乌司他丁预防重症中暑小鼠早期肠粘膜屏障功能损害的实验研究
乌司他丁通过维护糖萼的完整性从而对LPS诱导的ARDS小鼠的保护作用及其机制的研究
乌司他丁通过维护糖萼的完整性从而对LPS诱导的ARDS小鼠的保护作用及其机制的研究[目的]急性呼吸窘迫综合征(ARDS)是一种急性呼吸衰竭的综合征,毛细血管通透性增加是其主要的临床病理表现。
糖萼位于毛细血管的表面,是决定毛细血管通透性的重要组成部分。
硫酸乙酰肝素(HS)是糖萼的重要组成部分,乙酰肝素酶(HPA)在降解HS方面起到重要作用。
我们的研究目的就是测定乌司他丁(UTI)对由脂多糖(LPS)引起的肺毛细血管通透性增加和肺的内皮糖萼功能紊乱。
另外UTI可以降低乙酰肝素酶(50kDa)的表达和活性,同时我们也研究了溶酶体pH对乙酰肝素酶的影响因为当脂多糖进入到溶酶体中时,可以引起溶酶体中pH的降低,在溶酶体低pH的环境下HPA很容易从没有活性的(65kDa)状态转变为有活性的(50kDa)状态,UTI可以抑制溶酶体中pH的降低。
基于以上研究成果,本实验旨在探讨LPS诱导的ARDS小鼠模型中,UTI对抑制HPA的活性和保护糖萼免受炎症损伤方面的作用,为ARDS的临床诊疗提供新的理论依据。
[方法]体内实验:把成年健康的雄性C57BL/6小黑鼠24只随机分成3组:正常组(control 组)、模型组(LPS 组 20mg/kg)、治疗组(UTI+LPS 组,UTI:100,000 U/kgi.p),治疗组在注射脂多糖之前提前一个小时注射乌司他丁,在腹腔注射LPS六小时后取血和肺保存备用。
检测小鼠肺湿干比值,肺组织HE染色及病理学评分,50kDa中的表达。
体外实验:把人脐静脉内皮细胞分成三组,正常组、模型组(LPS组,1μg/mL)、治疗组(UTI+LPS组,UTI:1000U/mL),利用免疫荧光测定细胞用伊文斯兰染色法测量肺毛细血管的通透性,用酶联免疫吸附法(ELISA)测定HPA的活性和降解产物HS的含量。
用Western Blot技术检测HPA在65kDa和中HS的含量,利用western blot测定细胞中HPA的含量,测定细胞中pH的含量。
乌司他丁对重症中暑小鼠急性肺损伤的保护作用
乌司他丁对重症中暑小鼠急性肺损伤的保护作用周耿标;徐秋林;刘亚楠;王郑莲;郭晓华;苏磊【摘要】目的：探讨乌司他丁（ulinastatin, UTI）对重症中暑小鼠急性肺损伤的保护作用。
方法 SPF级雄性C57/BL6小鼠60只，随机分为6组（n=10）：正常组、重症中暑模型组、造模前给药组、造模前生理盐水组、造模后给药组及造模后生理盐水组。
正常组小鼠置于（22±1）℃的环境中，其余各组小鼠置于加温舱（温度37℃、湿度60%）持续加温，两给药组分别于造模前、后10 min腹腔注射UTI 5×104 U/kg，而两生理盐水组则腹腔注射等量的生理盐水，加热期间前1.5 h每隔30 min用水银温度计人工测定肛温（Tc）1次，之后每隔15 min测1次肛温，待Tc达42.7℃（以此作为重症中暑开始的标志）后撤离高温舱，转移至常温中复温6 h。
观察各组肺组织病理学变化，检测各组支气管肺泡灌洗液（Bronchial Alveolar Lavage Fluid, BALF）中蛋白含量、肺湿/干比（W/D）、肺含水量、肺血管通透性（伊文思蓝含量）。
结果与正常组相比，重症中暑模型组及造模前、后生理盐水组肺部损伤严重，病理形态学改变明显，肺W/D比值、肺含水量、BALF中蛋白含量及肺血管通透性均显著增加（P<0.05），且组间无显著性差异（P>0.05）；而造模后给药组与重症中暑模型组及造模前、后生理盐水组相比，其肺部病理变化明显改善，肺W/D值、肺含水量、BALF中蛋白含量及肺血管通透性显著降低，但高于正常对照组（均P<0.05），而造模前给药组小鼠Tc≥42.7℃的时间较其它热打击组明显延长，但上述肺损伤指标却未见明显改善。
结论乌司他丁对重症中暑所致肺水肿与炎性渗出具有抑制作用，能有效对抗重症中暑所致的急性肺损伤，发挥保护作用。
