第六章 固定化酶和固定化活性细胞
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固定化酶和固定化细胞
2022年高考生物总复习：固定化酶和固定化细胞
(1)固定化酶
①形成：将水溶性的酶用物理或化学的方法固定在某种介质上，使之成为不溶于水而又有酶活性的制剂。
②特性：与游离酶相比较，稳定性好，与底物和产物容易分离，易于控制，能反复多次使用；便于运输和贮存，有利于自动化生产。
(2)固定化细胞：是指固定在一定空间范围内的、能够进行生命活动并且可以反复使用的活细胞，又叫做固定化活细胞或固定化增殖细胞。
(3)固定技术
①概念：利用物理或化学方法将酶或细胞固定在一定空间内的技术。
②方法(连线)
提示A—b—ⅠB—a—ⅡC—c—Ⅲ
③适用对象
一般来讲，酶更适合采用化学结合法和物理吸附法固定化，而细胞多采用包埋法固定化，这是因为个大的细胞难以被吸附或结合，而个小的酶则易从包埋材料中漏出。
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第六章固定化酶
酶的pH值低； 催化反应的产物为中性时，固定化酶的最适pH值一般不
变；
这是由于固定化载体成为扩散障碍，使反应
产物向外扩散受到一定的限制所造成的。当
反应产物为酸性时，由于扩散受到限制而积
累在固定化酶所处的催化区域内，使此区域 内的pH比降低，必须提高周围反应液的pH， 才能达到酶所要求的pH。为此，固定化酶的 最适pH比游离酶要高一些。反之，反应产物
固定化酶作用的最适温度可能会受到固定方法和固定化载 体的影响。
5． 底物特异性变化
固定化酶的底物特异性与游离酶比较可能有些不同， 其变化与底物相对分子质量的大小有一定关系。
作用于小分子底物的酶
特异性没有明显变化
既可作用于小分子底物又可作用于大分子底物的酶 特异性往往会变化。
Eg：胰蛋白酶：高分子蛋白、低分子（二肽、多肽），固定在羧甲基 纤维素上，对二肽或多肽的作用保持不变，而对酪蛋白的作用仅为游 离酶的3%；
为碱性时，由于它的积累使固定化酶催化区 域的pH升高，故此使固定化酶的最适pH比游 离酶的最适pH要低一些。
固定化酶最适温度的变化
一般与游离酶差不多，但有些会有较明显的变化
Eg：用重氮法制备的固定化胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶，其 作用的最适温度比游离酶高5—10
以共价结合法固定化的色氨酸酶，其最适温度比游离酶高
——这种固定化的酶既具有酶的催化特性， 又具有一般化学催化剂能回收、反复使 用等优点，并且生产工艺可以连续化、 自动化。
3
进展
1916年Nelson和Griffin利用活性炭吸附蔗糖酶
固定化酶的研究从20世纪50年代开始
1953年德国的Grubhofer和Schleith采用聚氨基苯 乙烯树脂为载体，经重氮法活化后，分别与羧肽 酶、淀粉酶、胃蛋白酶、核糖核酸酶等结合，而 制成固定化酶。
变；
这是由于固定化载体成为扩散障碍，使反应
产物向外扩散受到一定的限制所造成的。当
反应产物为酸性时，由于扩散受到限制而积
累在固定化酶所处的催化区域内，使此区域 内的pH比降低，必须提高周围反应液的pH， 才能达到酶所要求的pH。为此，固定化酶的 最适pH比游离酶要高一些。反之，反应产物
固定化酶作用的最适温度可能会受到固定方法和固定化载 体的影响。
5． 底物特异性变化
固定化酶的底物特异性与游离酶比较可能有些不同， 其变化与底物相对分子质量的大小有一定关系。
作用于小分子底物的酶
特异性没有明显变化
既可作用于小分子底物又可作用于大分子底物的酶 特异性往往会变化。
Eg：胰蛋白酶：高分子蛋白、低分子（二肽、多肽），固定在羧甲基 纤维素上，对二肽或多肽的作用保持不变，而对酪蛋白的作用仅为游 离酶的3%；
