马铃薯病毒种类及主要病毒检测方法

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马铃薯检测

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马铃薯检测【导语】马铃薯检测是什么?马铃薯检测对于我们有什么作用?目前人们越来越关注马铃薯检测方面的知识和信息,因为马铃薯检测关系到我们生活的方方面面,那么今天小编就针对马铃薯检测这个话题,给大家针对性的介绍一些马铃薯检测相关的知识:马铃薯在我国广泛种植,已成为仅次于水稻、小麦、玉米的第四大粮食作物。

然而在当前的马铃薯生产中,病毒病发生普遍而严重,成为制约马铃薯产业发展的主要障碍,是生产上亟待解决的突出问题。

对于马铃薯产业的参与者而言,细菌、真菌及病毒的检测和识别十分重要。

本文从病毒种类及相应检测方法进行简要介绍。

1 马铃薯主要病毒种类及致病症状222.png2 马铃薯病毒主要检测方法2.1 酶联免疫吸附检测法酶联免疫吸附法(Enzyme linked immunosorbentassay, ELISA)是把抗原-抗体的免疫反应与酶的催化反应相互结合而发展起来的一种综合性技术。

该技术是在不影响酶活性和免疫球蛋白分子的反应条件下, 使酶分子和免疫球蛋白分子共价结合成酶标记抗体。

酶标记抗体可直接或通过免疫桥与包袱在固相支持物上待测定的抗原或抗体特异性结合,来检测病毒的存在。

ELISA具有特异强、灵敏度高、操作简便、易于观察等优点, 非常适合于大规模检测, 适于脱毒苗的检测。

方法经济简便,快速直观,但其也存在一定的缺点:(1)抗体的制备所需时间长,费时费力;(2)一次只能检测一种病毒,检测多种病毒时灵敏度降低;(3)对于蚜虫传播的病;有一些在植物上第一年不表现症状,病毒繁殖量少,无法用ELISA方法检测;(4)检测病毒时还经常存在假阳性反应,给脱毒种薯(苗)的检测带来困难。

2.2 PCR检测法近来,由于PCR检测的特异性和灵敏性,被广泛运用于许多细菌、真菌、病毒和类病毒的检测。

但是,运用普通的PCR分析仪检测多种病原菌时,不仅十分耗时,而且对实验室条件要求严格且需要很长的反应设置时间,易造成人为误差。

马铃薯主要病毒

马铃薯主要病毒
• 症状还可分为局部或系统症状。局部症状出现在接种的部 位或初侵染的植株部分。
• 三、影响马铃薯侵染和症状发生的因素
• (一)寄主基因型(Host genetype)
• 马铃薯普通栽培种亚种(tuberosum)和马铃薯安第斯亚 种(andigena)上的马铃薯卷叶病毒(PRLV)的表现。
• 在某一特殊的病毒侵染的栽培品种没表现出症状,可能是 受寄主基因型控制。受侵染而无症状的植株,对其产量无 显著的影响,这种情况称为耐病性(toletance),受侵染 的植株称之为无症状带毒者(asymptomatic carrier)。
• 常见的马铃薯病毒病症状类型(俗称马铃薯退化类型)有 花叶、卷叶、束顶、矮生四个。花叶类型中有各式各样花 叶症状,其致病毒原复杂。而另三个类型(卷叶、束顶、 矮生)的病原虽较单纯,但常与花叶型的病毒复合侵染, 呈综合症状。其中矮生型病株,除某种病原的特定症状外, 有时一些抗病性弱的马铃薯品种,如果被多种病原侵染, 发病严重,导致植株生育停滞,从而造成植株矮缩现象。
• 其他原因也能引起类似病毒病症状,如遗传异常、非虫害 和病原引起的生理异常以及由其他虫害或致病因子引起的 异常。
• 大多数情况下,病毒通过受感染植物所表现的症状而表达。
• 马铃薯受病毒侵染后会产生各种不同的症状,这些症状的 发生取决于受病毒及其株系侵染的植物基因型,病毒与寄 主发生反应时所处的环境条件。环境因素很多,包括自然 条件,有机体之间的相互作用及生物因素。
• (六)形状、质地等的畸形
• (Deviations of shape,texture,etc)
• 1.纺锤形块茎(Spindle tuber) • 2.过长(Elongation) • 3.气生薯(Aerial tubers) • 4.过度生长(Overgrowths) • 5.开裂(Cracking) • 6.软化(Flaccidity) • 7.对数量和大小的影响(Effect on number and size)