%Objective To investigate the protective effect of ulinastatin (UTI) against acute lung injury induced by heatstroke in mice. Methods Sixty C57/BL6 mice were randomly dividedinto 6 groups, with 10 mice in each: control group, heatstroke group, UTI pretreatment group, saline pretreatment group, UTI post-treatment group, saline post-treatment group. The control mice were housed at a controlled room temperature of (22 ± 1) ℃, and the other groups were placed inside a temperature and humidity controlled chamber pre-set at 37℃and 60%. The two UTI groups were intraperitoneally injected with UTI at 5×104 U/kg 10 min before or after heat stress, and the two saline groups were given then equal amounts of saline in the same manner. The core body temperature of mice was monitored by a mercury thermometer every 30 min in the first 1.5 h during heating. The core temperature was measured, then every 15 min until it reached 42.7℃, which was taken as the onset of heatstroke. The animals were allowed to recover passively at ambient temperature for 6 h. The lung histopathological changes, protein concentration in BALF, lung wet/dry weight ratios, lung water content, and pulmonary microvascular permeability were assayed after 6 h of recovery at 37 ℃. Results Compared with the control group, the heatstroke model group and two saline groups displayed more severe lung damage and pathological morphology changes, and the lung wet/dry weight ratio, protein concentration in BALF, lung water content and pulmonary microvascular permeability were also significantly increased. These effects were significantly alleviated in UTI treated group. Pretreat ment with UTI significantly prolonged the time to Tc≥42.7 ℃ but had no effect on lung injury induced by heatstroke. Conclusion UTI can reduce the pulmonaryedema and inflammatory exudation in acute lung injury caused by heatstroke.【期刊名称】《南方医科大学学报》【年(卷),期】2015(000)009【总页数】6页(P1277-1282)【关键词】重症中暑;乌司他丁;急性肺损伤;支气管肺泡灌洗;伊文氏蓝;肺湿干比【作者】周耿标;徐秋林;刘亚楠;王郑莲;郭晓华;苏磊【作者单位】广州中医药大学，广东广州 510405;广州军区广州总医院重症医学科，广东广州 510010;广州军区广州总医院重症医学科，广东广州 510010;广州军区广州总医院重症医学科，广东广州 510010;南方医科大学病理生理学教研室//广东省医学休克微循环重点实验室，广东广州 510515;广州军区广州总医院重症医学科，广东广州 510010【正文语种】中文中暑是一种严重威胁人民群众生命的热相关疾病，尽管当前中暑的救治措施已经取得很大进展，其死亡率仍在10%～15%。
乌司他丁对脂多糖诱导小鼠急性肾损伤的保护作用及其机制
