番茄灰霉病拮抗芽孢杆菌LW-6-1的筛选、鉴定及抑菌活性研究
青海盐湖地区嗜盐菌的分离纯化及抑制植物病原菌的活性初探
青海盐湖地区嗜盐菌的分离纯化及抑制植物病原菌的活性初探沈硕;王舰【摘要】以番茄灰霉菌(Botrytis cinerea)、菊芋菌核菌(Jerusalem artichoke Sclerotium)、油菜菌核菌(Sclerotinia sclerotiorum)、辣椒疫霉菌(Phytophthora capsici)、蚕豆根腐菌(Fusarium solani)及豌豆根腐菌(Aphaomyces euteiches Dreehsler)等6种植物病原真菌为供试菌株,采用滤纸片法对植物病原菌提取液的抑菌活性进行了测定.为了获得对这几种植物病原菌具有较高抑制作用的嗜盐菌菌株,对供试菌株进行了液体发酵及发酵液的活性筛选.经滤纸片法测定,青海盐湖嗜盐菌菌株对辣椒疫霉菌具有较强的拮抗作用,并用最小抑制浓度法(MIC)测定了嗜盐菌提取物对辣椒疫霉菌的最小抑菌浓度范围为9～12 mg/mL.【期刊名称】《广东农业科学》【年(卷),期】2013(040)001【总页数】4页(P79-81,88)【关键词】嗜盐菌;次级代谢产物;滤纸片法;抑菌活性【作者】沈硕;王舰【作者单位】青海省农林科学院生物技术研究所/青藏高原生物技术教育部重点实验室,青海西宁810016【正文语种】中文【中图分类】S482.2+92盐湖广泛分布于世界各地，是嗜盐微生物高度集中的极端环境。
目前被重点研究的盐湖有美国的大盐湖，肯尼亚的死海和马加迪湖。
我国新疆维吾尔自治区和青海省也有大量的盐湖分布。
研究表明，盐湖中微生物多样性极为丰富，存在着大量高密度的未知微生物资源[1]。
其中，拮抗微生物的生物防治方法近年来日益受到重视。
理论研究方面,人们对嗜盐菌的嗜盐机理尤感兴趣,生存在极端环境中的微生物,通常是通过代谢作用适应其所处生境而得以存活并发挥作用,集中表现在细胞膜、细胞壁结构性成分和功能性成分的稳定性、反应动力学、酶系的性质、代谢途径及信息传递、蛋白质核酸成分及构象等方面为了适应高盐环境而具有的特异性。
贝莱斯芽孢杆菌对甜樱桃软腐病生防效果的研究
收稿日期院2021-10-13基金项目院山东省自然科学基金（ZR2021MC183）；山东省果品产业技术体系（SDAID-06-13）第一作者简介院郗良卿（1995—），男，硕士，主要从事甜樱桃保鲜贮藏研究工作*通信作者简介院吴澎（1972—），女，教授，博士，主要从事食品科学方面的教学与研究工作
中国果菜ChinaFruit&Vegetable第42卷,第1期
2022年1月栽培生理
CultivationPhysiology
贝莱斯芽孢杆菌对甜樱桃软腐病生防效果的研究
郗良卿1，吴澎1*，李睿琪2
（1.山东农业大学食品科学与工程学院，山东泰安271000；2.山东农业大学动物科学与技术学院，山东泰安271000）
摘要院本实验从健康甜樱桃中筛选出优质拮抗菌株———贝莱斯芽孢杆菌，并研究了其对甜樱桃软腐病的生防效果。通过对拮抗菌发酵条件的优化，获得了优质拮抗菌，并进行体内验证试验，对发酵条件进行筛选以得到最佳抑菌效果。实验结果表明，发酵液和发酵上清液的抑菌效果显著，而发酵液的抑菌效果最佳，抑菌率为（69.82±1.43）%。最佳发酵条件为温度37益，发酵96h，pH6.5，发酵液浓度10
9CFU/mL。当贝莱斯芽孢杆菌处于109CFU/mL时，拮抗菌的抑菌