浅析马铃薯病毒检测技术

浅析马铃薯病毒检测技术

马铃薯是我国重要的粮食作物和经济作物,马铃薯在定西市种植也有200多年的历史,在保障全市粮食有效供给和繁荣城乡经济中发挥了十分重要的作用,已由过去的“救命粮”变成了现在的“致富薯”,是定西最具生产潜力、市场优势和开发前景的特色农产品,也是农业增效、农民增收的第一大优势产业。

近年来,定西市委、市政府对马铃薯产业高度重视,作为全市农业和农村经济发展的战略性主导产业来扶持,制定了“全市马铃薯产业发展规划”,省上也制定下发了“关于进一步加快发展马铃薯产业的意见”,提出了工作思路和具体目标,促进了本市马铃薯产业的快速发展。

2013年全市种植面积达到319.84万亩,总产量506万t,是全国三大马铃薯集中产区之一。

但是由于定西经济条件落后,全市的马铃薯种薯的病毒检测并未随着种植面积的扩大而提高和普及,以至于马铃薯各种病每年在生长期发生,严重影响了全市马铃薯的产量和质量。

马铃薯病毒已成为马铃薯生产中的重要制约因素,急需大力提高马铃薯种薯的病毒检测,为马铃薯产业的持续快速发展把好第一增长关。

马铃薯病毒检测包括:基础试管苗、马铃薯原原种、大田种薯的检测。

严格的检测大大提高了种薯合格率,而种植合格的种薯,每亩可以提高产量500kg 以上。

马铃薯的病毒有6种,分别是马铃薯X病毒(PVX)、马铃薯Y病毒(PVY)、马铃薯S病毒(PVS)、马铃薯A病毒(PVA)、马铃薯M病毒(PVM)、马铃薯卷叶病毒(PLRV)。

目前最常用的马铃薯病毒检测是用双抗体夹心酶免疫吸附测定法(DAS-ELISA)检测,是用于快速、灵敏、准确的血清学技术,是国际通用的检测方法之一。

下面就本市引进的“马铃薯病毒DAS-ELISA检测”全套生产技术进行浅述。

1马铃薯病毒的概况1.1马铃薯X病毒(PVX)也称普通花叶病毒,是一种长520~550nm的线状病毒,有时在电镜下能看到病毒颗粒的中心孔。

在病毒外壳由亚基形成时,可看到它的横纹,这一点是与马铃薯重花叶病毒在形态结构上的主要区别。

马铃薯六种主要病毒通用RT-PCR检测体系的建立

马铃薯六种主要病毒通用RT-PCR检测体系的建立

马铃薯六种主要病毒通用RT-PCR检测体系的建立张威;白艳菊;景芝;范国权;高艳玲;申宇;张抒;孟宪欣;王军【摘要】马铃薯X病毒(PVX)、马铃薯Y病毒(PVY)、马铃薯S病毒(PVS)、马铃薯卷叶病毒(PLRV)、马铃薯M病毒(PVM)和马铃薯A病毒(PVA)是马铃薯生产田中发生率较高、危害较严重的病毒,因此,建立特异性强、灵敏度高、检测速度快的RT-PCR分子检测体系对保障马铃薯种薯质量具有非常重要的意义。

试验筛选了6种病毒的特异引物、优化了PCR部分的试剂以及确定了退火温度。

结果表明,当Mg2+浓度为2.6 mmol/L、dNTPs浓度为0.1mmol/L、Taq DNA聚合酶浓度为0.03 U/μL,以及退火温度为55.5℃时反应体系最稳定。

