基于EET机理比率型荧光探针的研究进展
比率荧光探针检测离子的机理
比率荧光探针检测离子的机理比率荧光探针是一种高灵敏度、高选择性、非破坏性的检测离子及小分子生物体积分的技术，已经广泛应用于化学分析、生物学、医学、环境监测等领域中。
比率荧光探针的基本原理是，通过化学修饰，将两种不同的荧光染料分别固定在一个分子结构上，其中一种荧光染料被称为“感受器”（感光体），用于识别特定离子或小分子，而另一种荧光染料则被称为“参比体”，在比率荧光探针中用于校正分析结果。
当感受器与目标分子发生反应时，其荧光性质会发生改变，从而影响到比率荧光探针两种荧光染料的荧光发射强度比值。
通过检测这种荧光发射强度比值的变化，可以准确、定量地测定目标分子在样品中的浓度或存在状态。
比率荧光探针的检测机理包括两个方面：第一，感受器与目标分子发生的化学反应机制；第二，荧光发射强度比值的测定机制。
1. 感受器与目标分子的化学反应机制比率荧光探针的感受器通常是一种带有特定结构的荧光染料分子，常见的有吡咯类、硫代嘧啶类和萘酰亚胺类等。
这些化合物的分子结构中通常包括类似于酰胺、亚胺、酯等的官能团，这些官能团可以与目标分子进行亲和性反应，从而导致感受器分子的荧光性质发生变化。
以吡咯类荧光探针为例，当其与金属离子结合时，感受器分子中的吡咯环将形成一个配位环境，与金属离子发生络合反应，从而导致吡咯环中的π电子发生重排，使其吸收波长向长波移动，荧光发射波长向短波移动。
这种荧光性质的变化对比率荧光探针的发光机理至关重要，因为只有在感受器与目标分子发生化学反应后，才能产生荧光强度变化，从而反映目标分子的浓度变化。
2. 荧光发射强度比值的测定机制在比率荧光探针中，参比体荧光染料的作用相当于一个“内部标准”，用于校正测定结果中的误差，因此其荧光发射强度比值与感受器荧光发射强度比值的变化对比率荧光探针的检测结果至关重要。
荧光发射强度比值的测定通常采用两种方法：一种是双光子激发荧光（TPF）技术，另一种是激发-发射荧光光谱（Emission-Excitation Fluorescence Spectroscopy, EEM）技术。
基于纳米复合物比率荧光探针的制备与荧光可视化检测研究
摘要荧光纳米材料是指在三维空间中至少有一维处在纳米尺度范围的材料。
由于该材料具有合成方法多样、表面易功能化、发射波长可调谐、光化学性质稳定、生物相容性好且毒性低等优点，得到学术界的广泛关注。
作为荧光纳米颗粒的金属纳米簇以及碳量子点等，具有合成粒径小、光致发光稳定、量子产率高、荧光稳定性强、细胞毒性低等优点，在物质检测和化学成像领域前景广阔。
本文设计了两种新型的基于荧光共振能量转移效应的纳米复合物比率荧光探针，用于检测实际样品中的生物分子。
主要研究内容如下：一、设计了一种基于银纳米簇和罗丹明6G的比率型荧光探针用于三聚氰胺的可视化检测。
本研究制备了蓝色荧光的银纳米簇，发射波长在500 nm。
通过罗丹明6G与银纳米簇的相互作用，合成了DNA-AgNC-Rh6G的自组装复合物。
加入三聚氰胺后，与银纳米簇通过氢键相结合，发生抗荧光共振能量转移效应，导致了DNA-AgNC-Rh6G自组装复合物分解，银纳米簇的荧光增强，罗丹明6G在570 nm处的荧光强度减弱。
该探针对于三聚氰胺的线性检测范围为0.1~10 μM，检测限低为25 nM。
该方法对奶粉样品中添加的三聚氰胺具有高选择性和灵敏性，并且实现水溶液和滤纸上的可视化检测三聚氰胺。
二、构建了一种基于四氧化三铁磁性纳米粒子，结合蓝色碳点的Fe3O4@B-CDs@MIPs比率荧光探针，用于实际样品中检测藻红蛋白。
通过分子印迹技术，将蓝色碳点与橙色荧光的藻红蛋白连接，洗脱掉藻红蛋白后构建得到比率荧光传感器。
加入藻红蛋白后发生荧光共振能量转移效应，使得蓝色碳点在450 nm处的荧光减弱，藻红蛋白在605 nm处的荧光随加入的不同浓度逐渐增强，快速实现藻红蛋白的检测。
该探针的线性检测范围为5~200 nM，最低检测限为1.6 nM，同时可以快速地测定环境水样中的藻红蛋白含量，回收率高。
关键词：银纳米簇；碳量子点；DNA；比率荧光；三聚氰胺；藻红蛋白；AbstractNanomaterials belong to the material that has at least one dimension in the three-dimensional range with the nanometer scale. Due to their various synthetic methods, easy-functionalized surfuces, tunable emission wavelength, stable photochemical property, good biocompatibility and low toxicity, nanomaterials have received extensive attention in the academic community.As typical