·336·· 论著 ·乌司他丁对脂多糖诱导小鼠急性肾损伤的保护作用及其机制穆盛田，唐洁，仲宇，郑振 （中国医科大学肿瘤医院，辽宁省肿瘤医院重症医学科，沈阳 110042） 摘要 目的 观察不同剂量的乌司他丁对脂多糖 （LPS ） 诱导的小鼠急性肾损伤 （AKI ） 的保护作用及可能机制。
方法 通过腹腔注射LPS 建立脓毒症AKI 小鼠模型。
将40只SPF 级C57BL/6小鼠随机分为4组：对照组、LPS 组、LPS+5 000 U/kg 乌司他丁组和LPS+50 000 U/kg 乌司他丁组，每组10只。
观察各组小鼠血肌酐和尿素氮的浓度变化；采用HE 染色观察各组小鼠肾组织的病理变化；采用ELISA 检测各组小鼠血清中肿瘤坏死因子-α （TNF -α） 和白细胞介素-6 （IL -6） 水平以及肾组织中丙二醛 （MDA ） 和过氧化物歧化酶 （SOD ） 的浓度；采用Western blotting 和免疫组织化学方法检测各组小鼠肾组织中核因子E2相关因子2 （Nrf2） 的表达情况。
结果 与对照组比较，LPS 组小鼠血肌酐、尿素氮、TNF -α和IL -6的水平明显升高 （P < 0.05）；肾小管上皮细胞肿胀或脱落，间质水肿，肾小管明显扩张，肾组织损伤评分明显增加；肾组织中MDA 浓度明显升高，SOD 浓度明显降低，Nrf2表达水平明显增加 （P < 0.05）。
与LPS 组比较，LPS+5 000 U/kg 乌司他丁组和LPS+50 000 U/kg 乌司他丁组小鼠血肌酐和尿素氮水平明显升高 （P < 0.05），肾组织病理损伤明显改善，但LPS+5 000 U/kg 乌司他丁组与LPS+50 000 U/kg 乌司他丁组比较无统计学差异。
与LPS 组比较，LPS+5 000 U/kg 乌司他丁组和LPS+50 000 U/kg 乌司他丁组血清中TNF -α和IL -6水平以及肾组织中MDA 浓度明显降低 （P < 0.05），肾组织中SOD 浓度和Nrf2表达水平明显升高 （P < 0.05）。
《乌司他丁减轻创伤失血性休克大鼠肺炎性损伤的机制》
《乌司他丁减轻创伤失血性休克大鼠肺炎性损伤的机制》一、引言随着医学研究的不断深入，药物在治疗休克、失血及肺部损伤方面的发展尤为显著。
乌司他丁作为一种有效的抗炎及保护性药物，被广泛运用于创伤失血性休克和肺部炎性损伤的病例中。
本篇论文将针对乌司他丁减轻创伤失血性休克大鼠肺炎性损伤的机制展开研究讨论，深入探讨其作用机理及潜在的临床应用价值。
二、乌司他丁概述乌司他丁是一种丝氨酸蛋白酶抑制剂，具有广泛的生物活性，包括抗炎、抗休克、抗纤维化等作用。
其通过抑制多种蛋白酶的活性，达到减轻炎症反应、保护细胞免受损伤的目的。
三、乌司他丁减轻创伤失血性休克大鼠肺炎性损伤的机制1. 抗炎作用：乌司他丁通过抑制炎症介质的释放和炎症反应的级联过程，有效减轻炎症对机体的损伤。
在创伤失血性休克大鼠模型中，乌司他丁能够显著降低肺部炎症因子的表达水平，如前列腺素、白三烯等，从而减轻肺部的炎性损伤。
2. 抗休克作用：乌司他丁能够稳定溶酶体膜，抑制溶酶体酶的释放，从而减少组织细胞的损伤。
在失血性休克的情况下，乌司他丁能够维持机体的内环境稳定，改善微循环，为组织提供充足的氧气和营养物质，从而减轻休克对机体的损害。
3. 保护细胞免受损伤：乌司他丁能够抑制多种蛋白酶的活性，保护细胞免受损伤。
在创伤失血性休克大鼠模型中，乌司他丁能够减轻肺部细胞的凋亡和坏死，促进细胞的修复和再生。
四、实验研究通过建立创伤失血性休克大鼠模型，观察乌司他丁对大鼠肺部炎性损伤的影响。
实验结果显示，乌司他丁能够显著减轻大鼠肺部的炎性损伤，降低炎症因子的表达水平，改善大鼠的生存率。
进一步的研究发现，乌司他丁的作用机制与其抗炎、抗休克、保护细胞免受损伤的特性密切相关。
五、结论乌司他丁作为一种有效的抗炎及保护性药物，在减轻创伤失血性休克大鼠肺炎性损伤方面具有显著的作用。
其机制主要包括抗炎作用、抗休克作用以及保护细胞免受损伤等方面。
通过实验研究证实了乌司他丁在改善大鼠生存率、减轻肺部炎性损伤方面的有效性。
乌司他丁对重症中暑急性肺损伤的作用及机制研究