最终,建立了一套通用RT-PCR检测体系,只需要变换每种病毒的引物,就可以实现对PVX、PVY、PVS、PLRV、PVM和PVA病毒的RT-PCR检测。

每种病毒检测灵敏度均能达到pg以上。

%The higher incidence and more serious viruses in potato fields are potato virus X (PVX), potato virus Y (PVY), potato virus S (PVS), potato leafroll virus (PLRV), potato virus M (PVM), and potato virus A (PVA), so it is very important to guarantee the quality of seed potato by establishment of RT-PCR molecular detection system with specificity, high sensitivity and fast detection speed for these viruses. In this research, the primer for each virus was screened, PCR reagents were optimized, and annealing temperature was determined. The results indicated that when the concentration of Mg2 + was 2.6 mmol/L, dNTPs was 0.1 mmol/L, Taq DNA polymerase was 0.03 U/μL, and annealing temperature was 55.5℃, the reaction system was the most stable. Finally, a universal RT-PCR detection system was established, which only need tochange primer for each virus when the RT-PCR detection for PVX, PVY, PVS, PLRV, PVM and PVA was needed. The detection sensitivity of each virus could reach the level of pg.【期刊名称】《中国马铃薯》【年(卷),期】2015(000)004【总页数】6页(P222-227)【关键词】马铃薯;PVX;PVY;PVS;PLRV;PVM;PVA【作者】张威;白艳菊;景芝;范国权;高艳玲;申宇;张抒;孟宪欣;王军【作者单位】黑龙江省农业科学院植物脱毒苗木研究所,黑龙江哈尔滨 150086;黑龙江省农业科学院植物脱毒苗木研究所,黑龙江哈尔滨 150086;东北农业大学农学院,黑龙江哈尔滨 150030;黑龙江省农业科学院植物脱毒苗木研究所,黑龙江哈尔滨 150086;黑龙江省农业科学院植物脱毒苗木研究所,黑龙江哈尔滨150086;黑龙江省农业科学院植物脱毒苗木研究所,黑龙江哈尔滨 150086;黑龙江省农业科学院植物脱毒苗木研究所,黑龙江哈尔滨 150086;黑龙江省农业科学院作物育种研究所,黑龙江哈尔滨 150086;北大荒垦丰种业股份有限公司,黑龙江哈尔滨 150090【正文语种】中文【中图分类】S532马铃薯是世界上最重要的粮食作物之一,具有分布范围广、适应性强、产量高、用途广等特点。

马铃薯病毒种类及主要病毒检测方法

马铃薯病毒种类及主要病毒检测方法

马铃薯病毒种类及主姜病毒检测方法•农学论文马铃薯病毒种类及主要病毒检测方法罗燕娜,刘江娜,王航(兵团第六师农业科学研究所,新疆五家渠831300 )收稿日期:2 015—01—20摘要:本文对:Ibli地区马铃薯主要病莓的特性和致病症状逬行了描述”并简要介绍了马铃薯主要病毒的检测技术。

关键词:马铃薯;病莓;检测方法马铃薯在我国广泛种植,已成为仅次于水稻、小麦、玉米的第四大粮食作物。

由于光照强、昼夜遍差大、气候冷凉等优势,新疆北疆沿天山一带的昌吉州、乌鲁木齐、昭苏、新源等地都非常适宜种植马铃薯,现种植面积已达2310hm2[l].然而在当前的马铃薯生产中,病壽病发生普遍而严重,成为制约马铃薯产业发展的主要障碍,是生产上亟待解决的突出问题[2]。

目前,已报道的马铃薯病毒种类超过25种、类病壽1种,其中,侵染乌鲁木齐地区马铃書的主要病原病莓有PVX、PVY、PVA、PLRV,类病莓为PSTVd。

主要检测的马铃薯病毒有马铃薯X病毒(PVX X马铃薯Y病量PVY 1马铃S S病頡PVS \马铃薯M病毒(PVM \马铃薯卷叶病毒(PLRV )及马铃薯纺锤块茎类病莓(PSTVd )⑴。