fluorescent nanomaterials, noble metal nanoclusters and carbon dots have many advantages, such as small synthetic particle sizes, stable photoluminescence, high quantum yields, strong fluorescence stability and low cytotoxicity, etc. They have broad prospects in the application fields for substance detection and chemical imaging. This work designed two novel detection systems for dual-signal ratiometric fluorescence probes, based on fluorescence resonance energy transfer (FRET) effects for the detection of biomolecules in actual samples. The main research contents are available as follows:(1)A ratiometric fluorescent probe based on AgNCs and Rhodamine 6G was designed to visualize melamine detection. AgNCs emitting blue fluorescence were prepared, and the maximum emission wavelength is 500 nm. A self-assembled complex of DNA-AgNC-Rh6G was synthesized by the interactions between Rhodamine 6G and DNA-AgNCs. When melamine was added, melamine combined with AgNCs through hydrogen bonding, which led to the decomposition of DNA-AgNC-Rh6G self-assembled complex. The fluorescence resonance energy transfer effect disappeared, which made the fluorescence enhancement of AgNCs. The fluorescence intensity of Rh6G at 570 nm was weakened. The probe exhibits a concentration range of melamine from 0.1 to 10 μM and the detection limit is 25 nM. The method has high selectivity and sensitivity to melamine, and visual fluorescence detection in aqueous solution and on filter paper.(2)The ratiometric fluorescent probes Fe3O4@B-CDs@MIPs were constructed based on blue fluorescence carbon dots and Fe3O4 magnetic nanoparticles to detect phycoerythrin in the actual sample. The probes were constructed by molecularly imprinting technology, using the blue fluorescence emitting carbon dots and orange fluorescence emitting phycoerythrin. When phycoerythrin was added, the fluorescence resonance energy transfer effect occurred. The fluorescence of the blue carbon dots at 450 nm was slightly weakened and the fluorescence of phycoerythrin at 605 nm was gradually increased with the addition of phycoerythrin of different concentrations, which rapidly