效果最好，软腐病的发病率仅为20.58%，防治效果达到79.42%。扫描电镜结果得出，经拮抗菌处理的病原菌菌丝形态被严重破坏，发生畸形、凹陷等现象。可见，贝莱斯芽孢杆菌有较好的抑菌效果，能够抑制匍枝根霉的生长，对樱桃软腐病也有良好的防治效果。关键词院甜樱桃；软腐病；内生拮抗细菌；贝莱斯芽孢杆菌；生防效果中图分类号：S436文献标志码：A文章编号：1008-1038(2022)01-0059-10
DOI：10.19590/j.cnki.1008-1038.2022.01.010
BiocontrolEffectofSoftRotofSweetCherry
XILiang-qing1,WUPeng1*,LIRui-qi2
番茄早疫病拮抗放线菌的筛选
番茄早疫病拮抗放线菌的筛选袁鹤;沈志红;杨丽丽;李凯【摘要】为筛选番茄早疫病菌的强拮抗放线菌,探索生物防治的可行性,从不同番茄栽培地土壤中采样,通过平板稀释法分离得到32株放线菌.以番茄早疫病菌为指示菌,通过纸片扩散法进行拮抗放线菌的初筛和复筛,结果筛选出3株对番茄早疫病具有良好拮抗效果的放线菌,编号分别为Act-11,Act-13和Act-25,该菌株作为具有较高生防活性的放线菌,在番茄早疫病的生物防治中具有潜在的应用前景.%To screen a germ which has significant antagonism against tomato early blight and to approach biocontrol feasibility, thirty two strains of actinomycetes were separated from soil samples collected from different tomato cultivation soils by diluting and separating methods. Three strains had been proved to have antagonistic activity against Alternaria solani by disk diffusion method for screening and rescreening, numbered Act-11, Act-13 and Act-25. Act-11, Act-13 and Act-25 strains had higher biological control activity. It was suggested that strains Act-11, Act-13 and Act-25 had the potential application prospect in biological control of tomato early blight.【期刊名称】《山西农业科学》【年(卷),期】2012(040)011【总页数】3页(P1223-1225)【关键词】番茄早疫病;拮抗放线菌;抑菌效果;生物防治【作者】袁鹤;沈志红;杨丽丽;李凯【作者单位】山西舜天农业微生物科学技术研究院,山西阳泉045000;山西舜天农业微生物科学技术研究院,山西阳泉045000;山西舜天农业微生物科学技术研究院,山西阳泉045000;山西舜天农业微生物科学技术研究院,山西阳泉045000【正文语种】中文【中图分类】S436.412.1+4番茄早疫病又称轮纹病，是由茄链格孢菌（Alternaria solani）所导致的一种番茄重要病害之一，也是一种世界性病害。
枯草芽孢杆菌防治植物病害的研究进展
关于枯草芽孢杆菌防病促生作用机制 , 近些年 国内外学者进行了大量研究 , 认为其作用方式多 样 , 主要包括营养和空间位点的竞争 、分泌抗菌物 质 、溶菌作用和促进植物生长等几个方面 。
