 。
(表 1)。
表 1 B26 培养液的硫酸铵沉淀溶解液对灰霉病菌的拮抗性能
处理
50% ( NH4 ) 2 SO4 沉淀后上清液 50% ( NH4 ) 2 SO4 沉淀的溶解液
对照 ( CK)
对灰霉病菌的拮抗性能 ++ +
注: / - 0表示无拮抗作用; / + 0表示抑菌圈 直径为 20. 0 mm 左 右; / + + 0表示抑菌圈 直径 大于 20. 0 mm; 对照 为未 经 ( NH4 ) 2 SO 4 处理的菌液上清液原液。
番茄青枯病拮抗菌株的筛选、鉴定及发酵条件的优化
山西农业科学2022，50（5）：698-708Journal of Shanxi Agricultural Sciences doi:10.3969/j.issn.1002-2481.2022.05.13doi番茄青枯病拮抗菌株的筛选、鉴定及发酵条件的优化卢晓虹，许敏，李甜爽，刘海霞，王美琴（山西农业大学植物保护学院，山西太谷030801）摘要：目前，对于番茄青枯病害的发生缺乏有效的预防措施，筛选和利用有益微生物是重要途径之一。
试验以番茄青枯病病原菌为靶标菌，采用稀释涂布分离法、平板对峙法从健康番茄植株根际土壤中分离筛选对青枯病菌有较好拮抗作用的菌株，结合形态学特征、生理生化特征、分子生物学方法等对其进行菌种鉴定，且采用单因素试验及正交试验方法，对拮抗菌株B-6的发酵培养液配方及发酵条件进行优化。
结果表明，从番茄青枯病重病田块的健康植株根际土壤中分离筛选到1株抑菌效果较好的细菌菌株B-6，抑菌圈直径为13.8mm；对拮抗菌株B-6进行鉴定，经16S rDNA测序并进行同源性比较得出，拮抗菌株B-6与铜绿假单胞菌（Pseudomonas aerugi⁃nosa strain Pa84）的16S rDNA序列相似性达到100%；优化后的最佳培养基组合为麦芽糖3%（30g）、蛋白胨1.0%（10g）、氯化钠1.0%（10g）、蒸馏水1000mL，最佳发酵条件为摇床转速180r/min、发酵时间24h、装液量100mL（规格为250mL锥形瓶）、接种量1.0%（1mL），pH值8，经发酵优化后的抑菌圈直径为16.5mm，比原抑菌圈直径增大19.6%。
研究分离筛选到的拮抗菌株B-6为1株具有开发潜力的生防菌株。
关键词：番茄青枯病；稀释涂布分离法；拮抗菌株B-6；发酵优化；单因素试验；正交试验中图分类号：S436.412.1+5文献标识码：文章编号：1002‒2481（2022）05‒0698‒11Screening and Identification of Antagonistic Strains of Tomato BacterialWilt and Optimization of Fermentation ConditionsLU Xiaohong，XU Min，LI Tianshuang，LIU Haixia，WANG Meiqin（College of Plant Protection，Shanxi Agricultural University，Taigu030801，China）Abstract：In the absence of effective preventing measures at present,screening and utilization of beneficial microorganisms is one of the important ways to prevent the occurrence of tomato bacterial wilt disease.In this paper,taking pathogen of tomato bacterial wilt disease as the target bacterium,a bacterial strain with better antibacterial effect was isolated and screened from the rhizosphere soil of healthy tomato plants by dilution separation method and