realized the detection of phycoerythrin. The linear detection range is 5~200 nM. The detection limit is about 1.6 nM.Simultaneously, the probe can be successfully applied to the determination of phycoerythrin in environmental water samples, together with high recoveries.Keywords: Noble metal nanoclusters; Carbon dots; DNA; Ratiometric fluorescence; Melamine; Phycoerythrin;目录第一章绪论 (1)1.1荧光纳米颗粒 (1)1.1.1碳量子点 (1)1.1.2银纳米簇 (10)1.1.3稀土上转换荧光材料 (14)1.2比率荧光分析 (16)1.3荧光纳米颗粒比率探针 (17)1.4荧光有机染料比率探针 (18)1.5纳米颗粒和有机染料比率探针 (19)1.6论文的选题背景及主要内容 (21)第二章基于银纳米簇与罗丹明6G复合型比率荧光探针用于三聚氰胺可视化检测 (22)2.1 引言 (22)2.2实验部分 (24)2.2.1主要试剂与仪器 (24)2.2.2制备DNA-AgNCs (24)2.2.3构建DNA-AgNC-Rh6G比率荧光探针 (25)2.2.4选择性和灵敏度检测三聚氰胺 (25)2.2.5实际样品中可视化检测三聚氰胺 (25)2.3 结果与讨论 (26)2.3.1 DNA-AgNCs的形貌与表征 (26)2.3.2 DNA-AgNC-Rh6G的表征及其荧光可视化 (28)2.3.3比率荧光传感器的性能及其检测机制 (30)2.3.4实际样品中三聚氰胺的比率和可视化荧光检测 (32)2.4本章小结 (34)第三章磁性碳量子点内包覆的分子印迹传感器用于藻红蛋白的比率荧光检测 (35)3.1引言 (35)3.2实验部分 (36)3.2.1试剂与仪器 (36)3.2.2制备水溶性Fe3O4 MNPs (37)3.2.3合成蓝色荧光B-CDs (37)3.2.4制备Fe3O4@B-CDs@MIPs比率荧光传感器 (37)3.2.5高灵敏度和选择性检测藻红蛋白 (38)3.2.6实际样品中检测藻红蛋白 (38)3.3结果与讨论 (38)3.3.1 Fe3O4@B-CDs@MIPs的构建和检测机制 (38)3.3.2 Fe3O4@B-CDs@MIPs的形貌和性能表征 (40)3.3.3比率检测藻红蛋白的实验优化 (43)3.3.4比率荧光传感器的灵敏度和选择性 (44)3.3.5实际样品中检测藻红蛋白 (47)3.4本章小结 (48)第四章结论与展望 (49)参考文献 (50)攻读学位期间的研究成果 (59)致谢 (60)学位论文独创性声明 (61)学位论文知识权产权属声明 (61)青岛大学硕士学位论文第一章绪论1.1荧光纳米颗粒作为新兴的材料，纳米材料指的是材料的三维空间中至少有一个维度处于纳米范围。
荧光比率探针及其应用研究进展
７前 言荧光比率技术是荧光分析中的一项重要技术。
该技术在生物染色剂中，可被紫外线或蓝紫光（短波长光）激发而发射荧光的染料，称为荧光染料（荧光色素）。
可被长波长光激发，这些荧光色素常称为荧光探针。
荧光探针通常用于固定组织和细胞的染色，以及或活细胞中的应用， 此外还包括应用于体内荧光探针。
分子荧光探针按用途分类包括离子探针、极性探针、粘度探针、ＰＨ值探针、膜荧光探针、细胞活性探针、细胞器探针、位点特异性荧光探针等等。
探针通过与分析物（如生命金属离子）进行结合后，引起荧光特性发生变化，通过测定荧光的激发波长、发射波长、荧光强度、峰位、荧光寿命、荧光量子产率和各向异性等，获得相关信息。
荧光方法测定中，荧光探针在与反应物结合后，出现激发或发射光谱移位的探针，可使用在两个不同波长测定的荧光强度比率进行测定，称为比率测量。
因为通过二个选择性的波长的荧光强度变化可作为定量的依据， 通常指在波长范围内有荧光强度明显的变化。
同普通荧光探针相比，比率测量探针可以被分为两部分。
一种是荧光比率效果是通过原来荧光谱的迁移。
通常，这些迁移的背景是荧光探针激发态的电子转移。
它被激发通过改变发色团同周围分子或原子交互作用的能量改变（溶剂化显色迁移），同外部电场的交互作用（电致显色迁移）和在发色团中的双电弛豫（双电弛豫迁移）。
另外一种结合探针，荧光谱包括２个或更多的谱带。
通常，是这些谱带相对强度的改变，激发态同荧光探针发色团反应。
这些反应在不连续的能量状态。
荧光比率探针及其应用研究进展杨柳＊ ，郭成海，张国胜（防化研究院第四研究所，北京 １０２２０５）摘要 本文介绍了荧光比率探针，包括阳离子探针、阴离子探针、ｐＨ值探针、极性探针、氧化性和分子的比率测量探针的应用及近几年的研究进展。