为碱性时，由于它的积累使固定化酶催化区 域的pH升高，故此使固定化酶的最适pH比游 离酶的最适pH要低一些。
固定化酶最适温度的变化
一般与游离酶差不多，但有些会有较明显的变化
Eg：用重氮法制备的固定化胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶，其 作用的最适温度比游离酶高5—10
以共价结合法固定化的色氨酸酶，其最适温度比游离酶高
——这种固定化的酶既具有酶的催化特性， 又具有一般化学催化剂能回收、反复使 用等优点，并且生产工艺可以连续化、 自动化。
3
进展
1916年Nelson和Griffin利用活性炭吸附蔗糖酶
固定化酶的研究从20世纪50年代开始
1953年德国的Grubhofer和Schleith采用聚氨基苯 乙烯树脂为载体，经重氮法活化后，分别与羧肽 酶、淀粉酶、胃蛋白酶、核糖核酸酶等结合，而 制成固定化酶。
酶工程 第六章酶与细胞固定化 第二节酶和菌体固定化
第二节 酶和菌体固定化
半透膜包埋法制成的固定化酶小球，直径—般只有几 ㎛至几百㎛，称为微胶囊。制备时，—般是将酶液分散在 与水互不相溶的有机溶剂中，再在酶液滴表面形成半透膜， 将酶包埋在微胶囊之中。例如：将欲固定化的酶及亲水性 单体(如已二胺等)溶于水制成水溶液，另外将疏水性单体 (如癸二酰氯等)溶于与水不相混溶的有机溶剂中，然后将 这两种互不相溶的液体混和在一起，加入乳化剂（如司盘 -85等）进行乳化，使酶液分散成小液滴，此时亲水性的 已二胺与疏水住的癸二酰氯就在两相的界面上聚合成半透 膜，将酶包理在小球之内。再加进吐温-20(Tween-20)， 使乳化破坏，用离心分离即可得到用半透膜包埋的微胶囊 型的固定化酶。
第二节 酶和菌体固定化
用离子键结合法进行酶固定化，条件温和，操作简便。 只需在一定的pH值、温度和离子强度等条件下，将酶液 与载体混合搅拌几个小时，或者将酶液缓慢地流过处理好 的离于交换柱，就可使酶结合在离于交换剂上，制备得到 固定化酶。例如：将处理成-OH型的DEAE-葡聚糖凝胶加 至含有氨基酰化酶的0.1mo1/L的pH7.0磷酸缓冲液中，于 37℃条件下，搅拌5h，氨基酰化酶就可与DEAE-葡聚糖 凝胶通过离子键结合，制成固定化氨基酰化酶。或者将处 理过的DEAE-葡聚糖凝胶装进离子交换柱，用氢氧化钠处 理，使之成为-OH型，用无离子水冲洗，再用pH 7.0的 0.1mo1/L磷酸缓冲液平衡备用。另将一定量的氨基酰化酶 溶于pH7.0的0.1mol／L磷酸缓冲液中配成一定浓度的酶液， 在37℃的条件下，让酶液慢慢流过离子交换柱，就可制备 成固定化氨基酰化酶。用于拆分乙酰—DL—氨基酸，生 产L—氨基酸
酶工程
第六章 酶与细胞固定化
第二节 酶和菌体固定化
将酶与水不溶性的载体结合，制备固定化酶的过程称 为酶的固定化。
固定化酶和固定化细胞ppt课件
21
❖（3）溴化氰法 即用溴化氰将含有羟基的载体，如 纤维素、葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶等，活化生成亚 氨基碳酸酯衍生物，然后再与酶分子上的氨基偶联， 制成固定化酶。
❖ 任何具有连位羟基的高聚物都可用溴化氰法来活化。
22
❖（4）烷基化和芳基化法 以卤素为功能团的载体 可与酶蛋白分子上的氨基、巯基、酚基等发生烷 基化或芳基化反应而使酶固定化。
❖ （4）其他：半胱氨酸残基的巯基；丝氨酸、苏氨酸和酪 氨酸残基的羟基；组氨酸残基的咪唑基；色氨酸残基的吲 哚基。
❖ 酶共价偶联的载体的功能基团：芳香氨基、羟基、羧 基和羧甲基等。
18
载体活化的主要反应 ❖ 重氮法 ❖ 叠氮法 ❖ 溴化氰法 ❖ 芳香烃化法
19
❖（1）重氮法 重氮法是将酶蛋白与水不溶性载体 的重氮基团通过共价键相连接而固定化的方法， 是共价键法中使用最多的一种。
14
