单克隆抗体的制备流程
单克隆抗体制备
单克隆抗体制备1. 免疫动物：三只Balb/c小鼠2. 佐剂：首先用完全弗氏佐剂（CFA），后用不完全弗氏佐剂（IFA）。
3. 免疫原：蛋白或KLH偶联多肽。
每次免疫使用50-100µg免疫原。
4. 免疫：用PBS稀释免疫原，然后与相应的佐剂1：1混合。
抗原和佐剂完全混合形成稳定的乳剂，将该乳剂在小鼠双肩周围的皮肤下进行皮下注射和后腿进行肌肉注射。
每个区域大约用1/8的免疫原。
接着将1/2的免疫原进行腹腔注射，这样免疫原可以持久存在从而提高免疫应答。
以后每个星期进行腹腔注射直到达到要求的效价。
5. 第0星期预采血完全弗氏佐剂（CFA）混合的100µg抗原免疫小鼠。
第2星期完全弗氏佐剂（CFA）混合的50µg抗原免疫小鼠。
第3星期不完全弗氏佐剂（IFA）混合的50µg抗原免疫小鼠。
第4星期溶解在PBS中的50µg抗原免疫小鼠。
第5星期取适当的细胞或组织进行ELISA和WB检测，溶解在PBS中的50µg抗原免疫小鼠。
第X星期取适当的细胞或组织进行ELISA和WB检测，溶解在PBS中的50µg抗原免疫小鼠。
6. 杂交瘤融合和筛选：用PEG方法将效价最好的小鼠脾细胞和骨髓瘤细胞F0进行融合。
用抗原对融合的杂交瘤克隆进行筛选，检测它们的特异性和敏感性。
ELI SA阳性的克隆可用WB检测，筛选出来的克隆至少还需要亚克隆两次。
7. 大规模抗体生产：筛选得到两个克隆最后进行大规模培养（每个克隆1L）或者取腹水（每个克隆5只小鼠）。
用蛋白A/G对培养液或腹水进行纯化，平均每个克隆可以得到3-5mg 抗体。
8. 注意：每个融合平均可以得到900多个克隆，对于多肽抗原可以得到100个左右的ELISA阳性克隆，重组蛋白抗原可以得到100-150个ELISA阳性克隆。
亚克隆实验做的越早，越容易保存克隆。
因此，为了保存和复苏阳性克隆，尽早进行筛选检测是必需的。
制备单克隆抗体的流程
制备单克隆抗体的流程首先呢，得免疫动物。
就是要给动物注射特定的抗原哦。
这个抗原的选择可重要了呢！我觉得这一步得好好考虑清楚，要根据你想要得到的单克隆抗体的特性来选抗原。
你可别随便就选一个呀！当然啦，不同的动物对不同抗原的反应可能不太一样，这就需要你有点经验或者多做些小试验来确定啦。
接下来，就是取免疫后的动物细胞啦。
一般是取脾脏细胞，这一步要小心点哦！因为脾脏这个器官比较脆弱，要是不小心弄坏了，可能会影响后面的实验呢。
不过也不用太紧张，只要按照基本的操作规范来就好。
然后呢，要把取出来的细胞和骨髓瘤细胞融合。
怎么融合呢？这就用到一些特殊的试剂啦。
这一步呀，我觉得在操作的时候要特别细致。
根据我的经验，融合的条件得控制好，像温度啊、试剂的浓度啊这些，要是稍微有点偏差，可能融合的效果就不太理想了。
融合之后呢，就有了杂交瘤细胞啦。
这时候要进行筛选哦。
为什么要筛选呢？因为我们只想要得到那些成功融合的细胞呀！这一步可不能马虎，要把那些没融合好的细胞或者其他杂质细胞去掉。
这个筛选的方法有好几种呢，你可以根据自己实验室的条件和习惯来选择，我觉得这环节可以根据实际情况自行决定。
筛选出杂交瘤细胞后，就是克隆化培养啦。
这一步很关键呢！要让这些细胞不断地繁殖，得到足够多的细胞。
刚开始可能会觉得这个过程有点漫长，不过习惯了就好了。
在这个过程中，要注意细胞的生长状态，给它们提供合适的生长环境，像营养物质啊、温度啊、湿度这些都得照顾到。
最后呢，就是要检测单克隆抗体啦。
看看你得到的抗体是不是你想要的那种。
这一步要特别注意！小提示：别忘了最后一步哦！要是前面都做对了，最后却没检测好，那可就有点亏啦。