111 营养和空间位点的竞争 营养和空间位点的竞争是指存在于同一微小生
物环境中的两个或两个以上微生物之间争夺这一环 境内的空间 、营养 、氧气等的现象 。Bacon 分离的 玉米内生枯草芽孢杆菌与玉米病原真菌串珠镰孢菌
此外 , 生物表面活性素为分子量约1 000 Da 的
环脂肽类物质 , 具有抗菌 、抗病毒和生物表面活性
剂作用 。一般认为 , 由枯草芽孢杆菌产生的生物表
面活性素无直接抗真菌能力 , 但是可以加强伊枯草
菌素的抗真菌能力 。它是已发现的最强的一类生物
表面活性剂 , 具有广泛的潜在工业应用价值 , 如洗
AU195 可以产生芽孢霉素 D , 抑制黄曲霉毒素产生
菌黄曲霉 ( Aspergillus flavus) [5] 。
除此之外 , 枯草芽孢杆菌抗菌代谢物还有几丁
质酶 、β21 , 3 葡聚糖酶等 。上海市农业科学院植物
保护研究所已研究证明 , 产几丁质酶枯草芽孢杆菌
G3 菌株的固体培养物在对黄瓜灰霉病菌和番茄叶
我国利用枯草芽孢杆菌防治植物病害的应用研 究也达到了世界先进水平 , 现已开发成功并投入生 产的商品制剂有亚宝 、百抗 、麦丰宁 、纹曲宁等 。 云南农业大学和中国农业大学共同研制的微生物农 药 “百抗”获得农药部登记注册 , 已在多个省推广 使用 , 面积约4 667 hm2 。百抗的主要有效成分是枯 草芽孢杆菌 B908 , 大田应用中对水稻纹枯病防效 70 %以上 , 其抑菌机制为营养竞争 、位点占领等 。 南京农业大学生防菌 B3 (商品名麦丰宁) 是由枯 草芽孢杆菌 B3 菌株制成的活体生物杀菌剂 , 对小 麦纹枯病田间防效达 50 %～80 % , 其防病机制主 要表现在产生抑制小麦纹枯病病菌菌丝生长 、菌核 形成和菌核萌发的抗菌物质 。江苏省农业科学院陈 志谊等人经过 10 多年生物防治水稻病害的研究获 得了对多种病原菌有强烈抑制作用 、防治水稻纹枯 病的效果达 50 %～81 %的 B . subtilis B2916 菌株 , 已在江苏等地得到广泛推广[10] 。
植物病原拮抗菌木霉属真菌的研究进展
植物病原拮抗菌木霉属真菌的研究进展韩长志【摘要】To direct the future researches on screening and protection of Trichoderma spp. fungi, studies on the iso-lation region, the objects of action and utilization of the fungi were reviewed. The isolation region involves rhizosphere soil of healthy plant, the internal healthy organizations and extreme environmental regions. The objects of action includes crops, vegetables, fruits and tobacco. The fungi and their preparations are often used for the control of phytopathogen. The future research focuses and difficulties were presented as well.%为了明确木霉属真菌今后在筛选、保护以及开发利用等方面的研究方向，对植物病原拮抗菌木霉属真菌的分离筛选区域、作用对象以及利用进行综述。