❖ （1）凝胶包埋法 ▪ 将聚合物的单体与酶溶液混合，再借助于聚合 促进剂(包括交联剂)的作用进行聚合，酶被包 埋在聚合物中以达到固定化。 ▪ 凝胶包埋法常用的载体有海藻酸钠凝胶、角叉 菜胶、明胶、琼脂凝胶、卡拉胶等天然凝胶以 及聚丙烯酰胺、聚乙烯醇和光交联树脂等合成 凝胶或树脂。
15
❖ （2）微胶囊包埋法 ▪ 微胶囊包埋即将酶包埋在各种高聚物制成的半 透膜微胶囊内的方法。它使酶存在于类似细胞 内的环境中，可以防止酶的脱落，防止微囊外 的环境直接接触，从而增加了酶的稳定性。常 用于制造微胶囊的材料有聚酰胺、火棉胶、醋 酸纤维素等。
❖ 常用的载体有多糖类的芳族氨基衍生物、氨基酸 的共聚体和聚丙烯酰胺衍生物等。
20
❖（2）叠氮法 即载体活化生成叠氮化合物，再与 酶分子上的相应基团偶联成固定化酶。
❖（3）溴化氰法 即用溴化氰将含有羟基的载体，如 纤维素、葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶等，活化生成亚 氨基碳酸酯衍生物，然后再与酶分子上的氨基偶联， 制成固定化酶。
❖ 任何具有连位羟基的高聚物都可用溴化氰法来活化。
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❖（4）烷基化和芳基化法 以卤素为功能团的载体 可与酶蛋白分子上的氨基、巯基、酚基等发生烷 基化或芳基化反应而使酶固定化。
❖ （4）其他：半胱氨酸残基的巯基；丝氨酸、苏氨酸和酪 氨酸残基的羟基；组氨酸残基的咪唑基；色氨酸残基的吲 哚基。
❖ 酶共价偶联的载体的功能基团：芳香氨基、羟基、羧 基和羧甲基等。
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载体活化的主要反应 ❖ 重氮法 ❖ 叠氮法 ❖ 溴化氰法 ❖ 芳香烃化法
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❖（1）重氮法 重氮法是将酶蛋白与水不溶性载体 的重氮基团通过共价键相连接而固定化的方法， 是共价键法中使用最多的一种。
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❖ （1）凝胶包埋法 ▪ 将聚合物的单体与酶溶液混合，再借助于聚合 促进剂(包括交联剂)的作用进行聚合，酶被包 埋在聚合物中以达到固定化。 ▪ 凝胶包埋法常用的载体有海藻酸钠凝胶、角叉 菜胶、明胶、琼脂凝胶、卡拉胶等天然凝胶以 及聚丙烯酰胺、聚乙烯醇和光交联树脂等合成 凝胶或树脂。
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❖ （2）微胶囊包埋法 ▪ 微胶囊包埋即将酶包埋在各种高聚物制成的半 透膜微胶囊内的方法。它使酶存在于类似细胞 内的环境中，可以防止酶的脱落，防止微囊外 的环境直接接触，从而增加了酶的稳定性。常 用于制造微胶囊的材料有聚酰胺、火棉胶、醋 酸纤维素等。
❖ 常用的载体有多糖类的芳族氨基衍生物、氨基酸 的共聚体和聚丙烯酰胺衍生物等。
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❖（2）叠氮法 即载体活化生成叠氮化合物，再与 酶分子上的相应基团偶联成固定化酶。
固定化酶和固定化细胞
再加DEAE-纤维素结合 结果：结合力增大(吸附量也大),也相当稳定，使
用寿命长，有时可以连续使用3个星期
吸附方法：
1.静态吸附，自然吸附、解吸、再吸附的固定化方法。 效率低，时间比较长，而且不完全。
2.电沉积，在载体附近加电极，酶移向载体表面的固 定化方法。需要酶在电场中不破坏，保持原来酶性 能。。
➢ 特点：操作简便、条件温和、不会引起酶变性失活， 载体廉价易得，可反复使用，但结合力较弱，酶与 载体结合不牢固易脱落。
物理吸附(氢键、疏水键等作用力将酶固定于不溶性载体上) 无机吸附剂（高岭土、皂土、硅酸、氧化铝等）