关键词 荧光分析，比率测量＊作者简介：杨柳（１９７５－），男，助理研究员，博士研究生，Ｅ－ｍａｉｌ：ｙａｎｇｌｉｕｊｉｎｊｉｎ＠ｓｉｎａ．ｃｏｍ所以在初始和产物状态都随着能量转移而发射荧光。
基于FRET机理的比率型次氯酸荧光探针
Fluorescence resonance energy transfer
当一个荧光团处于激发 态时，由于能量过高，使得 该荧光团不稳定，为降低自 身能量，
该荧光团会将自身能量转移给 相邻的分子，实现能量由供体 向受体转移，该过程就叫荧光 共振能量转移（FRET）。
2Part
荧光探针分子设计思路
合成路线
合成路线
荧光探针的检测
探针分子结构表征
01
NMR IR MS X-ray
选择性
抗干扰性
荧光检测
敏感性
02
pH影响
响应时间
生物比率成像
03
细胞损伤程度，膜透性，
光稳定性
4Part 探究结果预期
结果预期
水溶性好
激发 波长长
响应 时间短
细胞毒性小
致谢
THANKS
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Wavelength (nm)
荧光探针的背景
荧光探针检测
响应迅速
1 灵敏度高
2
普通检测方法
3 原位检测 选择性好 4
1. 处理复杂 2. 损耗大 3. 敏感性低
近年来，利用小分子荧光探针可视化监测生物体内 的次氯酸是化学和生物学领域的研究热点之一。
细胞中 浓度的普通检测方法
普通检测方法，如：???????????，需要复杂的事后处理而且 会对样品造成损耗。
荧光探针设计机理及发展方向
荧光探针设计机理及发展方向荧光探针是一种能够通过光激发产生荧光信号的分子或纳米结构，被广泛应用于生物检测、环境监测、化学分析等领域。
荧光探针的设计机理和未来发展方向是本文将探讨的主题。
一、荧光探针的设计机理1.荧光分子荧光分子是荧光探针的基础，其设计原理主要基于分子的吸收光谱和发射光谱。
在受到光激发后，分子会从基态跃迁到激发态，当其返回到基态时，会以释放光子的形式释放出能量。
不同结构的荧光分子具有不同的吸收和发射光谱，因此可以根据需要选择特定的荧光分子作为探针。
2.荧光纳米结构荧光纳米结构是利用纳米材料制作而成的探针，具有高灵敏度、高分辨率和高稳定性等优点。
荧光纳米结构的设计原理主要基于量子点、量子阱等纳米材料的特殊光电性质。
通过调节纳米材料的尺寸和组成，可以改变其吸收和发射光谱，实现特定的检测目标。
二、荧光探针的发展方向1.高灵敏度与高特异性提高荧光探针的灵敏度和特异性是未来发展的重要方向。
高灵敏度的荧光探针可以检测到低浓度的目标物质，提高检测的准确性和可靠性；高特异性的荧光探针可以区分不同的目标物质，防止误判。
2.多功能化与集成化多功能化与集成化是荧光探针的另一个发展方向。
多功能化的荧光探针可以在同一时间内检测多种目标物质，提高检测效率；集成化的荧光探针可以将检测和信号转换器件集成在一起，实现便携式和实时检测。
3.生物相容性与无损检测生物相容性和无损检测是荧光探针的重要发展方向。
生物相容性的荧光探针可以应用于活体检测，实现对生物体内生理参数的实时监测；无损检测的荧光探针可以在不损害样品的情况下进行检测，适用于医学、文物等领域。
4.智能化与自动化智能化与自动化是荧光探针的未来发展趋势。
智能化的荧光探针可以通过计算机控制实现自动化检测，提高检测效率；自动化的荧光探针可以通过机器人技术实现样品自动采集和处理，减少人为误差。
三、总结荧光探针作为一种重要的分析工具，在生物医学、环境监测、化学分析等领域发挥着重要作用。
荧光探针的应用与进展PPT课件
Analytical Chemistry（Anal. Chem., 2016, 88,1821-1826）
荧光探针的应用进展
Analytical Chemistry（Anal. Chem., 2016, 88,1821-1826）
荧光探针的应用进展
结论 利用所合成制备的两种不同的Polymer-Py/γ-CD主客体复合物， 实现了对四种不同蛋白样品的特异性识别检测。不同的聚合物链与不 同的蛋白的结合常数不同，因而所构建的聚合物基质荧光探针对蛋白 具有良好的选择性。而通过调节聚合物链的长度，还可进一步调节蛋 白识别检测的灵敏度和选择性。 这个方法不但制备简单、普适性强，而且具有较高的荧光检测灵敏度 和较强的蛋白识别选择性，为构建新型聚合物基质的主客体复合物荧 光探针的制备及蛋白识别分析提供了新的研究思路。
Analytical Chemistry（Anal. Chem., 2016, 88,1821-1826）
荧光探针的应用进展
Simultaneous Near-Infrared and Two-Photon In Vivo Imaging of H2O2 Using a Ratiometric Fluorescent Probe based on the Unique Oxidative Rearrangement of Oxonium 利用比率荧光探针实现在体内对H2O2的近红外和双光子成像