plate confrontation method.By morphological characteristics,physiological and biochemical characteristics,and molecular biology methods,single factor test and orthogonal test were used to optimize the fermentation medium formulation and fermentation conditions of antagonistic strain B-6.The results showed a bacterial strain B-6with excellent bacteriostatic effect was isolated and screened from the rhizosphere soil of healthy plants in fields with severe tomato bacterial wilt disease,and the diameter of the inhibition zone was13.8mm.The antagonistic strain B-6was identified.The16S rDNA sequencing and homology comparison showed that the antagonistic strain B-6was closely related to Pseudomonas aeruginosa strain Pa84.The16S rDNA sequence similarity reached100%.The optimal medium combination after optimization was as follows:3%of maltose（30g）,1.0%of peptone（10g）,1.0%of sodium chloride （10g）,1000mL of distilled water.The optimal fermentation conditions were180r/min of shaker rotation speed,24h of fermentation time,and100mL of liquid filling volume（the specification was a250mL conical flask）,1.0%of inoculation volume（1mL）,and the pH value was8.The diameter of the inhibition zone after fermentation optimization was16.5mm, which was19.6%larger than the diameter of the original inhibition zone.The antagonistic strain B-6isolated and screened in this paper was a biocontrol strain with development potential.Key words：tomato bacterial wilt;dilution coating separation method;antagonistic strain B-6;fermentation optimization; single factor test;orthogonal test近年来，随着设施番茄种植面积的不断扩大，品种单一，连作现象严重等问题导致土传性病害发生收稿日期：2021-11-10基金项目：山西省重点研发项目（201703D221010-2）作者简介：卢晓虹（1994-），女，山西朔州人，在读硕士，研究方向：植物病害与生物防治。
番茄灰霉病菌颉颃菌的筛选