生防木霉属真菌分离筛选区域涉及健康植物根际土壤、健康植物组织内部以及极端环境区域等。
生防木霉属真菌作用对象主要包括粮食作物、蔬菜、果树和烟草等。
生产中主要利用生防木霉属真菌活体本身及其代谢产物形成的制剂防治植物病原菌等。
提出了学术界对生防木霉属真菌未来的研究热点、难点以及重点，为进一步开展木霉属真菌开发及利用研究提供重要的理论基础。
【期刊名称】《江苏农业学报》【年(卷),期】2016(032)004【总页数】7页(P946-952)【关键词】木霉属真菌;植物病原拮抗菌;作用对象;分离区域【作者】韩长志【作者单位】西南林业大学林学院/云南省森林灾害预警与控制重点实验室，云南昆明 650224【正文语种】中文【中图分类】S432.4+4木霉属(Trichoderma Pers. ex Fr.)真菌，在分类上隶属于半知菌类、丛梗孢目、丛梗孢科、丛梗孢科单胞亚科、头孢霉族 [1]，广泛存在于植物根际土壤、叶围、种子以及球茎等生态环境中 [2]，是迄今为止用于防治植物病害的生防菌中研究、利用最多的植物病原拮抗真菌 [3]。
一株拮抗稻瘟病菌的放线菌筛选及初步鉴定
文章 编 号 ：０ ２ ２ ９ （ Ｏ ０ ０ — ０ ５ ０ １０ — ０Ｏ ２ ｌ ）２ ０ １ — ５
一
株 拮抗 稻 瘟病 菌 的放 线 菌筛 选及 初 步鉴 定
张海 霞 ， 彦杰 ， 冬梅 ， 王 孙 葛文 中
（ 黑龙江八一农垦大学生命科学技术学 院 ， 黑龙江 大庆 １３ １ ） ６ ３９
第２ ２卷 第 ２ 期 江 八 一 农 垦 大 学 学 报
Ｊ ｕｎ ｌ ｆ Ｈｅｌｎ ｊ ｎ Ｒａ ｉ ｒ ｕｔｒｌ ｉｅｓｔ ｏ ｒ ａ ｏ ｉ ｇｉ ｇ ｏ ａ ｙ Ａｇｉ ｌｕａ Ｕｎｖ ｒｉ ｃ ｙ
２ （ ）１～ ９ ２ ２ ： ５ １
Ａｐｒ２ ０ ．０１
摘 要 ： 从采 自全 国各地的 ４ ８份土样中分离得到放线菌 ４ ３株 。以水稻稻瘟病菌为指示菌 ， ０ 利用平皿对峙法筛选到 ３ Ｏ株具有 较好拮抗 作用 的菌株 ， 其中菌株 ＷＭ － ２ ４的拮抗作用最强 ， 抑菌带 宽度为 ２ ． ｍ ２ ｍ。结合抑制菌丝生长速率法进行 复筛 ， ２ 结果表 明菌株 ＷＭ２ ４对稻瘟病菌 的抑制效果最好 ， — 抑制率为 ８ ．５ 根据形态特 征、 ９３ ％。 培养特征 、 生理生化特征及 １ Ｓｒ Ｎ ６ Ａ序列 比对 Ｄ 分析 ， 初步鉴定菌株 ＷＭ２ ４为鲜黄链 霉菌（ｔ ｐｏ ｙｅ ｇｌｕ － Ｓｒ ｔｍ ｃｓ ａｂｓ ｏ ｅ 关键词 ： 稻瘟病菌 ； 拮抗作用 ； 筛选 ； 鉴定
植物内生菌在农作物方面的应用探析
植物内生菌在农作物方面的应用探析作者：李晴柴霜冯千禧张小龙蔡婷来源：《种子科技》2021年第12期摘要：植物内生菌是植物的重要组成部分之一，有望以微生物农药、增产菌和生防载体菌形式普遍应用，成为生物防治中最具潜力的治疗手段之一。
分析了目前传统化肥与普通微生物肥料的局限性，并以内生菌剂的防治机理为基础，探讨了植物内生菌在农作物方面的应用及前景。
关键词：植物内生菌;农作物;应用文章编号： 1005-2690（2021）12-0008-02 中国图书分类号： Q948.122.3 文献标志码： A稻谷、玉米、高粱、小麦等是我国主要的粮食作物，其中小麦、玉米、稻谷的分布面积最为广泛，产量也较多，三者之和占全国粮食总量的80%以上。
农作物生长的整个阶段都会受到多种有害生物（植物病原、害虫、杂草等）的侵害，严重影响和降低农作物的产量与质量。