吸附量小、有些酶发生吸附变性 有机吸附剂（纤维素、胶原等）
吸附量略大(～50mg/g载体),不产生变性失活，比较 受重视。
吸附力弱，不适宜的pH,高盐浓度，高底物浓 度，高温等都能把吸附的酶解吸下来。
可以改善的方法： 1.选择最佳条件操作（如温度、pH） 2.选吸附量大的载体，控制酶和载体量
如烃基-琼脂糖衍生物吸附在酸性pH的酶(脲 酶)用亲和吸附剂 ConA-葡聚糖能专一吸附糖蛋白
对酶进行修饰以后再与载体结合，胰蛋白酶+丙 烯酸与顺丁烯二酸酐的水溶性共聚体共价偶联
避免影响酶的活性构型和相应基团
酶的偶联量: 单位载体上偶联酶的总量与“相对酶活力”之间的
平衡。
相对酶活力： 指固定化酶和蛋白量与相等的原酶的活力比。
由于固定化时，受到载体、方法、条件、酶反应系 统的影响，即使以上因素一定，还会受到酶偶联量的影响。
1.只有达到一定的偶联量，酶活性达到最高。 2.超过一定的偶联量，酶过多集中于载体的局部， 造成空间位阻效应，部分酶无法表现活性。随酶偶联量上 升酶活性反而下降。
寻找二者平衡点关系，才能使固定化酶活性达到最高。
用寿命长，有时可以连续使用3个星期
吸附方法：
1.静态吸附，自然吸附、解吸、再吸附的固定化方法。 效率低，时间比较长，而且不完全。
2.电沉积，在载体附近加电极，酶移向载体表面的固 定化方法。需要酶在电场中不破坏，保持原来酶性 能。。
➢ 特点：操作简便、条件温和、不会引起酶变性失活， 载体廉价易得，可反复使用，但结合力较弱，酶与 载体结合不牢固易脱落。
物理吸附(氢键、疏水键等作用力将酶固定于不溶性载体上) 无机吸附剂（高岭土、皂土、硅酸、氧化铝等）
吸附量小、有些酶发生吸附变性 有机吸附剂（纤维素、胶原等）
吸附量略大(～50mg/g载体),不产生变性失活，比较 受重视。
吸附力弱，不适宜的pH,高盐浓度，高底物浓 度，高温等都能把吸附的酶解吸下来。
可以改善的方法： 1.选择最佳条件操作（如温度、pH） 2.选吸附量大的载体，控制酶和载体量
如烃基-琼脂糖衍生物吸附在酸性pH的酶(脲 酶)用亲和吸附剂 ConA-葡聚糖能专一吸附糖蛋白
对酶进行修饰以后再与载体结合，胰蛋白酶+丙 烯酸与顺丁烯二酸酐的水溶性共聚体共价偶联
避免影响酶的活性构型和相应基团
酶的偶联量: 单位载体上偶联酶的总量与“相对酶活力”之间的
平衡。
相对酶活力： 指固定化酶和蛋白量与相等的原酶的活力比。
由于固定化时，受到载体、方法、条件、酶反应系 统的影响，即使以上因素一定，还会受到酶偶联量的影响。
1.只有达到一定的偶联量，酶活性达到最高。 2.超过一定的偶联量，酶过多集中于载体的局部， 造成空间位阻效应，部分酶无法表现活性。随酶偶联量上 升酶活性反而下降。
寻找二者平衡点关系，才能使固定化酶活性达到最高。
名词解释
点。
（1）差速离心特点：用于分离大小和密度差异较大的颗粒。
（2）密度梯度离心特点：：
区带内的液相介质密度小于样品物质颗粒的密度。
适宜分离密度相近而大小不同的固相物质。
（3）等密度梯度离心特点：
介质的密度梯度范围包括所有待分离物质的密度。
适于分离沉降系数相近，但密度不同的物质。
5、酶的分离纯化过程中常用沉淀法的种类及原理。
第一章 绪论
1、 何谓酶工程，试述其主要内容和任务。 答：酶的生产、改性与应用的技术过程称为酶工程。 酶的生产：微生物发酵产酶、动植物培养产酶、酶的提取和分离纯化 酶的改性：酶分子修饰、酶固定化、酶非水相催化和酶的定向进化 酶的应用：通过酶的催化作用获得人们所需的酶，并通过各种方法使 酶的催化特性得以改进，充分发挥其催化功能。 酶工程的内容：微生物细胞发酵产酶，动植物细胞培养产酶，酶的提 取与分离纯化，酶分子的修饰，酶、细胞、原生质体固定化，酶非水 相催化，酶定向进化，酶反应器和酶的应用等。
第二章 酶的生物合成与发酵生产