番茄灰霉病菌颉颃菌的筛选摘要:对从不同生态环境下采集的样品进行分离纯化,共得到菌株68株｡经初筛,得到对番茄灰霉有颉颃作用的生防菌株16株,占分离菌株的23.5%｡并对其中较强颉颃作用的9株菌株进行抑菌活性的测定｡结果表明:滤纸片法得到的各菌株对番茄灰霉的抑制率在65.1%~92.0%之间,抑菌带在2.0~11.0 mm之间,共获得颉颃菌株8株,占分离菌株的11.8%｡关键词:番茄灰霉;颉颃菌;筛选;生物防治Screening of Antagonistic Strain Against Botrytis cinereaAbstract:68 strains were collected from different environments around Xingtai University and purified. 16 strains having antagonistics effect to Botrytis cinerea, which account for 23.5% in total were obtained. Among them, 9 strains having great intensive repression to Botrytis cinerea were detected. According to filter-paper detection, the suppression ratio of varieties maintained ranged from 65.1% to 92.0%; and bacteria-resistance region ranged from 2.0 to 11.0 mm. In addition, 8 anti-bacteria strains were obtained for biological control.Key words: Botrytis cinerea; anti-bacteria; separation; bio-control番茄灰霉病是由番茄灰霉病菌(Botrytis cinerea)引起的一种真菌病害,危害番茄的茎､叶､花及果实,以危害幼果为主,损失率一般在25%~30%,重者可造成绝产｡近年来,随着日光温室､塑料大棚､地膜覆盖等保护措施的改进,番茄种植面积不断扩大,加之茬次增多,为番茄灰霉病的滋生蔓延创造了条件｡番茄灰霉病是一种世界性重要病害,目前化学防治是常用手段,由于频繁施用杀菌剂,病菌抗药性严重｡并且施药时以果实为主要目标,造成了一定的农药污染｡在病害防治措施中,抗性品种的应用是最为经济有效的方法,但灰霉病抗源的匮乏,限制了抗性品种的选育[1]｡因此,近年来利用有益微生物来防治灰霉病已成为新的防治策略｡迄今为止,已有近百种微生物农药来自于微生物的次生代谢物,其中有多抗霉素､农抗120､武夷菌素､新生霉素､中生菌素等环境友好型生物农药｡国外报道多种真菌､细菌对灰霉病菌均有一定的抑制作用,如木霉､粘帚霉､酵母菌､假单胞杆菌等[2]｡在国内,从污水和土壤采样筛选番茄灰霉菌颉颃菌的报道较多,但从植物体采样进行筛选的甚少[3,4]｡本试验从不同生态环境下采样,筛选对番茄灰霉病菌有颉颃作用的菌株,并测定其抑菌效果,为充分挖掘有益微生物资源,利用生防菌防治番茄灰霉病提供理论依据,同时也为研究抑菌活性物质及其抗菌作用机理打下基础｡1材料与方法1.1材料1.1.1样品分别从邢台学院西边小花园杨树下采集土样,从邢台学院内牛尾河采集水样,从邢台学院西边小花园柳树的不同部位取样(根部､树干､枝条),贴上标签,记下采样时间､地点､环境情况,带回实验室｡1.1.2供试病原微生物从邢台市北郊外新星村一农户蔬菜大棚内采集分离得到｡1.1.3主要仪器恒温光照培养箱,电热鼓风干燥箱,高压蒸汽灭菌锅,电热炉,超净工作台等｡1.2方法1.2.1微生物的分离､纯化采用参考文献[5]中的方法对土壤､污水和植物体中的微生物进行分离纯化｡1.2.2对番茄灰霉颉颃菌的筛选将番茄灰霉病菌菌株接种在PDA平板上培养5 d,然后用打孔器打取菌龄一致的菌片,转接到另一PDA平板中央,在菌片的正上､下方2 cm处各划线接种同一种分离的菌株,每处理3次重复,放于25℃恒温培养｡待菌落将长满培养皿时,观察并记录每种菌株对番茄灰霉病菌生长抑制作用的强与弱,筛选出对番茄灰霉病菌有较强颉颃作用的菌株｡