乌司他丁对重症中暑急性肺损伤的作用及机制研究陈怿;罗家劲;江东新;林幼萍;童华生;苏磊【期刊名称】《解放军医学杂志》【年(卷),期】2017(42)4【摘要】Objective To investigate the effect ofulinastatin on severe heat-stroke with acute lung injury induced by severe heat stroke.Methods Thirty severe heat stroke patients were divided into conventional group (n=15) and ulinastatin group (n=15) randomly,with another 80 healthy adults serving as controls.The baseline data such as age,gender,onset period and APACHE Ⅱ scores were recorded and compared between the two groups on admission.Peripheral leucocyte counts,oxygenation index and Murray scores were determined on the 1st,3rd and 5th day.The concentration of inflammatory mediators in bronchoalveolar lavage fluid (BALF) and alveolar macrophage supernatant were detected by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA).Western blotting and real-time PCR were used to measure expression of triggering receptor-1 on myeloid cells (TREM-1) on alveolar macrophages.Furthermore,comparison was made in terms of the ventilation period,ICU stay time and mortality in 28 days between the two groups.Results No differences were found inage,gender,onset period and APACHE Ⅱ scores between the two groups (P＞0.05).Compared with the conventional group,peripheral leucocyte counts and Murray scores in the ulinastatin group significantly decreasedon the 3rd and 5th day (P＜0.05,P＜0.01).But oxygenation index was higher in the ulinastatin group than in the conventional group (P＜0.05).The concentration of TNF-α and IL-6 in BALF was lower in the ulinastatin group than in the conventional group (on the 3rd day:P＜0.05,P＜0.01;on the 5th day:P＜0.01,P＜0.01).The concentration of TNF-α and IL-6 in alveolar macrophage supernatant was lower in the ulinastatin group than in the conventional group (on the 3rd day:-P＜0.05,P＜0.01;on the 5th day:P＜0.01,P＜0.05).The expression of TREM-1 protein on alveolar macrophages were lower in the ulinastatin group than in the conventional group (on the 3rd day P＜0.01;on the 5rd day P＜0.05).TREM-1 mRNA was lower in the ulinastatin group than in the conventional group (on the 3rd day:P＜0.05;on the 5th day:P＜0.05).Eventually,the treatment of ulinastatin shorten ventilation period and ICU stay time (P＜0.01,P＜0.05).Nonetheless,it failed to show any improvement in