1马铃薯主要病莓种类及致病症状1.1马铃薯X病毒(PVX)X病莓又称普通花叶病莓,病莓粒子为长杆状,大小为515nmxl3nm ,基因组全长6.4kb[3]。

该病莓可通过叶片汁液摩擦传播,也可通过蜗虫以非持久性方式传播,还可通过种暮传播[1]。

感病植株症状多种多样,因栽培品种的敏感性不同和病莓株系的不同而存在差异,多数表现为轻花叶或潜隐症状,症状严重的则表现为严更的花叶或皱缩,产量损失可达50%。

1.2马铃薯Y病毒(PVY)Y病莓又称为重花叶病莓,病莓粒子形状为弯曲的线形,大小为750nmxllnm ,多数通过桃妈和大戟长管妈传播。

PVY包括3个株系组:马铃薯Y病毒普通株系组(PVYO X马铃薯点条斑株系(PVYC )和马铃薯Y病毒褐脉株系(PVYN L前2个株系组引起的主要初期症状是叶片坏死、斑驳,后期则表现为矮化、皱缩、斑驳和卷曲;第3个株系组初期表现为不同程度的花叶, 后期为花叶和斑驳,当溫度低于10°C或高于25°C时,花叶症状消失。

马铃薯土豆十大病害高效防治方案

马铃薯土豆十大病害高效防治方案

引言概述:马铃薯是一种重要的经济作物,但由于其种植密度高、气候变化等原因,容易受到各种病害的侵袭,严重影响产量和质量。

为了高效防治马铃薯病害,本文将针对十种常见的马铃薯病害,提供相应的防治方案,包括预防措施、病害检测和治疗方法等。

正文:1.马铃薯早疫病种植抗早疫病品种合理灌溉和施肥,保持土壤水分和养分平衡定期巡视、病害监测和早期预警系统引入保护性病害防治技术,如草铵盐喷雾等如发现病害,立即采取防治措施,如喷洒杀菌剂2.马铃薯晚疫病选择抗晚疫病品种进行种植加强病害监测,及时发现病害症状采用适当的灌溉方法,避免病害传播注意病害传播途径,如果实等,采取相应防治措施如出现病情严重的情况,可以考虑实施土壤消毒等措施3.马铃薯黑斑病剪除黑斑病患部,及时清除病叶保持适宜的湿度和通风,避免病害扩散使用酒精、氯化钠等消毒工具,减少病害传播使用高效杀菌剂进行防治,如丁硫菌灵、多菌灵等加强农田管理,清除受病菌污染的残茬4.马铃薯炭疽病选择抗炭疽病品种进行种植加强炭疽病病害监测和防控预警控制湿度和通风,避免病害扩散定期剪枝和除草,保持农田整洁如发现病害,及时喷洒炭疽病防治剂,如金龙菌可湿性粉剂等5.马铃薯病毒病选择病毒抗性强的品种进行种植加强病毒检测和防控预警设置隔离区和有效隔离措施,避免病毒传播定期清除病叶和病株,减少病毒源如发现病毒病害,采用病毒防治剂,如多玛立匹特等总结:马铃薯是重要的经济作物,但容易受到多种病害的侵袭。

为了高效防治马铃薯病害,在种植阶段选择抗病品种,并加强病害监测和预警。

合理的灌溉和施肥、定期巡视、隔离区设置以及合理使用防治剂等措施也是高效防治马铃薯病害的重要步骤。

通过采取综合防治措施,能够有效提高产量和质量,保障马铃薯种植的顺利进行。

马铃薯三种主要病毒的ELISA和RT-PCR检测技术的研究

马铃薯三种主要病毒的ELISA和RT-PCR检测技术的研究

马铃薯三种主要病毒的ELISA和RT-PCR检测技术的研究马铃薯是世界上重要的食物作物之一,也是我国主要的经济作物之一。

然而,马铃薯生产中常常受到病毒的威胁。

病毒感染会导致马铃薯产量下降、品质降低甚至全面减产。

因此,准确快速地检测病毒感染对于指导马铃薯的种植和防控病害具有重要意义,可以提供科学依据、减少经济损失和保证农作物的质量安全。

马铃薯主要受到三种病毒的感染,分别是马铃薯病毒Y (Potato Virus Y, PVY)、马铃薯块茎坏死病毒 (PotatoVirus X, PVX)和马铃薯花叶病毒 (Potato Leafroll Virus, PLRV)。