1、提高酶的产量的措施。 （一）遗传控制 诱变育种 (1)使诱导型变为组成型——选育组成型突变株 (2)使阻遏型变为去阻遏型
选育营养缺陷型突变株 解除反馈阻遏
选育结构类似物抗性突变株 解除分解代谢物阻遏——选育抗分解代谢阻遏突变株 基因工程育种 改变细胞调节基因，使菌种由诱导型变为组成型。 增加结构基因的拷贝数，增加细胞专一性酶的生产。 （二）条件控制 （1）添加诱导物
缺点：只适合作用于小分子底物和产物的酶。 ④共价结合法：结合牢固，不易脱落，可连续使用较长的时间 载体活化操作复杂，对酶的活性有影响。 ⑤交联法：交联法制备的固定化酶或固定化菌体结合牢固，可以长时 间使用。交联法也用于含酶菌体或菌体碎片的固定化。 2、酶固定化后性质会发生什么变化？原因是什么？酶固定化后稳定性 提高中,包括哪几方面的稳定性？ （1）酶的活性 ：通常低于天然酶（有例外）。 （2）酶的稳定性 酶的耐热性、对变性剂、抑制剂、蛋白酶的抵抗力增加，固定化可以 增强贮存稳定性和操作稳定性。 可能的原因：①固定化增加了酶活性构象的牢固程度，可防止酶分子 伸展变形； ②抑制酶的自身降解。 ③固定化部分阻挡了外界不利因素对酶的侵袭。 包括：（一）酶的最适温度 最适温度与酶稳定性有关。 多数酶固定化后热稳定性上升，最适温度也上升（有例外）。 （二）酶的最适pH 带负电荷载体 ：最适pH 向碱性偏移。 带正电荷载体 ：最适pH 向酸性偏移 （三）酶的动力学特征 固定化酶的表观米氏常数Km随载体的带电性能变化。 固定化载体与底物电荷相反,固定化酶的表观Km值降低。
固定化酶与固定化细胞 ppt课件
• 固定化细胞意义：用完整的细胞作为生物催化剂， 以充分有效地利用生物细胞内的特定酶或多酶系 统。
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4
优点
①省去对酶的提取过程，使酶的损失和生产 成本降到最低程度；
②可以利用细胞的多酶系统直接生产有价值 的产物。
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5
第一节 酶和细胞的固定化
一、固定化酶和细胞的定义及特点 二、固定化方法 三 细胞的固定化方法
缺点：结合力弱，易解吸 附。
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2.共价偶联法（covalent binding or covalent coupling）
借助共价 键将酶的活性 非必需侧链基 团和载体的功 能基团进行偶 联。
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1）载体：亲水载体优于疏水载体
如:天然高分子衍生物:
纤维素
葡聚糖凝胶 亲和性好，机械性能差
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戊二醛有两 个醛基，均可与 酶或蛋白质的游 离氨基反应,使酶 蛋白交联。
此法与共价偶联法利用的均是共价键， 不同之处：交联法不使用载体。
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交联反应既能发生在分子间，也可 发生在分子内。
• 酶浓度低时，交联发生在分子内，酶 仍保持溶解状态。 • 酶浓度高时，交联发生在分子间，酶 变为不溶态。
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优越性：
(1)降低成本，省去酶的分离纯化工作; (2)既可作为单一酶，也可作为复合酶系
完成部分代谢过程。 局限性： (1)细胞内多种酶的存在，会形成不需要的副
产物。 (2)细胞膜、细胞壁和载体都存在着扩散限制
作用。
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3.固定化原生质体