目前防治农作物病害的主要途径仍是施用化肥、农药等，这些物质不仅会对土壤和环境造成严重污染，而且会产生一系列问题，如病菌抗性增强、破坏生态平衡、残留毒害问题等。
随着人们生态意识的加强，微生物菌剂（主要包括微生物菌剂和复合微生物菌剂）越来越受到重视，但仍然存在价格昂贵、质量良莠不齐等问题，因此难以作为长效手段。
为了解决以上弊端，人们开始将目光转移至植物内生菌剂上。
植物内生菌剂指的是以植物体作为宿主进行生存、发育和繁衍的菌类，在生物的调节代谢过程中能够形成多种次生物质，这些次生物质可以对植物体起到抗菌、固氮、产生抗性、产生调节物质及促进生长等利于植物生长的作用。
此外，内生菌由于长期与植物体共生，并与其共同进化，在繁衍过程中形成了长期的互利共生关系[1]。
1 植物内生菌剂的防治机理1.1 产生抗菌物质——水解酶类真菌细胞壁主要由几丁质和葡聚糖组成。
水解酶通过降解细胞壁防治病害。
研究表明，有一种用来防治水稻稻瘟病的内生细菌（Pseudomonas fluorescens）能够产生几丁质酶和葡聚糖酶，且防病效果受其产生的几丁质酶和葡聚糖酶水平高低的影响。
四种芽孢杆菌生防功能初探
铁载体的功能，筛选培养基由三部分组成：MSA培养基、CAS （chromeazurol S）染液和0.1 mol/L的磷酸缓冲溶液。这三部分在 配制过程中必须分开并单独灭菌后，在1.0 L的MSA培养基中先后 加入50 mL CAS染液和50 mL的磷酸缓冲溶液（0.1 mol/L）混匀制 成MSA-CAS检测培养基[9]。
4）CAS（chromeazurol S）染液配方（100 mL）：三氯化铁 0.003 g，十六烷基三甲基溴化铵0.15 g，铬天青0.0653 g，用无菌 水定容至100 mL。
5）0.1 mol/L的磷酸缓冲溶液（1.0 L）：磷酸二氢钠0.5 g，磷 酸氢二钠2.0 g，氯化铵0.25 g，磷酸二氢钾0.075 g，氯化钠0.2 g， 无菌水100 mL。 1.3 室内平板对峙试验
植物病原菌：保存于本实验室的香蕉枯萎病的致病菌尖孢镰 刀菌（Fusarium oxysporum）古巴生理4号小种和水稻纹枯病的致病 菌立枯丝核菌（Rhizoctonia solani）。
供试菌株：西姆芽孢杆菌（Bacillus siamensis）H1401、地 衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）H2202、解淀粉芽孢杆菌 （Bacillus amyloliquefaciens）H4112、贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis strain）H4309均为芽孢杆菌属，由华南农业大学分子遗 传实验室保存提供。 1.2 试剂及培养基
将试验菌株用平板划线接种至LB培养基进行活化，放置于 35℃培养箱培养24 h，制备成OD600值为0.6的菌悬液。将两种植物 病原菌分别活化至PDA培养基，28℃恒温培养箱培养5天后，用直 径为7 mm 的无菌打孔器打取病原菌饼接种至PDA培养基的一侧， 用无菌接种环取菌悬液在已接种植物病原菌PDA培养基的另一侧 划线，每个供试验菌株设三次重复，以不接种供试菌的PDA培养 基为对照，放置于28℃培养箱中培养5天后观察结果并测量抑制距 离和试验菌株的生长宽度，计算具有抗病功能菌株的抑制力，计 算公式为：