1.2.3番茄灰霉病菌颉颃菌抑菌活性的测定将筛选到的具颉颃作用的菌株分别制成109个/mL菌悬液｡用打孔器打取番茄灰霉病菌菌龄一致的菌片,转接到另一PDA平板中央,在菌片的正上､下方2 cm处,接入沾有待测菌株相同浓度菌悬液的滤纸片2片,各个稀释度重复3次,以接沾有无菌水滤纸片的平板作对照,放于25℃恒温培养｡待对照菌落将长满培养皿时,测量菌落生长量和待测菌菌落边缘至灰霉病菌菌落边缘的间距(抑菌带)确定抑菌程度,计算抑制率｡以抑菌带大于 1 mm 的菌株记为有颉颃作用的菌株;抑菌带大于5 mm的菌株作为颉颃菌株[4]｡抑制率(%)=(对照菌落生长量-处理菌落生长量)/对照菌落生长量×100｡2结果与分析2.1微生物分离､纯化结果对不同生态环境下采集的菌样,通过梯度稀释法,用3种不同培养基进行分离,经过纯化后共分离到菌株68株｡2.2番茄灰霉病菌颉颃菌筛选结果采用室内对峙培养法对分离得到68株菌株进行了颉颃性的测定｡结果表明:有些菌株与番茄灰霉病菌互不干扰;有些菌株表现出抑制作用,但不存在抑菌带;有些菌株表现出颉颃作用,即抑菌带明显,少部分菌株表现出较大的抑菌带｡其中具有颉颃作用的菌株16株,占分离菌株的23.5%(见表1);表现较强颉颃作用的菌株9株,占分离菌株的13.2%,有ZG-2､SP-2､TN-5､SP-1､TP-5､TG-4､SG-1､ZN-4､ZP-4｡2.3番茄灰霉病菌颉颃菌抑菌活性的测定结果采用滤纸片法,对番茄灰霉病菌具颉颃作用的菌株进行了抑菌活性的测定,结果见表2｡由表2可以看出:各菌株对番茄灰霉病菌的抑制率在65.1%~92.0%之间,抑菌带在2.0~11.0mm之间｡其中ZN-4的抑菌效果最佳,抑制率达92.0%,抑菌带达11.0 mm;SP-2､TP-5､TN-5､TG-4､SG-1､ZG-2､SP-1的抑菌带均达5 mm以上,即获得颉颃菌株8株,占分离菌株的11.8%｡3讨论土壤､污水､植物体中的微生物由于其特殊的生存环境,会产生不同的活性物质｡随着生物防治的深入发展,微生物资源的开发利用将会受到世界各国的重视和青睐｡本试验从土壤､污水､植物中共分离到了68株菌株,并在室内测试了它们对番茄灰霉病菌的抑制作用,筛选得到16株具有颉颃作用的菌株｡采用滤纸片法对其中表现较强颉颃作用的9株进行了抑菌活性测定,得到8种颉颃菌株｡值得一提的是,ZN-4是从植物体柳树上采集的菌样,表现出最强的抑菌活性,从而可知,植物体可作为筛选颉颃菌种的良好材料资源｡试验中还发现,SP-2在抑菌活性测定后再培养期间,其抑菌带有较大的外延现象,可能在于它的防治效果依赖于一定量的代谢产物的积累,也可能其抑菌活性物质产生较晚,还有待于进一步研究｡试验充分表明了土壤､污水､植物体中微生物作为新的农用抗生素资源的可能性,在农业病害防治上有一定的潜在价值,也为开发新型生物农药奠定了基础｡但颉颃菌菌种鉴定及其生物特性､颉颃物质的产生条件,颉颃物质的理化性质､酸碱稳定性､热稳定性等均需进一步研究测试｡参考文献:[1] 陈双臣,刘爱荣,邹志荣. 转葡聚糖酶和防御素基因对提高番茄灰霉病抗性的研究[J].植物保护学报,2006,33(4):357-362.[2] 朱宏建,易图永,周鑫钰.土壤放线菌生防活性物质的研究进展[J].作物研究,2007,21(2):149-151.[3] 赵蕾,杨合同. 蔬菜灰霉病生防菌的筛选与防效试验初报[J].应用与环境生物学报,1999,5(1):85-88.[4] 唐蕊. 污水中西葫芦灰霉病拮抗细菌的分离与应用[J].北方园艺,2007(9):43-44.[5] 黄秀梨. 微生物学实验指导[M].北京:高等教育出版社,2004.1-8.。
探究番茄灰霉病生物防治的研究进展
DOI：10.16661/ki.1672-3791.2020.13.074探究番茄灰霉病生物防治的研究进展王欣凯 王硕(河北农业大学生命科学学院 河北保定 071000)摘 要：番茄灰霉病是一种由灰葡萄孢菌感染造成的真菌性病害，这种病害不仅能导致番茄果实的腐烂，而且还会对植株的茎、叶、花产生坏影响，对番茄种植地构成极大的威胁。
番茄灰霉病自发现以来，在我国各番茄种植地均有发生，并逐渐成为番茄培育的重要限制性因素。