意义： (1)固定化原生质体去除了细胞壁的扩散障 碍，有利于氧的传递，营养成分的吸收和 胞内产物的分泌。 (2)原生质体不稳定，容易破裂，固定化后， 由于载体的保护作用，稳定性提高。
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1）网格型包埋法 （gel (lattic) entrapment）
又称凝胶包埋法
使用的多孔载体及其特点
凝胶
包埋条件 酶活性
天然凝胶 琼脂、海藻酸钙、温和 角叉菜胶、明胶
不变
强度 差
树脂
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海藻酸钙凝胶包埋法： 滴至
海藻酸钠溶液＋E (or cell) CaCl2 溶液中
②细胞固定化的基本技术和原理； ③简要介绍固定化酶基本性质的影响及辅因
子的固定化方法和辅酶的再生体系。
2
3
游离酶的缺点：
1.酶是蛋白质，稳定性差（热、酸碱、有 机溶剂对其有影响）。 2.不能回收，使用成本高。 3.酶在游离体系中更容易自水解 4.分离纯化困难，也使产物中混杂酶蛋白
4
• 固定化酶（定义）：用物理或化学手段定位在限定 的空间区域，并使其保持催化活性，可重复利用的 酶。（1971年在美国召开的第一届国际酶工程会议）
第6章 固定化酶与固定化细胞
概述 第一节 酶和细胞的固定化
一、固定化酶和细胞的定义及特点 二、酶的固定化方法 三 细胞的固定化方法 四 原生质体的固定化方法 第二节 固定化酶和固定化细胞的性质与表征 第三节 固定化酶与固定化细胞的应用 第四节 辅酶的固定化
1
本章讲授
①固定化生物催化剂的概念以及吸附法、包 埋法、共价结合法、无载体固定化酶的基 本技术和原理；
• 固定化细胞（定义）：将具有一定生理功能的生物 细胞（如微生物细胞、植物细胞或动物细胞等），用一定的方 法将其固定，作为固体生物催化剂而加以利用的一 门技术。
• 固定化细胞意义：用完整的细胞作为生物催化剂， 以充分有效地利用生物细胞内的特定酶或多酶系统。
5
优点
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（4）米氏常数
Km值的改变主要是由于载体与底 物间的静电相互作用。当两者所带电 荷相反时，载体和底物之间的吸引力 增加，从而使酶的Km值减小；当两者 电荷相同时，载体与底物之间相互排 斥，使酶的Km值增大。
（5）最大反应速度
固定化酶的最大反应速度 与游离酶多数是相同的。
第四节 固定化酶的 催化反应机理探讨
一、酶固定化技术发展史
20世纪70年代初，千畑一郎采用有效载体 在温和条件下将整个微生物菌体固定化并 连续生产L-天冬氨酸。 1978年，日本的铃木用固定化枯草杆菌生 产α－淀粉酶 ，开始了用固定化活细胞进 行酶的生产先例。
一、酶固定化技术发展史
我国固定化酶的研究开始于1970年。
在染料工业将β－硫酸酯乙砜基苯胺引入固定 化领域，用于多糖载体与多种酶共价结合；
四、交联法
●酶分子 （a）酶分子之间用双功能基团 的化学交联试剂相互交联成水不溶性的固 定化酶；（b）酶分子被偶联到水不溶性载 体上形成水不溶性的固定化酶
四、交联法
交联剂有形成希夫碱的戊二醛，形 成肽键的异氰酸酯，发生重氮偶合反应 的双重氮联苯胺或N，N’－乙烯双马来 亚胺等，其中戊二醛最为常用。 参与交联反应的酶蛋白的功能基团 有氨基、酚基、巯基和咪唑基等。
二、影响固定化酶的动力学因素
游离酶经固定化后所引起的酶性 质改变，归纳起来有下列几种原因：
• 酶分子构象的改变 • 载体的屏蔽效应 • 微环境的影响 • 扩散效应
二、影响固定化酶的动力学因素
（1）酶分子构象改变的影响 酶分子在固定化过程中发生了某种 扭曲，使酶分子拉长，改变酶活力部位 的空间结构，从而改变酶的活力。