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番茄灰霉病拮抗芽孢杆菌LW-6-1的筛选、鉴定及抑菌活性研究刘伟;宋双;沈小英;安天赐;牛小义;安德荣【摘要】[目的]从福建、四川、陕西等地耕作土壤中筛选对番茄灰霉病有较强生防效果的拮抗芽孢杆菌.[方法]随机采集福建、四川、陕西等地耕作土壤样品30份,采用平板稀释法从中分离芽孢杆菌,以番茄灰霉病菌、稻瘟病菌、辣椒疫霉病菌、苹果轮纹病菌、小麦根腐病菌、棉花枯萎病菌为靶标菌筛选拮抗芽孢杆菌;检测拮抗芽孢杆菌菌株无菌发酵液对供试病原真菌菌丝生长、孢子萌发、菌丝形态的影响;通过形态学特征、生理生化特征及16S rDNA序列分析,对筛选出的拮抗菌株进行鉴定.[结果]从采集的30份土壤样品中分离得到273株芽孢杆菌,经病原真菌定向筛选后,得到1株对番茄灰霉病菌、稻瘟病菌、辣椒疫霉病菌、苹果轮纹病菌、小麦根腐病菌、棉花枯萎病菌有较强生防效果的芽孢杆菌LW-6-1,LW-6-1菌株无菌发酵液对番茄灰霉病菌和稻瘟病菌菌丝生长的抑制效果较好,菌丝生长抑制率分别为95.34％和92.56％,EC50分别为10.18和10.84 mL/L;对抑制番茄灰霉病菌和稻瘟病菌孢子萌发的抑制率分别为93.98％和92.09％,EC50分别为2.03和2.67 mL/L.经鉴定,LW-6-1为甲基营养型芽孢杆菌Bacillusmeth ylotrophicus.[结论]筛选到的拮抗芽孢杆菌LW-6-1对番茄灰霉病有较强的生防效果,能显著抑制番茄灰霉病菌的生长.【期刊名称】《西北农林科技大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2013(041)011【总页数】7页(P73-79)【关键词】番茄灰霉病;拮抗芽孢杆菌;生物防治;甲基营养型芽孢杆菌【作者】刘伟;宋双;沈小英;安天赐;牛小义;安德荣【作者单位】西北农林科技大学植物保护学院/旱区作物逆境生物学国家重点实验室,陕西杨凌712100;西北农林科技大学植物保护学院/旱区作物逆境生物学国家重点实验室,陕西杨凌712100;西北农林科技大学植物保护学院/旱区作物逆境生物学国家重点实验室,陕西杨凌712100;西北农林科技大学植物保护学院/旱区作物逆境生物学国家重点实验室,陕西杨凌712100;西北农林科技大学植物保护学院/旱区作物逆境生物学国家重点实验室,陕西杨凌712100;西北农林科技大学植物保护学院/旱区作物逆境生物学国家重点实验室,陕西杨凌712100【正文语种】中文【中图分类】S476.19;S154.39番茄灰霉病由灰葡萄孢(Botrytis cinerea Persex Fr．)侵染所致，是一种世界性重要病害。
该病菌主要危害叶片及果实，对保护地番茄生产构成极大威胁，已成为番茄设施栽培的限制性障碍。
由于抗病育种难以进行，国内目前对于该病的防治主要依靠化学防治，但化学药剂的大量应用常常导致农药残留。
应用有益微生物防治番茄灰霉病对人畜安全无毒，既不污染环境，也无残留危害，且有利于保持生态平衡，因此其更有利于维持农业的可持续发展[1]。
许多生物与灰葡萄孢菌具有拮抗作用，因此利用生物拮抗菌可以控制番茄灰霉病。
研究表明，木霉、浅白隐球酵母、黏帚霉、多种细菌及放线菌等对灰葡萄孢菌有抑制作用[2-7]。
有研究表明，在设施栽培条件下，喷洒枯草杆菌Quadral36(Bacillus subtilis)、哈茨木霉(Trichoderma harzianum)和Rhodosporium diobovatum可以防治番茄灰霉病[4-7]，并且已有人将哈茨木霉菌株制成菌剂施用于大田，以控制番茄等作物灰霉病的发生[7-8]。