好啦，这就是制备单克隆抗体的大致流程啦。
当然啦，在实际操作过程中，可能会遇到各种各样的小问题，但只要多做几次，积累经验，就会越来越熟练的。
希望大家都能顺利制备出自己想要的单克隆抗体哦！。
单克隆抗体制备流程
单克隆抗体制备流程一、免疫准备1）试剂：弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂2）常用免疫原：纯化蛋白、融合蛋白、多肽。
3）耗材：1ml、2ml注射器，橡胶管，1.5ml EP管，刀片（或毛细玻璃管），酒精棉球。
4）免疫动物：小鼠（BALB/c,雌性6-8周）5）乳化器（或者手动推）二、免疫过程1）免疫前取血取血方式：酒精棉擦拭尾部后（酒精多了伤口挤压出来的血液易分散），用锋利的刀片在小鼠尾部靠近静脉处划开小口，如下图箭头所示方向从上往下挤压血管，血从伤口处流出后用枪吸取放入EP管中（30ul血够用）离心取上清放冰箱备用。
此方法取血最为简单易行，避免眼球取血毛细管扎瞎老鼠眼睛。
注意点：①避免切断老鼠尾巴②切口劲量靠近尾末端，方便挤压血管③伤口消毒酒精不要太多，不利于伤口血液凝固。
2）免疫原制备：一支2ml注射器吸抗原，另一支注射器吸等量体积佐剂，橡胶管连接两支注射器来回推几下混匀，然后放乳化器上乳化（为防止蛋白变性，乳化器上可放置冰袋），大约来回推1500次左右可乳化完全（滴一小滴到静水中若不扩散说明乳化完全）。
换上1ml注射器针头免疫小鼠（2ml注射器免疫不好控制，可将乳化液转移到1ml注射器中免疫，但这样会损失部分抗原）。
注：①每只老鼠免疫蛋白量10-100ug,初次免疫参考量50ug蛋白/只，加强免疫及融合前冲击免疫25ug蛋白/只。
初次免疫使用弗氏完全佐剂，加强免疫使用弗氏不完全佐剂，融合前冲击免疫不使用佐剂可用缓冲液如PBS等稀释抗原（如果需要）。
②免疫量100ul-300ul/每只小鼠。
③多点免疫，一针不要打太多。
3）免疫方式和免疫时间根据免疫原决定免疫方式，皮下免疫和腹腔注射较为常见(纯化蛋白、融合蛋白多肽)。
皮下注射免疫，免疫时间间隔为2周，第三次免疫一周后（8-10d）采血测效价，决定是继续加强免疫还是冲击免疫后做融合。
较好的效价应该在10W以上，附表1 免疫接种时间表天数操作佐剂免疫方式0 初次免疫CFA 皮下14 第二次免疫IFA 皮下28 第三次免疫IFA 皮下36-38 收集血清测效价＿＿42 第四次免疫（如果需要）IFA 皮下50 收集血清测效价＿＿52 融合前冲击免疫＿腹腔55 收获脾细胞和融合＿＿注：如果第四面免疫血清效价仍然达不到要求可以继续加强免疫，如果免疫超过6次仍然达不到要求免疫基本失败。
单克隆抗体技术路线
单克隆抗体技术路线引言：单克隆抗体技术是一种重要的生物医学研究方法，也是生物制药领域的重要工具。
本文将介绍单克隆抗体技术的基本原理、制备步骤以及应用领域，以帮助读者更好地了解和应用这一技术。
一、单克隆抗体技术的基本原理单克隆抗体技术是一种通过克隆单个抗体细胞，制备具有相同抗原结合特异性的抗体的方法。
其主要原理是将抗原注射到实验动物体内，激发机体产生免疫应答，然后采集动物体内的B细胞，融合B 细胞与骨髓瘤细胞，形成杂交瘤细胞，最后通过筛选获得特异性抗原结合能力的单克隆抗体。
二、单克隆抗体制备步骤1. 免疫原选择：选择合适的免疫原，通常为纯化的蛋白质或多肽。
2. 免疫程序：将免疫原注射到实验动物体内，激发免疫应答。
3. B细胞采集：从免疫动物体内采集脾细胞或淋巴结细胞，富集含有目标抗体的B细胞。
4. 杂交瘤细胞制备：将采集到的B细胞与骨髓瘤细胞融合，形成杂交瘤细胞。