传统的病毒检测方法包括生物学观察法、传统PCR等。

然而,这些方法存在耗时、复杂、低灵敏度等问题。

因此,研究人员对使用ELISA和RT-PCR等技术进行马铃薯病毒检测进行了深入研究。

ELISA法是一种高效的酶联免疫吸附法,利用抗原与特异抗体结合,通过比色反应检测样品中是否存在目标病毒。

ELISA方法具有高度敏感性和特异性,且结果易于观察和分析。

针对马铃薯病毒检测,研究人员首先制备了目标病毒的抗原,并将其与马铃薯样品中的病毒结合,然后添加酶标记的二抗,形成抗原-抗体-酶标记-底物复合物。

最后,通过添加酶底物,观察是否有颜色反应产生。

ELISA法不仅操作简便、检测速度快,而且可以批量检测多个样品。

但是,ELISA法的敏感性对样品前处理和样品质量要求较高。

与ELISA法相比,RT-PCR法可以在基因水平上对目标病毒进行检测。

RT-PCR法首先需要提取马铃薯样品中的总RNA,然后通过反转录将RNA转化为cDNA,再进行聚合酶链反应扩增。

PCR反应中使用特异引物,使得目标病毒的RNA序列扩增得到特异性产物,经过电泳分析可以确定是否存在目标病毒。

RT-PCR法具有快速、准确、高灵敏度和高特异性等优点,可以在较短的时间内对多个样品进行检测。

但是,RT-PCR法技术门槛较高,操作复杂,需要专业的实验室和设备。

马铃薯主要病毒及检测研究进展

马铃薯主要病毒及检测研究进展

马铃薯主要病毒及检测研究进展作者:陈晓艳齐恩芳贾小霞张武来源:《南方农业·下旬》2015年第09期摘要马铃薯是无性繁殖作物,常因病毒侵染而造成病毒在植株体内累积,造成种性退化,品质和产量下降。

基于此,讲述了马铃薯的几种常见病毒病,并对常用的病毒检测方法进行评价。

为保证马铃薯种薯质量,促进马铃薯主粮化、优化农业结构提供技术指导。

关键词马铃薯;病毒检测中图分类号:S435.72 文献标志码:B 文章编号:1673-890X(2015)27--04马铃薯具有分布范围广、适应性强、产量高和用途广泛等特点,是全球公认的全营养食物。

随着我国马铃薯主粮化战略的启动,对保障国家粮食安全、顺应国人营养需求、缓解资源环境压力,有着其他作物不可替代的作用。

但马铃薯在生长期间易受多种病毒病侵染造成病毒性退化,使马铃薯的品质和产量受到影响,造成的损失巨大。

现已研究出的侵染马铃薯的病毒有40多种[1],危害我国马铃薯产区的主要病毒有马铃薯PVX、PVS、PVY、PVA、PVM、PLRV和PSTV[2,3]。

这些病毒严重影响马铃薯的产量及品质。

因此,马铃薯病毒的研究也成为各国研究的重点,马铃薯病毒的检测成为马铃薯种薯繁育中的重大难题。

1 影响马铃薯的主要病毒类型1.1 马铃薯X病毒(Potato Virus X,PVX)马铃薯X病毒为害症状因品种、病毒株系以及环境条件的不同,有些株系在冷凉条件下,叶片出现轻微花叶,继而发展成为褪绿斑、坏死性条斑,有的上部叶畸形,叶缘呈锯齿等症状;晴朗天气,明脉、轻微花叶症状可减轻,甚至完全消失;有些株系,在高温条件下不表现症状,呈隐症现象。