固定化酶在操作中可以长时间 用共价键结合法制备的固定化 保留活力。一般情况下，半衰期在 青霉素酰化酶在37℃参与反应77天 一个月以上，即有工业价值。 后残余活力仍为100％。
（2）储藏稳定性
固定化酶的储藏稳定性一般高于 游离酶，但如长期储存，酶活力也会 下降。固定化酶制成后最好立即使用。
（3）热稳定性
热稳定性对于工业应用极为重要。 多数酶固定化后的热稳定性都较游离 酶高，但有一些酶的耐热性反而下降。
（4）对蛋白酶的稳定性
酶经固定化后，对蛋白酶的抵抗力提 高。可能因为蛋白酶是大分子，由于受到 空间位阻的影响，不能有效接触固定化酶。 固定化后酶对有机试剂和酶抑制剂的 耐受性也得到了提高。
（5）酸碱稳定性
固定化5’－磷酸二脂酶生产单核苷酸； 固定化青霉素酰化酶生产6－氨基青霉烷酸 （6-APA）和固定化葡萄糖异构酶生产果葡糖 浆等，成功用于工业化生产。
一、酶固定化技术发展史
近年来，各国已从早期集中于各 种固定化酶制备方法的研究转向酶在 固定化后作用机制以及在工业、医学、 化学分析、亲和层析、环境保护、能 源开发等方面的应用研究。
多数固定化酶的酸碱稳定 性高于游离酶，体现在其反应 最适pH范围变宽。
（三）固定化酶的反应特性
固定化酶的反应特性，例如，底 物特异性、反应的最适pH值、反应的 最适温度、动力学参数、最大反应速 度等均与游离酶有所不同。
（1）底物特异性
固定化酶的底物特异性与底物 量的大小有一定关系。 分子糖化酶固定化后，对分子量 8000 当酶的底物为小分子化合物时， 的直链淀粉活性为游离酶的 70％，对 固定化酶的底物特异性大多数情况 子量为500000的直链淀粉的活性 下不发生变化，而当酶的底物为大分 15分子化合物时，固定化酶的底物特 －17％。 异性往往发生变化。
（2）反应最适pH值
酶经固定化后，其最适pH和pH曲 线常会发生偏移。最适pH和pH曲线的 变动取决于酶蛋白和水不溶性载体的 电荷性质。有些酶在固定化后最适pH 发生变化，而pH曲线不变。
（3）反应的最适温度
固定化酶的最适反应温 度多数较游离酶高，但也有 不变甚至降低的。
（4）米氏常数
米氏常数表明了酶与底物 的亲和力。固定化酶的Km与游 离酶的Km有差异。
一、吸附法
原理：吸附法是通过载体表面 酶与载体之间的亲和力是范 和酶分子表面间的次级键相互作用 德华力、疏水相互作用、离子键 而达到固定化目的酶的方法。和氢键等。
一、吸附法
优缺点：吸附法处理条件温 和，酶活力部位不易被破坏，酶 和载体结合力较弱，易于脱落。
一、吸附法
1.物理吸附法
通过物理方法将酶直接吸附 常用的无机载体有活性炭、多 孔 在水不溶性载体表面上而使酶固 璃等；有机载体有淀粉、谷蛋 定化的方法称为物理吸附法。玻 丁基或己基－葡聚糖凝胶等。
四、交联法
优缺点：此法制备的固定化酶结 合牢固、不易脱落。但由于反应条件 比较激烈，固定化酶活力回收率一般 比较低（30％左右）。
各种固定化方法的特点比较
吸附法
制备 结合程度
包埋法 共价键 交联法 结合法 物理吸附法 离子吸附法
易 弱 可能 低 易 中等 高 可能 低 不变 较难 强 高 低 不变 难 强 低 高 可变 较难 强 中等 中等 可变
活力回收率 易流失 再生 费用
不可能 不可能 不可能
底物专一性 不变
无载体固定化
无载体固定化就是在无外来惰性 载体的情况下固定化酶的方法。
无载体固定化
无载体固定化酶的优点： 无载体固定化酶不溶于水也不溶 于有机溶剂，回收方便。 固定化酶本身为高浓度酶的聚合 物，有较高的催化剂表面积，一 般具有较高的催化活性。
第四节 固定化酶的催化反应机理探讨
从游离酶到固定化酶是一个很 大的改变，这一转变给酶催化反应 动力学带来了显著而复杂的影响。 从反应工程方面分析，固定化酶反 应系统属于非均一催化反应。
一、固定化酶对反应体系的影响
固定化酶的性质许多不同于水 溶性酶。这些变化是因为固定化对 酶本身和反应体系产生了影响。
无载体固定化