本研究以番茄灰霉病病原菌为供试靶标菌，随机从福建、四川、陕西等地耕作土壤中筛选拮抗菌，采用平板对峙法、菌丝生长抑制法、孢子萌发法，对筛选拮抗菌的抑菌作用进行初步探索，并通过形态学特征、生理生化特征及16S rDNA 序列分析对菌株进行鉴定，以期获得对番茄灰霉病有较强生防作用的拮抗芽孢杆菌。
1 材料与方法1.1 材料1.1.1 土样采集随机从福建、四川、陕西等地采集耕作土壤30份。
1.1.2 培养基牛肉膏蛋白胨培养基[9]：牛肉膏3.0 g，蛋白胨10.0 g，氯化钠5.0 g，琼脂20 g，蒸馏水1 000 mL，pH 7.2。
LB固体培养基[9]：蛋白胨10.0 g，氯化钠5.0 g，酵母膏10.0 g，琼脂20.0 g，蒸馏水1 000 mL，pH 7.0。
LB液体培养基[9]：蛋白胨10.0 g，氯化钠5.0 g，酵母膏10.0 g，蒸馏水1 000 mL，pH 7.2。
PDA培养基[9]：去皮马铃薯200 g，蒸馏水1 000 mL，葡萄糖20 g，琼脂15 g，pH 7.0。
1.1.3 供试菌株番茄灰霉病菌(Botrytis cinerea)、稻瘟病菌(Pyricularia oryzae)、辣椒疫霉病菌(Phytophthora capsici Leonian)、苹果轮纹病菌(Physalospora piricola)、小麦根腐病菌(Bipolaris sorokiniana)、棉花枯萎病菌(Fusarium oxysporum f.sp. vasinfectum)，均由西北农林科技大学植物病害综合治理实验室提供。
1.2 方法1.2.1 拮抗芽孢杆菌的分离称取土壤样品10 g，倒入装有90 mL灭菌水的锥形瓶中，200 r/min振荡20 min，80 ℃水浴30 min，制成1∶10的土壤稀释液。
从上述溶液中取出1 mL，加入9 mL无菌水充分振荡制成1∶102的稀释液。
依此类推，分别制成1∶103、1∶104、1∶105的土壤稀释液；静置后，取0.25 mL上清液，用涂布器在LB平板上涂抹均匀，倒置于30 ℃恒温培养箱中培养2～4 d。
纯化的细菌经革兰氏染色和芽孢染色，显示菌体呈杆状、产芽孢、革兰氏阳性的分离物为芽孢杆菌[10]。
1.2.2 拮抗芽孢杆菌的筛选采用平板对峙法[11]。
将已培养3 d的病原真菌用5 mm打孔器打孔，将菌饼移到PDA培养基中央，将分离到的芽孢杆菌(已在30 ℃培养1 d)在离病原菌等距离的2个对角上接种，另2个对角上用清水作对照，28 ℃培养4 d，测量抑菌带的宽度，筛选效果最好的1株芽孢杆菌用于后续研究。
1.3 拮抗芽孢杆菌的抑菌活性1.3.1 对菌丝生长的影响制备拮抗芽孢杆菌发酵培养滤液时，将拮抗芽孢杆菌接种于装有50 mL LB液体培养基的三角瓶中，30 ℃、220 r/min振荡培养48 h。
收集发酵液，离心(10 000 r/min，4 ℃)，将上清液用0.22 μm滤膜过滤除菌即可得到无菌发酵液。
采用菌丝生长速率法[12]，检测拮抗芽孢杆菌对番茄灰霉病菌、稻瘟病菌、辣椒疫霉病菌、苹果轮纹病菌、小麦根腐病菌、棉花枯萎病菌等供试病原真菌菌丝生长的影响。
在无菌条件下，取制备好的芽孢杆菌无菌发酵液1 mL和融化的PDA培养基9 mL混匀，在无菌培养皿中制成含发酵液的平板培养基，以不加发酵液的培养基为对照，在每个培养基表面放入1个直径5 mm的供试病原真菌菌饼，每处理3次重复，28 ℃恒温培养3～4 d后，十字交叉法测量菌落直径，计算菌丝生长抑制率：菌丝生长抑制率=(对照菌落直径-处理菌落直径)/对照菌落直径×100%。
