荧光探针研究新进展

《生物工程进展》2000,Vol.20,No.2

荧光探针研究新进展

章晓波　徐　洵

(国家海洋局第三海洋研究所,厦门　361005)

摘要　自从Southern(1975)首次进行DNA探针杂交后,至今核酸分子杂交已成为分子生物学的最基本方法。Matthews和Kricka[1]总结了各种杂交方法,将其归为两大类:一是异相杂交(hetero2 geneous assay)即固相杂交,目的核酸结合于不溶性支持物上;二是同相杂交(homogeneous assay)即液相杂交,一般同时使用两个探针。为了检测杂交,寡核苷酸探针需要标记,探针的标记物有放射性同位素和非放射性标记物。固相杂交常使用放射性同位素,荧光素是一种非放射性标记物,它能检测到的DNA浓度比吸收减色测定方法所需DNA浓度低100-1000倍[2],在同相杂交中广泛用于探针的标记。最近,荧光探针研究获得了新的进展,Tyagi和Krammer(1996)建立了一种新的荧光探针-分子信标探针,并得到许多应用,我们实验室也开展了这方面的研究。本文拟对荧光探针的研究进展作一综述。

关键词　荧光探针　分子信标探针　荧光PCR

1　常规荧光探针

固相杂交中,探针非特异结合于支持物表面,降低了灵敏度。Heller等(1982)以及Heller和Morri2 son(1985)[3]最早进行了同相杂交试验,同相杂交不需支持物,减少了固定目的DNA及除去未杂交探针等操作。他们的试验中使用了两个探针,这两个探针分别与目标DNA的两个相邻区域互补,第1探针在3′末端标记,第2探针在5′末端标记,根据标记物的光谱特性,使第1标记物为第2标记物的能量供体。当探针与目标DNA杂交时,二探针彼此靠近,光吸收或化学反应激发供体标记物,通过能量转移引起受体标记物的激发,这样,第1标记物发射光的减少以及(或)第2标记物发射光的增加标志着目标DNA的存在。

后来Morris on等[3]扩展了这一方法,他们使用的两个探针互补且相应于目标DNA上同一碱基序列,一个探针在5′末端标记荧光素,另一互补探针在3′末端标记荧光素发射的淬灭剂芘丁酸(pyrenebutyrate)或磺基若丹明101(sulforhodamine101)。无目标DNA 时,两探针结合,荧光素的能量转移至淬灭剂,不产生荧光。存在目标DNA时,探针与目标DNA之间竞争杂交,由于探针与目标DNA的结合,在494-496nm 光照下,产生荧光,目标DNA浓度越高,荧光信号越强,最低可检测到4pM的目标DNA,此方法得到一些应用[2,4,5]。Cardullo等[4]在应用Morris on方法的同时,提出在两个互补探针的5′末端分别标记荧光素和四甲若丹明(T etramethylrhodamine),因为荧光共振能量转移(fluorescence res onance energy trans ferr FRET)的效率随供体和受体之间距离的-6次方而减少,当两者相距20个核苷酸(70!)即产生不明显的能量转移,因此此方法中所使用的探针长度较短,特异性降低。

2　分子信标探针

同相杂交一般同时采用两个标记探针,Tyagi 和Kramer(1996)[6]首次建立了分子信标探针(molecular beacon probe),在同一寡核苷酸探针的5′末端标记荧光素、3′末端标记淬灭剂(DABCY L)。分子信标探针能形成发夹结构,探针的噜扑环与目的DNA碱基互补,噜扑环两侧为与目的DNA无关的碱基互补的臂。无目的DNA时,探针形成发夹结构,荧光素靠近淬灭剂,荧光素接受的能量通过共振能量转移至淬灭剂,DABCY L吸收能量后以热量形式消失,结果不产生荧光。当探针遇到目的DNA 分子时,形成一个比两臂杂交更长也更稳定的杂交,探针自发进行构型变化,便两臂分开,荧光素和淬灭剂随之分开,此时在紫外照射下,荧光素产生荧光。

影响分子信标探针构型变化的参数主要有[6]:臂长、臂序列GC含量、噜扑环长度和溶液盐浓度,尤其是二价阳离子如Mg2+对两臂形成的杂交茎有较强的稳定作用,在Mg2+存在条件下,4～12个核

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苷酸可形成稳定的杂交茎。噜扑环长度至少应是臂长的2倍,才能保证探针与目标DNA杂交及荧光素与淬灭剂分开。

Sanjay[6]用与噜扑环完全互补且等长的DNA 与分子信标探针杂交,发现当目的DNA有一个碱基错配或缺失时,均不产生荧光,因此他认为只有完全互补的DNA才能与分子信标探针杂交。