给电子取代基如：-NH2，-NR2，OH，-OR和-CN。 吸电子取代基如：-C = O，COOH，-CHO，-NO2和-
外因
溶液的PH值、温度 激发光源的选择 溶剂的性质如极性、介 电常数 染料分子间相互作用等
荧光探针的选择原则
（1）荧光的定性或定量 定性一般选择单波长激发探针，定量最好选择双波长激发的比率探针 （2）荧光探针的特异性和毒性 （3）荧光探针的适用PH （4）激发波长与发射波长 斯托克斯位移 （5）荧光强度与荧光寿命 （6）光稳定性、漂白性 （7）荧光量子产率
荧光比率探针及其应用研究进展
荧光比率探针及其应用研究进展荧光比率探针的设计与合成是实现其应用的关键。
目前，常用的方法有：分子间电荷转移（intramolecular charge transfer, ICT）和分子内环境变化（intramolecular environment change）两种策略。
ICT策略中，通过调整分子的范德华体积相互作用或空间构型的改变来实现荧光比率的变化；而环境变化策略则是通过分子内部特定的功能部分与靶物质之间的相互作用引发荧光强度或波长的变化。
荧光比率探针的应用研究涉及多个领域。
在生物医学中，荧光比率探针可以用于生物标记、细胞成像和疾病诊断。
以DNA为例，荧光比率探针能够在不同荧光波长下对DNA进行特异性的检测和定量分析，应用于基因测序、核酸适体结构和功能研究等。
在环境监测领域，荧光比率探针可以应用于水质、大气和土壤等环境中的污染物的检测和监测。
例如，通过改变探针分子的结构或环境，使其对其中一种特定污染物具有选择性响应，能够实现对该污染物的灵敏快速检测。
在食品安全领域，荧光比率探针可以用于食品中有害物质的检测，如农药残留物、重金属离子和食品添加剂等。
除了上述领域外，荧光比率探针在其他领域中也得到了广泛的应用。
例如，在材料科学中，荧光比率探针可以用于材料的制备和表征。
通过在材料中引入荧光比率探针，可以实现对材料性质和结构的准确表征和监测。
此外，在光电子学和光学材料领域，荧光比率探针也被用于光电器件的制备和性能的研究。
以染料敏化太阳能电池为例，荧光比率探针可以用于对光敏染料吸附量、电子转移过程和光电转化效率等进行评价。
总的来说，荧光比率探针具有灵敏度高、选择性好和响应快的优势，可应用于生物医学、环境监测、食品安全、材料科学等领域。
随着新材料和新方法的不断发展，以及对荧光比率探针应用研究的深入，相信荧光比率探针在更多领域将发挥重要作用。
比率荧光探针的构建及应用
比率荧光探针的构建及应用双比率荧光探针是利用两个独立的变化动态来识别分子的有效方法。
它的结构非常简单，其中一个（甲基）比率被设置为恒定的，而另一个（丙基）比率改变以检测分子可能存在的水平变化，因此可以用于探测生物分子，尤其是小分子分子。
两个独立的变化比率的内在原理是，以丙基紫外发射荧光素通过变化路径来识别潜在的分子。
由于它使用双重动态分析，可以更好地区分存在复杂水平变化的生物分子。
此外，它在分子识别和定性/定量分析方面比其他探针技术（如传统二进制像探针）更有效率。
双比率荧光探针的应用相当广泛，它可用于检测和跟踪仅出现在微量水平的生物分子及其所属的生物体质量。
它可用于检测活性素、多肽和药物，以及DNA、RNA或小分子抑制剂。
最近，它还被用于基因组学研究，尤其是在生物浆料分离、基因鉴定和体外检测研究中。
在总结，双比率荧光探针是一种技术简单而又灵活的工具，它可用于识别微量水平的生物分子，在分子识别和定性/定量分析方面比传统的探针技术更有效率，具有广泛的应用性。
双比率荧光探针是利用两个独立的变化动态来识别分子的有效方法。
它的结构非常简单，其中一个（甲基）比率被设置为恒定的，而另一个（丙基）比率改变以检测分子可能存在的水平变化，因此可以用于探测生物分子，尤其是小分子分子。
两个独立的变化比率的内在原理是，以丙基紫外发射荧光素通过变化路径来识别潜在的分子。
由于它使用双重动态分析，可以更好地区分存在复杂水平变化的生物分子。
此外，它在分子识别和定性/定量分析方面比其他探针技术（如传统二进制像探针）更有效率。
双比率荧光探针的应用相当广泛，它可用于检测和跟踪仅出现在微量水平的生物分子及其所属的生物体质量。
它可用于检测活性素、多肽和药物，以及DNA、RNA或小分子抑制剂。
最近，它还被用于基因组学研究，尤其是在生物浆料分离、基因鉴定和体外检测研究中。
在总结，双比率荧光探针是一种技术简单而又灵活的工具，它可用于识别微量水平的生物分子，在分子识别和定性/定量分析方面比传统的探针技术更有效率，具有广泛的应用性。