PVX是由一条正链RNA组成的线性病毒,RNA 3,末端是多聚腺嘌呤核苷酸,5,末端有m7GppG“帽子”结构[4]。

PVX单独侵染马铃薯可减产15%左右,PVX可与多种病毒复合侵染,严重时造成马铃薯绝收。

1.2 马铃薯Y病毒(Potato Virus Y,PVY)马铃薯Y病毒病(PVY)的田间症状复杂多变,不同的病毒株系引致的症状差异较大,初期出现明脉症状,后形成系统斑驳,叶脉两侧组织呈绿色带状斑,叶片基部症状较为明显,病叶侧脉呈灰褐色坏死,表现脉和茎的变褐坏死。

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马铃薯病毒种类及主要病毒检测方法作者:罗燕娜,刘江娜,王航来源:《新疆农垦科技》 2015年第3期罗燕娜,刘江娜,王航(兵团第六师农业科学研究所,新疆五家渠831300)收稿日期:2015—01—20摘要:本文对北疆地区马铃薯主要病毒的特性和致病症状进行了描述,并简要介绍了马铃薯主要病毒的检测技术。

关键词:马铃薯;病毒;检测方法马铃薯在我国广泛种植,已成为仅次于水稻、小麦、玉米的第四大粮食作物。

由于光照强、昼夜温差大、气候冷凉等优势,新疆北疆沿天山一带的昌吉州、乌鲁木齐、昭苏、新源等地都非常适宜种植马铃薯,现种植面积已达2310hm2[1]。

然而在当前的马铃薯生产中,病毒病发生普遍而严重,成为制约马铃薯产业发展的主要障碍,是生产上亟待解决的突出问题[2]。

目前,已报道的马铃薯病毒种类超过25种、类病毒1种,其中,侵染乌鲁木齐地区马铃薯的主要病原病毒有PVX、PVY、PVA、PLRV,类病毒为PSTVd。

主要检测的马铃薯病毒有马铃薯X病毒(PVX)、马铃薯Y病毒(PVY)、马铃薯S病毒(PVS)、马铃薯M病毒(PVM)、马铃薯卷叶病毒(PLRV)及马铃薯纺锤块茎类病毒(PSTVd)[1]。

1马铃薯主要病毒种类及致病症状1.1马铃薯X病毒(PVX)X病毒又称普通花叶病毒,病毒粒子为长杆状,大小为515nm×13nm,基因组全长6.4kb[3]。

该病毒可通过叶片汁液摩擦传播,也可通过蚜虫以非持久性方式传播,还可通过种薯传播[1]。

感病植株症状多种多样,因栽培品种的敏感性不同和病毒株系的不同而存在差异,多数表现为轻花叶或潜隐症状,症状严重的则表现为严重的花叶或皱缩,产量损失可达50%。

1.2马铃薯Y病毒(PVY)Y病毒又称为重花叶病毒,病毒粒子形状为弯曲的线形,大小为750nm×11nm,多数通过桃蚜和大戟长管蚜传播。

PVY包括3个株系组:马铃薯Y病毒普通株系组(PVYO)、马铃薯点条斑株系(PVYC)和马铃薯Y病毒褐脉株系(PVYN)。

前2个株系组引起的主要初期症状是叶片坏死、斑驳,后期则表现为矮化、皱缩、斑驳和卷曲;第3个株系组初期表现为不同程度的花叶,后期为花叶和斑驳,当温度低于10℃或高于25℃时,花叶症状消失。