5. 杂交瘤细胞筛选：通过限制性稀释法或酶标记法等方法，筛选出分泌特异性抗原结合能力的杂交瘤细胞。
6. 单克隆抗体生产：将筛选出的杂交瘤细胞进行扩增培养，收集培养上清液，纯化得到单克隆抗体。
三、单克隆抗体技术的应用领域1. 生物学研究：单克隆抗体可用于特定分子或细胞的定位和鉴定，帮助研究者了解生物体内的生物过程和机制。
2. 临床诊断：单克隆抗体可用于检测和诊断疾病，如癌症、感染性疾病和自身免疫性疾病等。
3. 治疗应用：单克隆抗体可用于治疗某些疾病，如肿瘤、免疫性疾病和传染病等，具有较高的治疗效果和较低的副作用。
4. 生物制药：单克隆抗体作为生物制药领域的重要工具，可用于药物研发、质量控制和生产等方面。
结论：单克隆抗体技术是一种重要的生物医学研究方法和生物制药工具，其制备步骤简单明了，应用领域广泛。
随着技术的不断发展和完善，单克隆抗体技术在生物医学领域将发挥越来越重要的作用，为疾病的诊断和治疗提供更多的选择和可能。
相信随着对单克隆抗体技术的深入研究和应用，必将为人类健康事业作出更大贡献。
单克隆抗体制备流程
单克隆抗体制备流程首先，在单克隆抗体制备之前，需要选择一个适当的抗原。
抗原可以是蛋白质、多肽、糖类或其他小分子。
选取抗原时，需要考虑抗原的表达水平、抗原的免疫原性以及抗原的稳定性等因素。
接下来，选择一个合适的实验动物进行免疫。
常用的实验动物有兔子和小鼠。
在免疫之前，需要先给实验动物注射适量的佐剂，以增强免疫效果。
通常，实验动物会被多次免疫，每次免疫之间有一段时间的间隔。
在实验动物免疫一段时间后，可以进行细胞融合以产生混杂瘤细胞。
混杂瘤细胞通常是由B细胞和骨髓瘤细胞融合而成，对于小鼠骨髓瘤细胞，常用的有SP2/0和NS0细胞系。
融合的方法主要有两种：一种是将免疫细胞和骨髓瘤细胞混合，然后使用聚乙二醇（PEG）进行融合；另一种是使用电击脉冲进行细胞融合。
融合细胞会经过适当的培养条件进行筛选和扩增。
在融合细胞扩增过程中，会进行筛选以保证融合细胞是产生单克隆抗体的。
最常用的筛选方法是酶联免疫吸附测定（ELISA）。
抗原会被固定在微孔板上，然后将培养液中的细胞涂覆在孔中。
如果其中一孔中有抗体分泌，则抗原会被结合，并且可以通过添加辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗和基质来检测抗体的存在。
经过筛选和鉴定后，选择一个或多个产生单克隆抗体的细胞进行单克隆扩增。
单克隆扩增时，可以通过细胞有限稀释法以及酵母酶聚合酶链式反应（YAC-PCR）等方法进行。
最后，可以通过收集上述单克隆细胞的上清液或细胞提取物来得到单克隆抗体。
上清液或细胞提取物中的抗体可以通过纯化方法，如蛋白A/G 亲和层析或蛋白L亲和层析等，得到纯化的单克隆抗体。
综上所述，单克隆抗体的制备流程包括抗原选择、免疫动物、细胞融合、筛选和克隆等步骤。
通过这些步骤，可以获得单克隆抗体用于科学研究和临床应用。
制备单克隆抗体的原理
制备单克隆抗体的原理
单克隆抗体制备的原理是使用相同的抗原去刺激小鼠免疫系统产生抗体，然后利用细胞融合技术融合小鼠脾细胞和肿瘤细胞，形成的杂交瘤细胞能够长期稳定地分泌单一种抗体。
制备单克隆抗体的步骤包括：免疫小鼠、采集脾细胞、合并脾细胞和肿瘤细胞、筛选杂交瘤细胞、克隆化杂交瘤细胞、培养单克隆细胞、收集单克隆抗体。
首先，将目标抗原注射到小鼠体内，刺激其免疫系统产生抗体。
随后，采集小鼠脾脏，分离脾细胞。
接下来，将脾细胞与骨髓瘤细胞（如myeloma）进行细胞融合，形成杂交瘤细胞。
这个步骤可以通过短暂的高温、聚乙二醇或其他化学物质来促进细胞融合。