terms of the mortality during 28 days (P＞0.05).Conclusion Our study exhibited that ulinastatin had good effect on the heat stroke patients with acute lung injury and it helped reduce the inflammatory reaction of pulmonary tissues.The underlying mechanism of these effects might lie in its ability to reduce heat stroke-induced inflammatory secretion and expression of TREM-1 on alveolar macrophage.%目的观察乌司他丁对重症中暑急性肺损伤的临床疗效.方法 30例重症中暑患者按随机数字表法分为常规治疗组和乌司他丁组,每组15例,另设健康对照组(n=8).比较两组中暑患者人院时的年龄、性别、发病至接受治疗的时间以及APACHEⅡ评分等基线情况的差异,以及人院后第0、3、5天外周血白细胞计数,Murray评分和氧合指数的差别,并通过酶联免疫吸附法(ELISA)测定支气管肺泡灌洗液(BALF)与肺泡巨噬细胞培养上清炎症介质的浓度,采用免疫印迹法和实时定量PCR法检测肺泡巨噬细胞髓样细胞触发受体-1(TREM-1)表达情况.观察并比较两组患者的机械通气时间、ICU住院时间和28d病死率.结果两组患者人院时的年龄、性别、发病至接受治疗的时间以及APACHEⅡ评分差异无统计学意义(P＞0.05).治疗后第3、5天,乌司他丁组外周血白细胞计数、Murray评分均低于常规治疗组(P＜0.05或P＜0.01),而氧合指数高于常规治疗组(P＜0.05);BALF及肺泡巨噬细胞培养上清中的TNF-α和IL-6浓度均低于常规治疗组(P＜0.05或P＜0.01),肺泡巨噬细胞TREM-1 mRNA和蛋白表达水平明显低于常规治疗组(P＜0.01或P ＜0.05).乌司他丁组重症中暑患者的机械通气时间和ICU住院时间明显低于常规治疗组(P＜0.01或P＜0.05),但28d病死率两组比较差异无统计学意义(P＞0.05).结论乌司他丁对重症中暑急性肺损伤具有良好的临床疗效,有利于减轻肺组织炎症反应程度,其机制可能与乌司他丁调控重症中暑肺泡巨噬细胞的炎症分泌活性及TREM-1表达有关.【总页数】6页(P301-306)【作者】陈怿;罗家劲;江东新;林幼萍;童华生;苏磊【作者单位】523900广东东莞东莞市第五人民医院重症医学科;523900广东东莞东莞市第五人民医院重症医学科;515041广东汕头汕头大学医学院;523900广东东莞东莞市第五人民医院重症医学科;523900广东东莞东莞市第五人民医院重症医学科;510010广州广州军区广州总医院重症医学科、解放军热区创伤救治与组织修复重点实验室;510010广州广州军区广州总医院重症医学科、解放军热区创伤救治与组织修复重点实验室【正文语种】中文【中图分类】R594.1+2【相关文献】1.乌司他丁对重症中暑患者血管内皮细胞损伤的保护作用 [J], 童华生;陈怿;唐柚青;苏磊2.热休克蛋白70对中暑大鼠急性肺损伤的保护作用及机制研究 [J], 耿焱;彭娜;童华生;潘志国;刘云松;马强;苏磊3.乌司他丁对重症中暑小鼠心功能损害的保护作用及机制研究 [J], 吉晶晶;李俊;李慧;孙学刚;苏磊;刘志锋4.乌司他丁对重症中暑小鼠急性肺损伤的保护作用 [J], 周耿标;徐秋林;刘亚楠;王郑莲;郭晓华;苏磊5.单核-巨噬细胞TREM-1对重症中暑大鼠急性肺损伤的作用及机制 [J], 陈怿; 邱嘉玲; 丁程佳; 陈加弟; 刘志峰; 童华生; 江东新因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
乌司他丁减轻重症中暑大鼠肺的炎症和氧化损伤
乌司他丁减轻重症中暑大鼠肺的炎症和氧化损伤由于重癥中暑有热损伤、全身炎症反应（SIRS）和凝血功能异常等多个病理损伤机制的参与，常常迅速地发展成多脏器功能异常（MODS）[1-2]。
组织与脏器损伤是重症中暑常见的临床表现，横纹肌溶解、循环衰竭、肝肾功能异常、脑水肿和急性呼吸窘迫综合征（ARDS）等均可在病程中出现。
有接近75%的重症中暑患者可进展成MODS，其中呼吸系统是最常见的打击器官之一[2]，但目前肺损伤的机制仍未十分明确，且缺乏确切有效的特异性治疗方法。
乌司他丁具有稳定溶酶体膜、抑制溶酶体酶的释放、清除自由基和抑制炎症因子释放等作用。