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有机化学Chinese Journal of Organic ChemistryARTICLE* E-mail: yuhaibo@Received September 23, 2014; revised November 18, 2014; published online December 2, 2014.Project supported by the National Natural Science Foundation of China (21302080). Program Funded by Liaoning Province Education Administration (L2014010).国家自然科学基金(No.21302080)，辽宁省教育厅科研项目(No.L2014010)资助项目.DOI: 10.6023/cjo201409036 基于EET 机理比率型荧光探针的研究进展陈忠林a 李红玲a 韦驾a 肖义b 于海波a ,*(a 辽宁大学 环境学院 沈阳 110036)（b 大连理工大学 精细化工国家重点实验室 大连 116024)摘要 激发态能量转移（Excitation Energy Transfer, EET ）作为一类重要的光物理现象，被广泛用于比率型荧光探针和分子灯标的设计以及DNA 检测等多个领域。
影响EET 效率的两个重要因素是供受体间的空间距离和光谱交盖，通过调节供受体间的空间距离或光谱重叠程度来调控能量转移过程，实现对目标客体的双波长比率检测。
本文综述了基于不同供受体荧光团的EET 体系、供受体间的连接方式对能量转移效率的影响，以及通过调控供受体间光谱重叠程度或空间距离，获得识别不同客体的比率型荧光探针，并对EET 机理的比率型荧光探针的设计以及未来在生物成像和医学检测等领域的应用进行了展望。
关键词 荧光探针; 激发态能量转移; Förster 能量转移; 比率型荧光探针; 荧光发色团Recent Progress in Ratiometric Fluorescent Probes Based on EET MechanismChen Zhonglin a Li Hongling a Wei Jia a Xiao Yi b Yu Haibo a *(a College of Environmental Sciences, Liaoning University, Shenyang)(b State Key Laboratory of Fine Chemicals, Dalian University of Technology, Dalian)Abstract Excitation Energy Transfer (EET) is one of the vital photophysical phenomenons, which is wide-ly used in many applications, such as the design of ratiometric fluroesent probes, molecular beacon and DNA analysis, and so on. The process of energy transfer from donor to acceptor can be regulated by two factors: the spatial distance between donor and acceptor, and the spectral overlaps between donor’s emission and acceptor’s absorption, which results that there is a wide variety in the ratio at two different wavelengths of ratiometric fluo-rescent probes. In this review, noticeable EET systems with different donor fluorophore, connection form and energy transfer efficiency between donor and acceptor, and the modulation of spatial distance or spectral overlap are summarized. Finally, as a promising tool, the future developing prospects of EET fluorescent probes in bioi-maging and medical diagnostics are discussed and highlighted.Keywords Fluorescent probe, Excitation energy transfer, Förster resonance energy transfer, Ratiometric probe, Fluorophore随着荧光显微成像技术和时间分辨技术的迅速发展，基于超分子化学和有机染料的荧光探针现已成为研究生物学和医学领域相关问题的重要工具。
荧光探针在与目标客体相互作用过程中荧光信号会发生改变，借助于荧光信号的变化，荧光探针能够对目标客体进行实时在线的检测或监测，并被广泛用于分析化学，生物化学，医学和环境监测等多个领域[1]。