随后，将杂交瘤细胞进行筛选。
通常通过培养基中加入选择性抗生素来杀死未融合的脾细胞和骨髓瘤细胞，只留下融合细胞的杂交瘤细胞。
这些细胞称为杂交瘤克隆细胞。
然后，将杂交瘤克隆细胞进行克隆化。
将单个克隆细胞分离，分别培养成单个细胞克隆，并扩展培养。
接下来，用ELISA等技术对克隆细胞的细胞上清进行筛选，
以检验其对目标抗原的特异性。
只有对目标抗原产生特异性抗体的克隆细胞才能被选择出来。
最后，收集特异性单克隆抗体。
将特异性的克隆细胞进行扩增
培养，并收集细胞上清中的单克隆抗体。
通过上述步骤，可以制备出具有高特异性、高亲和力的单克隆抗体，用于特定抗原的检测、定量、纯化等实验和应用中。
单克隆抗体的制备与应用
单克隆抗体的制备与应用单克隆抗体是一种高度特异性的生物分子，能够识别并结合特定的抗原，对于现代生命科学研究和临床医学诊治具有重要意义。
一、单克隆抗体的制备单克隆抗体的制备主要包括以下几个步骤：（1）选择合适的免疫原：免疫原应具有较好的生物学活性、易于纯化，并且可以诱导动物产生足够的免疫反应。
常用的免疫原包括蛋白质、多肽、糖类、DNA等。
（2）免疫动物：将免疫原注射到小鼠、大鼠、兔子等动物身上，诱导其产生免疫反应。
此过程需要严格控制免疫剂量及免疫间隔时间，以保证动物身体内产生充分的免疫反应。
（3）筛选克隆：从免疫动物获得脾细胞，与骨髓瘤细胞进行融合，生成杂交瘤细胞。
将杂交瘤细胞进行分离、克隆和筛选，最终获得单克隆细胞系。
（4）制备单克隆抗体：将单克隆细胞系进行扩增，并通过细胞培养和大规模发酵获得充足的单克隆抗体产物。
二、单克隆抗体的应用（1）免疫诊断：通过单克隆抗体对特定分子的识别和结合能力，可以用于免疫诊断。
例如，通过检测患者体液中特定抗原的单克隆抗体结合情况，可以诊断疾病，并对病情进行判断。
（2）药物研发：单克隆抗体在药物研发中具有广泛的应用前景。
例如，在抗肿瘤药物的开发中，单克隆抗体可以针对肿瘤细胞特异性抗原，实现有选择性地杀伤肿瘤细胞。
（3）免疫治疗：单克隆抗体可以作为一种抗体治疗手段，对病原体或某些癌细胞进行特异性杀伤。
例如，在肿瘤治疗中，单克隆抗体能够选择性地结合癌细胞表面的受体，阻断其信号传递，从而抑制肿瘤细胞的生长和扩散。
（4）生物学研究：单克隆抗体可以用于生物学研究中的诸多方面。
例如，通过单克隆抗体对特定蛋白的结构和功能进行研究，可以深入了解其生物学特性和作用机制。
三、单克隆抗体的前景与挑战单克隆抗体拥有广泛的应用前景，近年来，其在医学、生命科学研究领域得到了广泛的应用。
然而，单克隆抗体的研发仍面临着一些挑战。
（1）制备难度：单克隆抗体的制备要求高度的技术和设备支持，需要在动物免疫、细胞融合、细胞培养等环节中严格把控。
简述单克隆抗体制备原理。
简述单克隆抗体制备原理。
单克隆抗体是一种通过人工合成而获得的高度特异性的抗体,通常用于检测、诊断和治疗各种疾病。
单克隆抗体的制备原理主要涉及以下几个步骤:
1. 细胞培养:选择适当的细胞系,如B细胞或T细胞等,将其培养在适宜条件下。
2. 分子标记:使用一定的技术和分子标记技术,如荧光标记、放射性标记等,将目标分子或目标分子的基因编码序列引入细胞中。
3. 基因重组:利用基因工程技术,如基因重组载体、基因编辑工具等,将目标分子的基因与相应的单克隆抗体基因进行重组。
4. 表达和处理:将重组后的单克隆抗体基因导入细胞中,使其表达目标分子。
随后,对表达后的单克隆抗体进行筛选和纯化。
5. 扩增和制备:利用适当的扩增技术和设备,如PCR、冻存技术等,将筛选得到的单克隆抗体进行扩增,并制备成所需的浓度和规模。