乌司他丁联合其他药物的治疗在脓毒症的动物和临床研究中证实具有良好的脏器保护作用[3-5]。
由于其具有良好的效果，所以笔者推测乌司他丁对重症中暑大鼠肺组织也具有保护性作用，本研究拟观察乌司他丁的保护性作用并探讨其机制。
1材料与方法1.1实验动物由于雌激素对中暑发生及脏器损伤的影响[6]，故选用SPF级健康成年雄性Wsitar大鼠48只（220～260 g），实验流程经伦理委员会审核通过。
1.2试剂与仪器注射用乌司他丁由广东天普生化医药股份有限公司提供。
血气分析仪（GEM3000，IL公司，美国）。
多通道生理记录仪（Drager公司，德国）。
离心机（AllegraTM 6，BECKMAN公司，美国）。
显微镜（BX51T，OLYMPUS公司，日本）。
ELISA双抗夹心法试剂盒（SHINO-TEST公司，日本）。
1.3实验分组48只雄性Wista大鼠随机（随机数字法）分配为空白组（HS），低剂量乌司他丁组（LUTI），高剂量乌司他丁组（HUTI）和对照组（Sham）共4组，每组各12只。
每组各有6只用于观察生理指标变化、重症中暑的发生时间和生存时间，另外6只于热打击开始后60 min处死并留取标本。
LUTI组和HUTI组分别造模前72 h连续尾静脉注射乌司他丁溶液，剂量分别为5000 U/（100 g ·12 h）和10 000 U/（100 g ·12 h）。
乌司他丁对重症急性胰腺炎大鼠肠道屏障损伤及紧密连接蛋白-1表达的影响的开题报告
乌司他丁对重症急性胰腺炎大鼠肠道屏障损伤及紧密连接蛋白-1表达的影响的开题报告
背景：乌司他丁作为一种 H2 受体拮抗剂，被广泛用于治疗胃肠道
疾病。
近年来的研究表明，乌司他丁对重症急性胰腺炎（SAP）患者具有一定的治疗效果。
然而，其对 SAP 大鼠肠道屏障和紧密连接蛋白-1（ZO-1）表达的影响尚未得到深入的研究。
目的：本研究旨在探讨乌司他丁对 SAP 大鼠肠道屏障和 ZO-1 表达
的影响及其机制。
方法：选择雄性 SD 大鼠，随机分为正常组、SAP 组和 SAP + 乌司
他丁组。
SAP 大鼠采用输注 DL-尿囊肽引发，采用 HE 染色观察肠道组织病理变化， ELISA 法检测肠道黏膜屏障破坏程度，Western blot 分析肠
道组织中 ZO-1 表达水平，RT-qPCR 检测 ZO-1 mRNA 表达水平。
预期结果：预计SAD 大鼠肠道组织会出现炎症细胞浸润、黏膜破损、血管扩张等病理变化，并且肠道屏障的破坏程度和 ZO-1的表达水平将显著降低。
预计乌司他丁治疗将可明显改善SAD 大鼠的肠道组织病理变化，降低肠道屏障的破坏程度，并提高 ZO-1的表达水平。
结论：通过本研究，有望进一步探讨乌司他丁对 SAP 大鼠肠道屏障和 ZO-1 表达的影响及其机制，为临床治疗提供更有力的依据。
乌司他丁治疗重症中暑的临床疗效观察
摘要 ］ 【 目的 】 探讨乌司他丁治疗重症中暑 的 疗 效 及 对 最 终 转 归 的 影 响 。【 方 法】 将收治的５ ６例重症中 ［ 暑的成年患者分为乌司他丁辅助治疗组 （ 和对照组 （ 。 对照组予以 Ｉ 治疗组除 ２ ８例） ２ ８例） Ｃ Ｕ 常规中暑治疗， 入院后给予乌司他丁 ， 静脉注射 ， 连用 ６ｄ 。 观察治疗前后两组患者全 Ｉ Ｃ Ｕ 常规中暑治疗外 ， ２ ０ ０ｋ Ｕ， ６ｈ１ 次 ， 身炎症反应综合征 （ ） 评分 、 血小板计数 ， 凝血酶 原 时 间 、 谷丙转 氨 酶、 肌 酐 等 指 标 变 化 及 住Ｉ Ｓ Ｉ Ｒ Ｓ Ｃ Ｕ 的 时 间、 最终转归 。【 结果 】 治疗后两组患者 Ｓ 血 小 板 计 数， 凝 血 酶 原 时 间、 谷 丙 转 氨 酶、 肌酐等指标较治疗 Ｉ Ｒ Ｓ评 分、 前均有改善 ， 但治疗组改善更明显 ， 且两组相比较有 显 著 差 异 （ ） ； 两 组 患 者 住Ｉ ０ ５ Ｃ Ｕ 的时间相比较有 Ｐ ＜０． 显著差异 （ ） ； 治疗组死亡率较对照组降低 ， 但无显著差异 （ ） 。【 结论 】 乌司 他 丁 可 有 效 控 制 ０ ５ ０ ５ Ｐ ＜０． Ｐ ＞０． 改善各受损脏器的功能 ， 减少多脏器功能障碍综合征（ ） 的 发 生， 降低病死 重症中暑患者 Ｓ Ｉ Ｒ Ｓ 的进展 ， ＭＯ Ｄ Ｓ 率。 关键词 ］ 中暑／药物疗法 ； 胰蛋白酶抑制剂／治疗应用 ［
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后来一系列的实验室研究也发现,热打击与肠道衍生脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)有关,而去除LPS或治疗内毒素血症后,则对中暑预后有利,这些结果提示了内毒素血症中炎性细胞因子反过来加重肠粘膜损害,二者形成互为作用、互为因果。因此,要预防中暑肠源性内毒素血症和细菌移位发生,除“快速降温”外,针对于改善肠粘膜屏障功能的“第二关键点”治疗策略同样具有重要意义。