该文通过分析番茄灰霉病的生物学特性，阐述了番茄灰霉病生物防治措施并对结果进行分析，探究并展望了番茄灰霉病的生物防治的研究进展，以供参考。
关键词：番茄灰霉病 生物防治 研究进展中图分类号：S641.2 文献标识码：A 文章编号：1672-3791(2020)05(a)-0074-02番茄是我国广泛种植的一种植物，也是我国重要的经济作物，其果实中所富含的大量维生素具有很高的营养价值，深受人们的喜爱。
而在种植过程中，受外部环境的影响，番茄容易受到病菌的侵害，其中灰霉病作为破坏最严重的一种病害，不但影响番茄的健康成长，还会对所种植地造成严重的生产威胁。
灰葡萄孢菌是番茄灰霉病的源头，在温度气候适宜时能够形成真菌性病害，侵染番茄的根、茎、果实，导致番茄减产或绝收。
为减少病害的侵害，提升番茄的生产量，使用生物防治手段对病害进行控制，因该方法有诸多优点所以成为近年来抵抗治疗灰霉病的有效办法，受到业界人士的广泛关注。
1 生物学特性1.1 番茄灰霉病病原菌丝萌发条件灰葡萄孢菌是诱发番茄灰霉病的罪魁祸首，当环境不利时以菌丝或者菌核的方式产生休眠体，寄生在病原菌中过冬，并在合适温度与合适气候条件下，萌发病原菌丝，借助生产活动进行病菌的传播。
经研究发展，灰葡萄孢菌在2℃~30℃之间均能萌发与生长，其中19℃~26℃的外部条件生长最快，10℃以下与30℃以上生长减缓。
且灰葡萄孢菌的生长需要光线的照射，以12h交替光照或黑暗的条件下生长速度最快，最适应的酸碱值为5。
2株内生拮抗细菌对灰霉病菌的抑菌活性研究
菌悬浮液以及高温处理 的发酵液在离体黄瓜上对灰霉病
菌 生 长 的 抑 制 作用 。
１２ １ 拮抗细菌对灰 霉病 菌菌丝 生长的影 响 将灰 霉 ．．
病菌接种 于倒 有 Ｐ Ａ 培 养 基 的 载 玻 片 中央 ，等 距 离 Ｄ ２ｃ ｍ分别点 接 细菌 ｆｌ ｑ ２和 ｙ８ ｅ ，以接 种 灰霉 病 菌作 对
２ 结果与分析
２ １ 拮抗细菌对灰霉病菌菌 丝生长的影响 ． 菌株 ｆ１ ｑ２对 灰霉 病 菌产 生 较 明显 的抑 制作 用 ，镜 检观察 到病原 菌 菌丝变 短 、畸形 ，部分 菌丝 末端 膨大 ， 有的菌丝原生质破裂 ；菌株 ｙ８对病 原菌 菌丝 的抑 制作 ｃ 用表现为菌丝末端变 细 ，有 的菌丝 中间膨大成 畸形 ，部
采用对峙培养法 ，检测 ｙ８和 ｆ１ ｅ ｑ２内生拮抗细菌对 灰霉病菌菌丝生 长的影 响，并观察其 发酵液对灰霉病菌 孢子萌发及病菌生长 的影响 ，同时测定 了其发酵液 、细
芽孢杆菌属和假单胞菌属 ，并对 ２ 内生拮抗细菌对灰 株
霉病菌的抑菌活性进行 了初步研究 ，旨为蔬菜生物 防病
提供新的方法。
８ｈ ０ 、１ 、１ 、２ 、１ ｈ ２ ｈ ４ｈ ０ ｈ和 ２ ４ｈ观 察 孢 子 萌 发 数 ， 并测量 其芽管长度 。 １２ ２２ 高温 处理 的拮 抗 细 菌液 对 病 菌 生 长 的 影 响。 ．．．
分菌丝断裂 ；而无菌水处理 的灰霉病 菌菌丝粗 壮 ，分枝
明 显 ，正 常 生 长 。
收 稿 日期 ：２０ — －６ ０ ８１ ０ ０
照 ，于恒 温箱 中 ２ ＝ ５【 ｃ 培养 ３ ，然后在显微镜下 观察处 ｄ 理与对照中灰霉病菌菌丝的变化 。
作者简介 ：张立新 （ ９ ８一） １７ ，男 ，河北定 兴人 ，博士 ，讲师 ，主要 从事植物病原 细菌学研究Ｔ作。
番茄青枯病拮抗内生放线菌的分离及抗菌活性产物研究
番茄青枯病拮抗内生放线菌的分离及抗菌活性产物研究番茄青枯病的病原菌是茄科雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum),可以侵染200多种植物。
由于病原菌可以长期存活在土壤、水中以及被侵染的植株内,一旦有机会随时会感染新的植株,因此发病率较高,难以进行防治。
番茄作为农业主要的经济作物,因遭受青枯病的危害导致每年产量严重下降。
目前对于青枯病的防治主要以化学农药为主,但由于化学农药长期使用导致宿主植物的抗药性有所提升而且对环境造成了严重的影响。
因此,农业生产迫切需要研制新型、低毒和无害的防治青枯病的抗生素。