毒力测定时，将制备好的芽孢杆菌无菌发酵液，在无菌条件下用融化的PDA培养基依次配制成含0，5，10，20，50，100 mL/L发酵液的平板培养基，参照文献[12]的方法测定拮抗芽孢杆菌无菌发酵液对菌丝生长的毒力(EC50)。
1.3.2 对孢子萌发的影响采用孢子萌发法[13-15]，检测拮抗芽孢杆菌对供试病原真菌孢子萌发的影响。
取供试番茄灰霉病菌和稻瘟病菌孢子配成适当稀释度的孢子悬液(100倍显微镜下，每个视野中可看到100个孢子)，将拮抗菌无菌发酵液与孢子悬浮液等体积混合，取1滴滴加在表面用火棉胶处理过的盖玻片上，使液滴倒悬在保湿小环境中，每处理重复3次，以清水为对照。
28 ℃下培养8～10 h后检查对照处理的孢子萌发情况(以孢子芽管长度大于孢子半径者判为萌发)，统计萌发率。
当对照处理孢子的萌发率达到80%后，统计各处理的孢子萌发率，计算孢子萌发抑制率：孢子萌发抑制率=(对照孢子萌发率-处理孢子萌发率)/对照孢子萌发率×100%。
在显微镜下观察拮抗芽孢杆菌无菌发酵液对病原菌孢子萌发的影响。
毒力测定时，在无菌条件下，制备拮抗芽孢杆菌发酵液分别为0，50，100，200，500 mL/L的供试病原真菌孢子悬浮液，参照文献[13-15]的方法测定拮抗菌无菌发酵液对孢子萌发的毒力(EC50)。
1.3.3 对病原真菌菌丝形态的影响采用平板对峙法[16]，检测拮抗芽孢杆菌对供试病原菌菌丝形态的影响。
在PDA平板中央接番茄灰霉病菌菌饼，在距平板中心3 cm的两侧接拮抗芽孢杆菌，28 ℃倒置培养3 d。
观察靠近拮抗芽孢杆菌抑菌圈边缘的菌丝生长情况，以远离拮抗芽孢杆菌的边缘菌丝块为对照，显微镜下观察病原菌菌丝形态的生长情况。
1.4 拮抗芽孢杆菌的鉴定(1) 菌体形态、培养特征观察及生理生化指标测定。
参照柳凤等[17]的方法。
(2) 16S rDNA 序列分析与系统进化树的构建。
参照Todorov等[18]的方法。
以提取的拮抗芽孢杆菌基因组DNA为模板，以7f (5′-CAGAGTTTGATCCTGGCT-3′) 和1540r (5′-AGGAGGTGATCCAGCCGCA-3′)为上、下游引物扩增菌株的16S rDNA，PCR产物经10 g/L琼脂糖凝胶电泳检测后，送上海生工生物工程有限公司测序，测序结果用BLAST软件在GenBank中进行同源性比较，并提交注册登录号。
以Clustal X进行多序列比对后，用MEGA 5.0的Neighbor-Joining法构建系统发育树，并进行1 000次Bootstraps检测。
1.5 数据分析采用SPSS16.0软件中的Duncan方法对所有试验数据进行分析。
2 结果与分析2.1 拮抗芽孢杆菌的筛选从福建、四川、陕西等省耕作地采集的30份土壤样品中分离得到273株芽孢杆菌。
经番茄灰霉病菌、稻瘟病菌、辣椒疫霉病菌、苹果轮纹病菌、棉花枯萎病菌、小麦根腐病菌等病原真菌筛选后，得到抗真菌活性较强的芽孢杆菌3株，其中LW-6-1菌株对番茄灰霉病菌的拮抗活性较好(图1)，故后续试验均以LW-6-1菌株为供试拮抗芽孢杆菌。
图1 LW-6-1对番茄灰霉病菌菌丝的拮抗作用Fig.1 Antimicrobial activity ofLW-6-1 against B.cinerea2.2 LW-6-1的抑菌活性2.2.1 对菌丝生长的抑制作用从表1可以看出，LW-6-1菌株无菌发酵液对供试番茄灰霉病菌、稻瘟病菌、辣椒疫霉病菌、苹果轮纹病菌、棉花枯萎病菌、小麦根腐病菌的菌丝生长均有明显的抑制作用，其中对番茄灰霉病菌、稻瘟病菌和辣椒疫霉病菌菌丝生长的抑制效果较好，抑制率分别为95.34%，92.56%和92.34%，EC50分别为10.18，10.84和11.32 mL/L。