产量损失最高可达80%。

通常该病毒不会引起块茎发病,但近年来欧洲出现的一个新株系PVYNTN,则可在块茎上导致坏死环斑[4]。

1.3马铃薯A病毒(PVA)A病毒又称为轻花叶病毒,病毒粒体为弯曲的线形,大小为730nm×15nm,基因组全长9.7kb。

该病毒可通过汁液摩擦传播或由蚜虫以非持久性方式传播,也可通过种薯传播。

感病植株的症状表现为脉间花叶、叶片有光泽、叶脉深陷和叶边缘粗缩,产量损失可达40%。

1.4马铃薯S病毒(PVS)S病毒又称为潜隐性花叶病毒,病毒粒子形状为线形,大小为650nm×12nm,病毒基因组全长7.4kb。

可通过汁液摩擦传播,也可通过蚜虫传播。

感病植株初期症状不明显,严重危害时,叶片呈青铜色,叶脉轻微下陷,植株的开张度较大。

一些品种上会出现坏死斑和条纹。

在田间常与其他病毒混合侵染,当与PVX或PVM病毒混合侵染时,可减产20%~30%[5]。

1.5马铃薯M病毒(PVM)M病毒也属于香石竹潜隐病毒属(Carlavirus)。

病毒粒子为线形,大小为650nm×12nm,该属病毒基因组全长8.5kb。

可通过机械传播,或者通过蚜虫以非持久性方式传播,也可通过种薯的调运远距离传播。

感病植株叶上表面的叶脉深陷,有的出现粗缩,叶片轻微下垂,顶部叶片呈开散状。

1.6马铃薯卷叶病毒(PLRV)PLRV属于马铃薯卷叶病毒属(Polerovirus),病毒粒子为六边形等轴对称,直径24nm~26nm,基因组全长5.9kb。

主要由蚜虫传播,也可通过种薯传播。

感病植株发病较轻时表现为幼叶褪绿、卷曲,叶基常有紫红色边缘。

发病较重时,植株矮化,叶片上卷并革质化,产量损失可达70%[1]。

2马铃薯病毒检测方法因马铃薯茎尖脱毒培养过程中各环节都会有误差,所以在茎尖苗扩繁之前必须对马铃薯苗进行严格的病毒学检测,确定不带病毒后才能进一步扩繁。

除此之外,还必须抽样检查以下几种情况:瓶苗下地之前、组培苗扦插结束、试管薯出苗后30~40d、现蕾期至盛花期、收获前30d左右、收获后和种薯出库前。

因此,在马铃薯脱毒种薯培育过程中,准确可靠的病毒检测方法与高效的脱毒方法同等重要[6]。

目前,北疆地区常用的马铃薯病毒检测方法是酶联免疫吸附法(双抗体夹心法(DAS-ELISA))。

该检测方法的主要操作过程有以下几步。

2.1准备工作实验前,在设计图表上注明各反应孔的位置,以避免出错。

在密封塑料盒底部铺1张吸水纸,倒入适量蒸馏水使之刚好润湿,即为恒湿箱,孵育用。

微孔板为可拆卸,根据用量取出所需数量的微孔,未使用完的微孔密封好,4℃下保存。

2.2样品的提取及稀释尽可能选择出现症状的植物组织作为样品,通常将叶片作为ELISA实验的检测样品,其它植物组织也可用于ELISA实验。

使用通用样品提取缓冲液来碾磨稀释样品。

若用研钵提取样品,在每份样品提取后彻底清洗研钵,以免造成样品间的相互污染。

将样品与通用样品提取缓冲液以1∶10(样品重量(g)∶提取缓冲液体积(mL)的比例研磨样品。

每个反应孔需要100μL的样品提取稀释液。

多制备一些样品提取稀释液以利于吸取。

2.3点样根据实验设计,取100μL样品提取稀释液到各样品孔中,取100μL阴性质控物溶液到阴性对照孔中,取100μL阳性质控物溶液到阳性对照孔中。

2.4准备酶标结合物检测抗体和酶标抗体均为浓缩液体,应根据标签上的稀释倍数用ECM缓冲液稀释。

根据酶标记物标签上的稀释倍数将酶标记物和检测抗体(瓶A和瓶B)加到1倍的ECM缓冲液中,混合均匀。

1μL的检测抗体稀释液可供8个反应孔使用,10μL的酶标记物稀释液可供96个反应孔使用。

2.5洗板孵育结束后,将反应孔中的试剂倒出,加入250μL的1倍PBST缓冲液,之后快速倒出,重复7次,将微孔板倒扣在吸水纸上以控干孔中残留液体。