本文主要通过筛选青枯病拮抗菌,以及对拮抗菌次生代谢产物进行分离,为番茄青枯病的生物防治提供了新型的拮抗菌和抗菌活性物质。
本研究选取了5种常用的筛选培养基对健康和感染青枯病的番茄植株根内内生放线菌进行筛选,将得到的放线菌进行重复合并、菌属归类、菌株种类统计和菌株丰富度分析。
测试分离得到的菌株对番茄青枯病病原菌的抑菌活性,筛选对番茄青枯病具有抑制作用的拮抗菌,对拮抗作用较强的菌株进行发酵液活性的测试和次生代谢产物的分离,并且对它们进行了形态特征的描述。
此外,本实验还对从根内分离得到的两株野野村新种进行了多相分类学分析,为稀有放线菌的分类学提供了新的资源。
实验结果如下:(1)我们从健康和染病的番茄植株根内共分离得到1465株放线菌,去除重复后,合并为256株不同的放线菌,其中只存在于染病根内的内生放线菌有85株,只存在于健康根内的放线菌有49株,另外的122株在染病和健康的番茄植株根内都存在。
通过对菌株丰富度和种类分析发现,健康番茄植株根内分离的放线菌丰富度高于染病植株根内内生放线菌;而染病植株根内内生放线菌种类上多于健康植株分离得到的放线菌;健康和染病番茄植株根内有大量共存的放线菌。
(2)对分离得到的256株菌测试了对青枯病病原菌抑菌活性,得到23株有抑菌活性的内生放线菌,其中有7株放线菌分离自健康番茄植株,抑菌直径在17.64±0.72-22.04±0.42 mm之间,13株放线菌分离自染病番茄植株根内,抑菌直径大小在18.54±0.87-28.06±1.32 mm之间,3株放线菌在染病植株和健康植株中均存在,抑菌直径大小在17.86±1.86-20.12±1.75 mm之间。
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番茄灰霉病内生拮抗菌的筛选及抑菌物质研究张根伟;张丽萍;李书生;程辉彩【摘要】[ Objective ] The aim was to screen endophytic antagonistic bacteria and study it' s inhibitive substance to control tomato gray mold. [Method] Forty-six endophytic antagonistic bacteria strains were isolated from 65 healthy tomato plants which had antimicrobial activity to control tomato gray mold, and one strain which could produce antimicrobial substances was screened out by using PDA well-diffusion method. The inhibition of antimicrobial substances to mycelium and spores of Botrytis cinerea was studied, and the antimicrobial substances was i-dentified through acid precipitation, Sephadex G-50 gel chromatography and agarose gel electrophoresis analysis primarily. [ Result] It was observed under microscope that the antibacterial substances had the mechanism of tearing cell membrane. The antimicrobial substances was identified as 3. 3 kDa of proteins or polypeptide primarily. [ Conclusion] The research result provides reference for the development of new biocon-trol preparation.