无载体固定化酶的优点： 稳定性高，对高温、有机溶剂等 有很高的耐受性，对外源蛋白酶 的水解有很强的抗性。 固定化酶具有较大的孔径结构， 使溶剂、底物和产物的扩散阻力 小甚至可以忽略。 制备简单，成本较低。
无载体固定化
无载体固定化酶的种类：
交联溶解酶 交联酶晶体 交联酶聚集体 交联喷雾干燥酶
酶的固定化
酶 可溶 固定化
间歇
吸附 包埋 交联 连续 化学偶联
间歇
第一节 固定化酶的定义及特点
一、酶固定化技术发展史
1916年Nelson和 Griffin发现酶不溶于水而 具有酶活性现象。 1948年Summer把刀豆脲酶制成非水溶性酶， 同样具有酶活力。
1953年由Grubhofer等采用聚氨基苯乙烯树脂 重氮化法实现了羧肽酶、淀粉酶、胃蛋白酶 和核糖核酸酶等的固定化。
一、固定化酶对反应体系的影响
对液体酶反应，酶浓度为10－2mol/L时， 酶与底物间最大平均间距为20nm。对于固 定化酶反应，若固定化酶颗粒直径为0.1mm （100μ）时，则与粒子距离最近的底物与 酶的距离为20μ，为液体酶的1000倍。 因此，固定化酶反应的物质传递对反应 速度的影响变的更加重要。
二、包埋法
1.网格型 常用的固定化载体有聚丙 烯酰胺、聚乙烯醇等高分子化 合物，以及淀粉、明胶、卡拉 胶等天然高分子化合物。
二、包埋法
2.微囊型 这类固定化酶通常为直径几 微米到几百微米的球状体，颗粒 比网格型小，有利于底物和产物 的扩散，但是反应条件要求高， 制备成本也高。
二、包埋法
2.微囊型 制备微囊型固定化酶有如下方法： 界面沉淀法 界面聚合法 二级乳化法 液膜法（脂质体包埋法）
（一）酶活力
酶经固定化后，活力大部分下降。 1.酶活性部位的重要氨基酸残基与 水不溶性载体结合； 2.酶与不溶性载体结合时，它的结 构起了变化； 3.酶被固定化后，酶与底物的相互 作用受到空间位阻的影响。
（二）固定化酶的稳定性
固定化酶的稳定性一般要比游 离酶提高很多，有利于工业生产。
（1）操作稳定性
二．固定化酶的定义
固定化酶是指在一定的空间 范围内起催化作用，并能反复和 连续使用的酶。
三、固定化酶的特点
固定化酶与游离酶化后稳定性提高。 固定化酶催化的反应过程更易控制。 固定化酶具有一定的机械强度，可以用搅 拌或装柱的方式作用于底物溶液，便于酶 催化反应的连续化和自动化操作。 固定化酶与游离酶相比更适于多酶体系。
一、吸附法
1.物理吸附法 此法具有酶活力部位及其空间 构象不易被破坏的优点，但酶附着 在载体上，存在易于脱落等缺点。
一、吸附法
2.离子吸附法 离子吸附法是将酶与含有离 载体有多糖类离子交换剂和合 子交换基团的水不溶性载体以静成高 子离子交换树脂。例如：DEAE-纤 电作用力相结合的固定化方法，分 、CM－纤维素、纤维素－柠檬酸 即通过离子键使酶与载体相结合素 的固定化方法。
三、共价键结合法
与载体共价结合的酶的功 能基团包括：氨基；羧基；苯 环；巯基；羟基；咪唑基；吲 哚基；酚基等。
三、共价键结合法
三、共价键结合法
三、共价键结合法
三、共价键结合法
三、共价键结合法
共价键结合法可分为： 重氮化法 烷基化和芳基化法 溴化氰法 叠氮法
四、交联法
原理：交联法是使用双功能 试剂或多功能试剂与酶分子间进 行交联的固定化方法。
第六章 固定化酶和 固定化细胞
为什么要固定化酶
游离酶催化反应存在如下缺点： 游离酶催化反应几乎都在水溶液 中进行，只能一次性使用，难以 回收 酶与产物混合，增加了酶分离和 纯化的难度 溶液中酶的稳定性差，容易变形 和失活
酶的固定化
将游离酶、细胞或细胞器等 的催化活动完全或基本上限制在 一定空间内的过程称为固定化。
四、固定化酶的制备原则
必须注意维持酶的构象，特别是活性中 心的构象。 酶与载体必须有一定的结合强度。 固定化酶应有利于自动化、机械化操作。 固定化酶应尽量减小空间位阻。 固定化酶应有较高的稳定性。 固定化酶的成本适中。