荧光探针主要有三种类型：淬灭型、增强型和比率型。
由于增强型荧光探针在与目标客体作用后，荧光输出信号增强，在荧光显微成像中比淬灭型荧光探针更为灵敏，故增强型荧光探针是目前荧光探针领域设计的主流[2]。
与增强型荧光探针相比，比率型荧光探针在定量检测方面具有明显的优势，近些年来，比率型荧光探针的设计有机化学是目前荧光探针领域研究的热点之一[3-7]。
比率型荧光探针具有双波长发射（或激发）的特征，该波长比率值的变化独立于探针浓度和光源强度，其中最突出的特征在于其光谱形状及比率的变化值与检测客体的浓度一一对应，从而为定量检测客体分子提供依据。
自钱永健（Tsien R. Y.）[8,9]于1985年首次设计了钙离子比率型荧光探针Fura-Ca以来，分子内电荷转移（Intermolecular Charge Transfer，ICT）机制便成为设计比率型荧光探针的主要机理之一[10]。
除了ICT机制外，近些年来出现了多种比率型荧光探针设计机理和设计模式，其中较为出色的是利用激发态能量转移(Excitation Energy Transfer，EET)[11-14]机制来设计新型的比率型荧光探针。
关于EET机制和比率型荧光探针，前人已做了详细的介绍，其中Speiser[15]和Peng[16]等人分别对EET机理和比率型荧光探针的设计进行了总结。
与ICT机制的比率型探针相比，EET型比率荧光探针具有明显的优势：（1）激发波长单一，双发射峰重叠少，比率值变化更加明显。
受自身机制的限制，ICT型比率探针的双发射光谱存在较大重叠，比率值变化不明显并且在很大程度上会受到仪器灵敏度的限制，尤其是在荧光显微成像中，这一问题尤为突出；（2）比率值的变化不受溶剂极性等因素的干扰，EET体系中的荧光光谱取决于各自的荧光团，合理选择荧光团可以使其光谱不受“溶剂化效应”的影响，即比率值的变化不受微环境极性的影响，而仅仅与检测客体浓度相关。
众所周知，ICT型比率荧光探针的荧光团均为分子内电荷转移体系，溶剂化效应是其自身难以克服的固有缺陷。
EET机理能够克服上述ICT机理在设计比率型荧光探针方面的不足，具有广阔的前景。
为了使科研工作者更好的了解EET比率型荧光探针的设计和构建模式，本文主要对近年来EET比率型荧光探针的研究进展进行总结，以期望研发出更多新颖的比率型荧光探针。
1 激发态能量转移（EET）随着能量转移理论研究的不断深入，人们对能量转移过程有了更深的了解，设计合成了多种类型的EET体系[17,18]。
能量转移体系的分类方法不尽相同，依据能量传递的方式可以分为跨空间能量转移（Through-Space Energy Transfer,TSET）和跨键能量转移（Through-Bond Energy Transfer, TBET）[15,19]。
图1跨空间和跨键型能量转移体系示意图，a. 跨空间型能量转移体系；b. 跨键型能量转移体系Figure 1EET model of systems Through-Space (a) or Through-Bond (b)1.1 Through-Space Energy Transfer（TSET）跨空间(Through-Space，TS)能量转移机理由Prof. Förster（1910-1974）于1946年首次提出。
TSET体系是指两个不同的荧光团分别作为供体donor和受体acceptor，其中供体的发射光谱与受体的吸收光谱有一定程度的重叠，当两个荧光团相互靠近时（一般小于100Å），可观察到能量由供体向受体转移的现象，即当激发供体时，能量由供体转移至受体，从而最终观测到受体以辐射（荧光）或非辐射的形式将能量释放出去[20,21]，如图1a所示。
TSET 体系中供受体通过柔性链相互连接，该类型也称为Förster Resonance Energy Transfer，FRET,即Förster能量转移体系。
由于TSET体系中供受体间的连接方式采用柔性链连接，供体与受体间的空间取向（取向因子k2）会发生变化，取向因子k2的大小取决于供受体偶极跃迁的空间取向，通常其数值介于0-4之间，该数值的变化会直接影响对FörsterChinese Journal of Organic Chemistry半径的R 0的估算，如公式1所示[22]，最终会影响能量转移效率的计算。
取向因子k 2的影响在均一的溶液中并不显著，这是因为在均一的溶液中供受体间保持了较为稳定的空间距离和空间取向。
当采用TSET 体系作为分子标尺测量生物大分子的空间距离时，方向因子的影响就较为凸显，这是由于供受体的空间取向会受到微环境中其他生物大分子的干扰。
6/140420])()([211.0λλλελd I n k R A D D ∫∞−Φ= (1)式中k 2 表示偶极取向因子，能量供体与受体间的相互取向无规则时，因子k 2 = 2/3；ФD 是供体的量子效率；n 是溶剂因子；I D （λ）是供体的归一化荧光光谱；εA （λ）是受体的摩尔消光系数。