%[目的]筛选番茄灰霉病内生拮抗菌并研究其抑菌物质.[方法]从65株健康番茄植株中分离到内生拮抗细菌46株,在此基础上通过PDA培养基打孔扩散法进行复筛,获得了1株强烈抑制灰葡萄孢菌的抑菌物质产生菌.研究了该抑菌物质对灰葡萄孢菌菌丝和孢子的抑制作用,并经酸沉淀、Sephadex G-50凝胶层析纯化、琼脂糖凝胶电泳分析对其进行了初步鉴定.[结果]显微镜观察发现该抑菌物质具有列膜抑菌机制,初步鉴定抗菌物质为3.3 kDa左右的多肽类物质.[结论]为开发新的生防制剂奠定了基础.【期刊名称】《安徽农业科学》【年(卷),期】2012(000)030【总页数】3页(P14789-14791)【关键词】内生菌;短小芽孢杆菌;灰葡萄孢菌;抑菌物质【作者】张根伟;张丽萍;李书生;程辉彩【作者单位】河北省科学院生物研究所,河北石家庄050081;河北省科学院生物研究所,河北石家庄050081;河北省科学院生物研究所,河北石家庄050081;河北省科学院生物研究所,河北石家庄050081【正文语种】中文【中图分类】S182由灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)引起的灰霉病是番茄生产上的一种世界性气传真菌病害，可侵染花、果、叶、茎多个部位，低温、高湿环境利于发病，常常造成较大损失［1］。
目前主要使用化学杀菌剂进行防治，由于病原菌易变异产生抗药性，使得化学杀菌剂的使用浓度不断增加，对人体和环境构成威胁。
生物防治由于其高效、低毒、安全等特性成为近年来的研究热点，而植物内生拮抗细菌由于与植物的长期共生关系，成为公认的很有发展潜力的生防菌株筛选来源。
为此，笔者进行了番茄内生菌的分离，筛选出对蔬菜灰霉病菌具有强烈抑制作用的抗菌物质产生菌，并对抗菌物质进行了初步鉴定，以期为开发新的生防制剂奠定基础。
1 材料与方法1.1 病原菌灰葡萄孢菌由河北省科学院生物研究所在番茄上分离得到。
1.2 方法1.2.1 内生细菌的分离纯化。
将采集的健康番茄的根、茎、叶等组织及种子经表面消毒后，无菌水冲洗4次，样品在研钵中研磨，稀释平板法分离内生细菌，30℃培养2～3 d后挑取菌落形态差异明显的菌落保存备用。
1.2.2 拮抗菌的分离与筛选［2］。
对分离的菌株在PDA培养基上与灰葡萄孢菌对峙培养初筛，24℃培养3～5 d，挑取、保存抑菌圈大的菌株。
将初筛菌株在NB培养基液体摇瓶培养，28℃培养3 d，发酵液离心，取上清用0.45 μm过滤器除菌，在病原菌高氏平板上打直径4 mm孔，滴加100 μl发酵滤液，平板扩散法对峙培养，观察抑菌圈，进行复筛，筛选抑菌圈大的抗菌物质产生菌。
1.2.3 抑菌物质对灰葡萄孢菌菌丝和孢子的抑制作用。
挑取抑菌圈周围灰葡萄孢菌的菌丝，显微镜观察菌丝形态;将稀释至不同倍数的无菌滤液与同体积加入5%葡萄糖的番茄灰霉病菌分生孢子(浓度1×108cfu/ml)悬浮液混合，以无菌水加同体积孢子悬浮液为对照，滴入凹玻片，(25±1)℃保湿培养，12、18、24 h后显微镜观察灰葡萄孢菌孢子萌发的变化情况，统计抑制率。
1.2.4 抑菌物质的初步鉴定。
1.2.4.1 Sephadex G-50柱层析分离。
将NB培养基的发酵液过滤除菌，用pH2.5的盐酸沉淀过夜，沉淀用60%乙醇抽提、冷冻干燥后，用蒸馏水溶解经Sephadex G-50凝胶层析纯化，检测波长为280 nm，收集各个吸收峰，进行抑菌活性测定。
1.2.4.2 Tricine-SDS-PAGE检测。
截留具有活性的峰，参考《蛋白质电泳试验技术》［3］进行琼脂糖凝胶蛋白电泳分离，低分子量蛋白肽电泳方法见参考文献［4］，对分离的条带进行抑菌活性测定。
1.2.4.3 蛋白酶K和胃蛋白酶处理。
将蛋白酶K和胃蛋白酶配成5 mg/ml的溶液，分别取0.1 ml于离心管中，分别加入发酵液0.4 ml，使酶的终浓度为1 mg/ml，蛋白酶K调pH至7.0左右，胃蛋白酶pH调至2.0～3.0，同时以0.l ml双蒸水加入0.4 ml发酵液作为对照，37℃温育4 h，测定抑菌活性的变化。
2 结果与分析2.1 菌株的筛选2.1.1 拮抗菌的初筛。
从河北石家庄周边菜地采集番茄植株65个，稀释平板法分离得到内生细菌432株。