Nazarenko[7]在进行荧光PCR时改进了分子信标探针,他将引物设计成发夹结构,5′端标记荧光素,发夹茎上与标记荧光素的碱基互补的碱基标记DABCY L,3′末端不标记,5′端数个碱基与目的DNA 无关,其余则均可与目的DNA杂交。尽管这种方法提高了探针的有效性,但我们认为,这种方法需要中间碱基标记,成本较高,按现有技术,这种标记的碱基只能是T,这样对探针序列多了一种限制,会影响到其特异性,而且在PCR中同时采用特异引物扩增及探针杂交可更确保结果的真实性。

分子信标探针与目的DNA杂交后,末杂交的探针有残余荧光,其原因可能是将荧光素和淬灭剂与碱基相连的烷基过长或杂交茎末端的瞬间解开造成的[6],也有可能由非数量淬灭和少量只标记了荧光素的寡核苷酸的存在引起[7]。

3　荧光探针用于PCR检测

为了提高荧光探针的灵敏度,通常将它与PCR 结合使用。PCR能检测出极微量的DNA,被广泛应用于疾病的检测,通常的做法是对PCR产物用荧光探针或荧光剂进行检测[3,4,8,9]。由于PCR的极度灵敏性,常出现因污染而产生的假阳性,有一些方法试图解决这一问题[10,11,12],但更简单也更有效的方法是模板的扩增及检测在同一个封闭的试管中进行。有两种方法:(1)TaqMan试验[7,13,14],这种方法是3′端标记荧光基团,5′端标记淬灭剂,利用DNA酶的5′外切活性对扩增过程中与PCR产物结合的探针进行切割,以产生荧光,但此方法的未杂交探针背景较高。(2)利用分子信标探针进行荧光PCR[6,7],分子信标探针适合于这种目的,因为在PCR过程中,分子信标探针的构型随温度的变化而改变,其变性及形成发夹的速度极快,发夹复性只需1微秒,在整个过程中分子信标探针都存在[7]。分子信标探针应用于PCR,不仅可以减少污染,而且可以省略扩增后电泳、点杂交等分析步骤。

在PCR过程中,分子信标探针可与PCR产物的一条链退火杂交,处于开放构型,可检测到荧光,同时进行非目的模板扩增不影响分子信标杂交[6,7]。

考虑到杂交信号受探针的有效性的影响,可能有的探针不能与PCR产物杂交,Nazarenko等[7]将PCR引物设计成发夹探针,这种引物不影响PCR 扩增,发夹茎及噜扑环长度对PCR产物影响较小,但3′端单链长度有影响,当单链长度为6个核苷酸时,无PCR产物,这可能是即使在退火温度下,引物仍为发夹结构,单链长度不够长。发夹引物的主要优点是荧光信号靠PCR产物本身产生,而不是如前述方法[6,13,14]一样由探针产生,使得背景较低,但同时存在前述的缺点。

4　荧光剂

荧光染料的种类很多,如荧光素、若丹明(rho2 damine)、乙锭、香豆素、伊红(eosin)、芘丁酸、EDANS(522′2aminoethyl)aminonaphthalene212sul2 fonic acid)等。同相杂交中所使用的荧光探针供体与受体之间的作用依赖的是共振能量转移,而共振能量转移的效率与供体荧光基团发射光谱同受体基团激发(吸收)光谱的完全重叠有关,为了荧光能有效淬灭,供体的发射光谱应完全覆盖受体的激发光谱[15]。符合此要求且较常用的荧光剂2淬灭剂有: EDANS和DABCY L(42(4’2dimethy2 laminophenylazo)benzoic acid)[6]、62荧光素和DAB2 CY L[7]。荧光素和若丹明、荧光素和芘丁酸[3]、荧光素和伊红[16]、香豆素和乙锭[17]、anthranilamide 和氮酪氨酸(nitrotyrosine)[15]、一些铽螯合物和四甲若丹明[18]等等,其中DABCY L被广泛应用于分子信标探针。

Matayoshi[19]最早使用EDANS和DABCY L, DABCY L是一种非荧光基团,它的吸收光谱覆盖了EDANS的发射光谱,无DABCY L时,EDANS接收到的辐射能量被贮存,数纳秒之后以一种较长波长的光发射,当EDANS和DABCY L靠近可发生共振能量转移时,EDANS中贮存的能量充分转移至DABCY L且以热能散失,因此供体的发射光不会受到受体的干扰。EDANS的荧光寿命平均为13纳秒,对于未杂交的分子信标探针,EDANS在产生荧光之前,足以有时间把能量转移至DABCY L。EDANS是负电性、亲水的,DABCY L中性、疏水的,因此它们不相互吸引也不相互排斥,这样不会改变茎杂交的内在稳定性[6,19]。

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