2.6免疫组化检测肠道TJ蛋白Occludin和ZO-1表达常温对照组的TJ蛋白Occludin和ZO-1均匀一致的分布于小肠粘膜上皮细胞连接处的尖端,呈蜂巢状;40℃热打击组的Occludin和ZO-1表达分布较一致,但与对照组比较表达减少;40℃热打击组Occludin和ZO-1表达显著减少,染色浅见图2-6和2-7。通过计算免疫组化平均OD值发现:热打击组Occludin和ZO-1蛋白的0D值明显低于对照组,各组之间比较有显著统计学意义(p<0.05),这一结果提示中暑后肠道精密连接受损,即中暑可能早期诱导细胞旁途径的肠粘膜屏障损伤。
乌司他丁预防重症中暑小鼠早期肠粘膜屏障功能损害的实验研究
研究背景和目的随着全球气候变暖以及热浪袭击频率和强度的逐年增加,中暑(Heatstroke,HS)的发病率明显增加。中暑如未得到正确救治,可能导致严重的多脏器损害,病死率高达10%～50%。
目前对于中暑研究的普遍观点认为,中暑的病理生理学反应不仅仅是由热暴露的直接损伤引起的,而更多的是一种继发于热损伤之后的全身炎症反应综合征(Systemic inflammatory responsesyndrome,SIRS),进而引发多器官功能障碍综合征(Multiple organ dysfunction syndrome,MODS)的过程。既往研究表明肠道作为体内最大的“储菌库”和“内毒素库”,以其在体内独特的生理环境参与SIRS和MODS的病理生理过程,因此肠道被称之为“MODS的原动力”。
2.3小鼠热打击后各脏器细菌检出情况40℃热打击组样本和对照组无显著差异,42℃热打击组小鼠细菌检出了显著高于对照组和40℃热打击组(χ2=100,p=0.000)。2.4中暑小鼠早期出现肠粘膜屏障功能损害对照组比较,血浆中DAO活性在40℃热打击轻度升高,42℃热打击后显著升高,与对照组和40℃热打击组比较有显著统计学意义(F=33.928,P=0.000)。
肠屏障功能可因各种因素而改变,各种刺激因素致肠粘膜屏障功能损伤后,使肠内细菌移位,内毒素、细菌、抗体介质不断进入血液和淋巴液,导致多种炎症介质释放,引发和加重失控性炎症反应综合征,而SIRS的发生更加重了肠道损伤,形成恶性循环,最终导致MODS。在对重症中暑的研究中已发现存在胃肠病变,包括肠道粘膜受损,肠上皮细胞凋亡、肠通透性增加等。
与对照组比较,40℃组小鼠血浆TNF-a和IL-6水平也有明显升高,差异有统计学意义(P<0.001)。1.3小鼠生存时间分析本研究中常温对照组和40℃热打击组小鼠全部存活超过72h,而42℃组小鼠复温后72h内全部死亡,死亡率100%,其中大部分在24h内死亡,其中位生存时间为18h。
2.采用组织病理形态学分析、电镜超微结构观察、细菌学分析、酶联免疫吸附(ELISA)、TUNEL及免疫组化等技术方法,探讨肠粘膜屏障功能障碍与全身炎症反应及肠上皮细胞凋亡的相关性。2.1 HE染色观察肠粘膜损伤40℃热打击组小鼠回肠粘膜厚度均匀,肠上皮较为完整,绒毛排列尚规则,固有层略疏松,有少量淋巴细胞浸润,有炎性细胞浸润。
结果发现:1.1热打击过程中核心体温变化呈“双峰”样改变,在小鼠遭受热打击前15min先迅速升高到达39℃左右,15min～30min又迅速降至近38℃,之后随着热打击时间而逐渐上升,在体温达到41℃之前有一段较长的稳步上升期,其后当体温达到41℃后上升幅度加大,迅速上升至42℃以上。当小鼠体温到达42℃时生命体征极不稳定,可在短短10～30min体温急剧上升到43℃以上并死亡。
热打击后血浆D-乳酸浓度变化与血浆DAO活性变化有所不同,40℃热打击与对照组比较无明显升高,42℃热打击后显著升高,与对照组和40℃热打击组比较有显著统计学意义(F=49.745,P=0.000)。2.5肠屏障功能障碍与全身炎症反应的相关性分析对代表肠粘膜屏障功能损害的指标二胺氧化酶(Diamine oxidase,DAO)活性和D-乳酸浓度与反映全身炎症反应的指标(血浆INF-a、IL-6和LPS)的相互关系进行线性回归及直线相关分析,结果显示:小鼠血浆炎症反应的指标(血浆INF-a、IL-6和LPS)与血浆DAO活性(P值均小于0.001,相关系数分别为r=0.8075、0.8358、0.8341)和D-乳酸浓度(P值均小于0.001,相关系数分别为r=0.8111、0.8001、0.8107)呈显著正相关,说明肠屏障功能损害在中暑全身炎症反应中的发生中起着非常重要的作用。