以灰葡萄孢菌为指示菌，平板对峙培养筛选出46株具有拮抗作用，其中25株具较强拮抗作用，抑菌圈直径均大于2.5 cm。
2.1.2 抗菌物质产生菌复筛。
采用平板扩散法进行复筛，得到8株对灰葡萄孢菌有较强抑制作用的抑菌物质产生菌，抑菌圈直径均超过了21.3 mm(表1)，其中以D-1菌株抑菌圈直径最大，达到25.5 mm。
7 d后D-1的抑菌圈缩小不明显，说明产生的抗菌物质性质稳定。
2.2 抗菌物质对灰葡萄孢菌菌丝和孢子的抑制作用显微镜下可见菌丝有膨大、断裂、自溶现象(图1);孢子有膨大变形、内容物溢出现象，不能萌发形成菌丝(图2)，说明该抑菌物质具有裂膜抑菌机制。
表1 内生细菌发酵滤液对灰霉菌的抑制作用 mm菌种编号抑菌直径菌种编号抑菌直径D-1 25.5±1.2 C-11 22.5±0.1 B-3 24.3±1.1 D-13 21.9±0.2 C-423.4±1.0 D-18 21.7±0.9 A-7 22.8±1.1 B-20 21.3±1.2由表2可知，抑菌物质D-1原液对孢子萌发抑制率可达98.9%，随着稀释倍数的增大，抑制率有所降低，当稀释倍数为100倍时，抑制率为53.4%。
图1 菌丝形态(×400倍)图2 孢子形态(×400倍)表2 D-1发酵滤液对番茄灰霉病分生孢子萌发的影响 %稀释倍数萌发率抑制率11.1 98.9 10 3.2 96.7 20 16.2 83.4 100 45.5 53.4 CK 97.5 -2.3 抗菌物质的初步鉴定2.3.1 Sephadex G-50柱层析分离结果。
发酵滤液经盐酸沉淀、乙醇抽提，通过Sephadex G-50柱层析，出现2个洗脱峰(图3);活性检测结果表明，峰2具有抑制灰葡萄孢菌活性(图4)。
2.3.2 Tricine-SDS-PAGE测定抗菌物质的分子量。
纯化样品经Tricine-SDS-PAGE电泳分离，用考马斯亮蓝染色脱色后，在凝胶上只出现1条明显谱带(图5)，根据Marker谱带位置，初步确定该条带分子量为3.3 kDa左右。
抑菌活性检测表明，该谱带具有抑菌活性。
图3 抗菌物质的Sephadex G-50柱层析图谱图4 峰2的抑菌效果2.3.3 蛋白酶K、胃蛋白酶处理稳定性。
结果表明，该抑菌物质经蛋白酶K、胃蛋白酶处理后抑菌活性未下降。
图5 Tricine聚丙烯酰胺凝胶电泳结果综上，初步判定该抑菌物质可能为3.3 kDa左右的多肽类物质。
3 讨论植物内生菌是指其生活史阶段生活在活性植物组织中又不引起明显病害的微生物，该类菌对许多作物病害显示出良好的控制效果，具有多种生物学功能，已成为植物病理学、微生物学、植物学等许多学科研究的热点。
目前国内针对番茄内生细菌的研究报道很少，参考国外对其他植物内生细菌的研究，有学者认为植物内生菌由于长期的共生关系，更易分离得到抑制植物病害的拮抗微生物，且一般对植物无害［5］。
该试验从健康番茄植株分离到强烈抑制灰葡萄孢菌的内生拮抗菌D-1，该菌株产生的抑菌物质具有列膜抑菌机制，对孢子的萌发抑制率可达98.9%，稀释100倍仍有53.4%的抑制率;抑菌物质初步鉴定为3.3 kDa左右的多肽类物质。
多肽类抗菌物质大多具有良好的内吸性，有望开发成为新的生防制剂，对其结构、性质的进一步鉴定有待进一步研究。
参考文献［1］杨燕涛.国内保护地蔬菜灰霉病侵染规律及防治技术研究进展［J］.农药，2003，42(l):6-10.［2］张铎，谢莉，张蕾，等.棉花黄萎病拮抗内生菌的筛选鉴定及抗菌物质研究［J］.河北师范大学学报，2008，32(5):673-676.［3］郭尧君.蛋白质电泳实验技术［M］.3版.北京:科学出版社，2005:92-118. ［4］曹佐武.小分子肽的Tricine-SDS-PAGE分离方法［J］.生物学通报，2003，38(3):55-56.［5］FISHER P J，PETRINI O，LAPPIN SCOTT H M.The distribution of some fungal and bacterial endophytes in maize(Zea mays L.)［J］.New Phytol，1992，122(2):299-305.。