2.6加酶标结合物在各反应孔中加入100μL配置好的酶标结合物溶液。

2.7孵育室温下(25℃)在恒湿箱中孵育2h。

2.8PNP底物的制备孵育结束前15min制备PNP底物溶液。

在室温下用5mLPNP缓冲液溶解1片PNP底物片。

每片PNP底物片可溶解成5mL的底物溶液,溶解比例为1mg/mL,可供40个反应孔使用。

在室温下用5mLPNP缓冲液(1倍浓度)溶解1片PNP底物片。

2.9洗板、加PNP底物溶液洗板步骤同2.5,重复8次。

在各反应孔中加入100μLPNP底物溶液。

2.10孵育在恒湿箱中孵育60min,避免阳光直射或强光照射。

2.11结果分析直接用肉眼观察或用酶标仪在405nm波长下测量结果。

阳性结果:微孔中有明显颜色变化;阴性结果:微孔中没有明显颜色变化。

只有在阳性质控孔得到阳性结果的时候,实验结果才是可靠的。

结果可保持1h左右(只要阴性质控孔不发生颜色变化)。

3结语建议种薯加工企业在3个环节上进行质量检验:(1)核心种苗必须进行病毒检测,检测方法可采用DAS-ELlSA。

(2)田间检验。

全部植株目测检查3次,目测不能确诊的非正常植株采集样本进行实验室检验,种薯每批次至少随机抽检5~10点,每点100株,各指标可参照GB18133-2012标准[7]。

(3)块茎检验包括收获后检测和库房检验,原原种每个品种每100万粒检测200粒,大田每批种薯根据生产面积确定检测样品数量,种薯出库前应进行库房检查,抽样及检验样品数量参照GB18133-2012标准,并采用目测法检测窖藏病害及混杂等情况。

目前,应用于马铃薯病毒的免疫学检测技术以ELISA技术最成熟,应用最广泛。

多年来,这项技术被不断改进和创新,现已形成直接酶联检测法、间接酶联检测法(I-ELISA)、双抗体夹心法(DAS-ELISA)、三抗体夹心法(TAS-ELISA)等多种检测方法[8]。

双抗体夹心法(DAS-ELISA)与其他检测方法相比较,有突出的优点:一是灵敏度高,检测浓度可达l~10ng/mL;二是快速,几个小时内即可出结果;三是专化性强,重复性好;四是检测对象广,粗汁液或提纯液都可检测,一般不受抗原形态的影响,无论是完整的还是降解的病毒粒体都可检测;五是可处理大批样品,适合种薯生产中大量样品的多种马铃薯病毒的快速检测。

但也存在一些缺点:检测病毒时会出现假阳性反应,准确性降低;病毒浓度低,当年不显症时无法检测;无法检测类病毒。

参考文献[1]董代幸.乌鲁木齐地区马铃薯病毒和类病毒的分子鉴定及检测技术研究[D].新疆农业大学,2010.[2]李济宸,唐玉华,谭宗九,等.马铃薯病害及其防治[M].石家庄:河北科学技术出版社,1992.[3]王春香,高谦,潘乃穟,等.马铃薯X病毒外壳蛋白基因的cDNA克隆和全序列测定[J].植物学报,l991,33(5):363-369.[4]李入贤,张文龙,施文娟.马铃薯脱毒种薯(苗)病毒检测技术研究进展[J].种子,2009,28(4):60-62.[5]吴兴泉,吴祖建,谢联辉,等.马铃薯S病毒外壳蛋白基因的克隆与原核表达[J].中国病毒学,2002,17(3):248-251.[6]聂峰杰,张丽,宋玉霞,等.宁夏马铃薯脱毒种薯生产及病毒检测技术的现状和发展途径[J].中国种业,2014(7):17-21.[7]王怀栋,黄修梅,李明.浅谈马铃薯脱毒种薯质量控制[J].黑龙江农业科学,2012(3):116-119.[8]毛彦芝.马铃薯病毒检测技术的研究概况[J].中国蔬菜,2009(12):1-6.。

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