本研究选取小鼠核心体温达到40℃及42℃后行复温观察,结果发现不同程度热打击后进行复温的体温可短时间(30min)迅速下降,并且热打击程度越重复温时体温降的越低。1.2小鼠全身炎症反应观察小鼠腔静脉血浆LPS、TNF-a和IL-6水平与热打击程度及复温时间相关。
使用重复测量方差分析方法,得到温度与血浆LPS存在交互效应(F=12.685,P<0.001),与对照组比较,40℃组小鼠在复温1h开始血浆LPS开始升高,复温3h显著上升,至24达高峰;42℃组小鼠血浆LPS浓度在热打击后Oh即明显上升,其上升幅度明显大于40℃组。与对照组和40℃组小鼠比较,42℃组小鼠血浆TNF-a和IL-6水平显著上升,并且呈复温依赖性升高,差异有显著统计学意义。
2.9肠粘膜上皮细胞凋亡指数(Apoptotic index AI)与小肠屏障功能损害和全身炎症反应的相关性分析将不同程度热打击后小鼠肠上皮细胞AI分别与血浆DAO活性、D-乳酸浓度以及血浆INF-a、IL-6水平进行线性回归及直线相关分析,结果显示:1、AI与血浆DAO活性(r=0.8687,p=0.000)和D-乳酸浓度(r=0.8388,p=0.000),呈高度正相关。2、AI与血浆INF-a(r=0.9001,p=0.000)和IL-6(r=0.9193,p=0.000)水平呈显著正相关。
统计学处理所有数据录入SPSS17.0统计软件进行统计学分析,计量资料采用x±s表示,两组资料的均数比较采用t检验。多组间均数比较采用单因素方差分析,若方差齐采用LSD法进行组间比较,方差不齐则采用Games-Howell方法进行组间比较,P<0.05认为有统计学意义。
结果本课题研究主要结果如下1、通过建立的小鼠中暑动物模型,采用鲎试剂比色和酶联免疫吸附(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)的技术方法,研究肠粘膜屏障功能的变化对中暑后早期全身炎症反应的影响。使用Kaplan-Mier曲线和Log Rank检验评估中暑小鼠生存时间和生存率的改变。
Lambert等观察大鼠肠道(包括十二指肠、空肠、回肠和结肠)对高热打击的反应中,发现当大鼠核心体温达到42.5℃C后可见肠上皮细胞破坏,微绒毛丧失,紧密连接开放,线粒体肿胀、空泡化,并且对异硫氰酸荧光素(FITC)-葡聚糖的通透性增加。临床死亡的中暑病例主要症状常常包括胃肠道出血、内毒素血症,提示中暑肠屏障功能损害和全身炎症反应密切相关。
鉴于以上现状,本研究通过建立热打击中暑小鼠动物模型,探讨高热对肠粘膜屏障功能的影响及其与全身炎症反应的相关性;进一步使用UTI预处理中暑动物,观察UTI对重症中暑动物模型肠粘膜屏障的影响。方法:采用6-8周龄SPF级雄性BALB/c小鼠(SYXK(YUE)2011-0015]建立中暑模型,随机分为对照组、40℃热打击组、42℃热打击组;观察药物治疗效应随机分为sham组、HS组(42℃热打击)、低剂量UTI组(5000U/kg)及高剂量UTI组(10000U/kg)。
乌司他丁(Ulinastatin,UTI)是从男性尿液分离纯化出来的尿胰蛋白酶抑制剂,能同时抑制磷脂酶A2,胰蛋白酶,弹性蛋白酶等多种水解酶活性;此外,还有改善休克时的循环状态,抑制心肌抑制因子的产生,抑制炎症介质的释放,稳定溶酶体膜等功能,目前广泛应用于临床。目前研究已证实UTI对多种疾病造成的肠粘膜损伤具有保护作用,然而对于UTI是否也对重症中暑肠粘膜损害具有保护作用,目前较少报道。
3、采用前述技术方法,观察UTI预处理对重症中暑早期肠粘膜屏障的保护作用并对重症小鼠膜组织形态学、肠粘膜组织超微结果及肠屏障功能有明显改善;细菌移位率、血浆LPS浓度及炎症因子IL-6、TNF-a明显降低,重症中暑小鼠全身炎症反应明显减轻;肠道TJ蛋白Occludin和ZO-1表达增加;肠上皮细胞凋亡指数明显下降;同时生存分析显示UTI预处理也显著改善重症中暑小鼠的生存时间和生存率。
2.7肠道TJ蛋白与小肠屏障功能损害和全身炎症反应的相关性分析线性回归及直线相关分析显示:紧密连接蛋白Occludin和ZO-1与小鼠血浆炎症反应的指标(血浆TNF-a、IL-6)(P<0.001,相关系数分别为r=0.8156、0.8858、0.8548、0.9290),呈显著正相关。这一结果提示中暑小鼠全身炎症反应和肠粘膜屏障损害有关。
Occludin和ZO-1与血浆DAO活性(P<0.001,相关系数分别为r=-0.7640、-0.8003)和D-乳酸浓度(P<0.001,相关系数分别为r=-0.7215、-0.7639)呈显著负相关。这一结果提示DAO活性及D-乳酸浓度能较好反映中暑小鼠肠粘膜屏障功能。