单克隆抗体制备的原理是基于人工合成抗体的概念,通过分子标记和基因工程技术,将目标分子的基因与单克隆抗体基因进行重组,
使其在细胞中表达并产生高特异性的抗体。
随后,通过筛选、纯化和扩增等技术,获得所需的单克隆抗体。
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单克隆抗体的制备流程
（一）动物的选择与免疫
1．动物的选择纯种BALB/C小鼠，较温顺，离窝的活动范围小，体弱，食量及排污较小，一般环境洁净的实验室均能饲养成活。
目前开展杂交瘤技术的实验室多选用纯种BALA/C小鼠。
2．免疫方案选择合适的免疫方案对于细胞融合杂交的成功，获得高质量的McAb 至关重要。
一般在融合前两个月左右根据确立免疫方案开始初次免疫，免疫方案应根据抗原的特性不同而定。
（1）可溶性抗原免疫原性较弱，一般要加佐剂，半抗原应先制备免疫原，再加佐
剂。
常用佐剂：福氏完全佐剂、福氏不完全佐剂。
初次免疫抗原1～50μg加福氏完全佐剂皮下多点注射或脾内注射（一般0.8～1ml,0.2ml/点）
↓3周后
第二次免疫剂量同上，加福氏不完全佐剂皮下或ip（腹腔内注射）（ip剂量不宜超过0.5ml）
↓3周后
第三次免疫剂量同一，不加佐剂，ip（5～7天后采血测其效价）
↓2～3周
加强免疫，剂量50～500μg为宜，ip或iv（静脉内注射）
↓3天后
取脾融合
目前，用于可溶性抗原（特别是一些弱抗原）的免疫方案也不断有所更新，如：①将可溶性抗原颗粒化或固相化，一方面增强了抗原的免疫原性，另一方面可降低抗原的使用量。
②改变抗原注入的途径，基础免疫可直接采用脾内注射。
③使用细胞因子作为佐剂，提高机体的免疫应答水平，增强免疫细胞对抗原的反应性。
（2）颗粒抗原免疫性强，不加佐剂就可获得很好的免疫效果。
以细胞性抗原为例，免疫时要求抗原量为1～2×107个细胞。
初次免疫1×107/0.5ml ip
↓2～3周后
第二次免疫1×107/0.5ml ip
↓3周后
加强免疫（融合前三天）1×107/0.5ml ip或iv
↓
取脾融合
（二）细胞融合
1．细胞融合前准备
（1）骨髓瘤细胞系的选择：
骨髓瘤细胞应和免疫动物属于同一品系，这样杂交融合率高，也便于接种杂交瘤在同一品系小鼠腹腔内产生大量McAb。
（2）饲养细胞：在组织培养中，单个或少数分散的细胞不易生长繁殖，若加入其它活细胞，则可促进这些细胞生长繁殖，所加入的这种细胞数被称为饲养细胞。
在制备McAb 的过程中，许多环节需要加饲养细胞，如在杂交瘤细胞筛选、克隆化和扩大培养过程中，加入饲养细胞是十分必要的。
常用的饲养细胞有：小鼠腹腔巨噬细胞（较为常用）、小鼠脾脏细胞或胸腺细胞。
也有人用小鼠成纤维细胞系3T3经放射线照射后作为饲养细胞。
饲养细胞的量为一般为2×104或105细胞/孔。
2．细胞融合的步骤
（1）制备饲养细胞层：一般选用小鼠腹腔巨噬细胞。
与免疫小鼠相同品系的小鼠，常用BALB/C小鼠，6～10周
↓
拉颈处死，浸泡在75%酒精内，3～5min
↓
用无菌剪刀剪开皮肤，暴露腹膜
↓
用无菌注射器注入5～6ml预冷的培养液（严禁刺破肠管）
↓
反复冲洗，吸出冲洗液
↓
冲洗液放入10ml离心管，1200rpm/分离5～6min
↓
用20%小牛血清（NCS）或胎牛血清（FCS）的培养液混悬，调整细胞数至1×105/ml ↓
加入96孔板，100μl/孔
↓
放入37℃CO2孵箱培养
（2）制备免疫脾细胞
最后一次加强免疫3天后小鼠拉颈处死
↓
无菌取脾脏，培养液洗一次
↓
脾脏研碎，过细胞筛
↓
离心，细胞用培养液洗2次
↓
计数
↓
取108脾淋巴细胞悬液备用
（3）制备骨髓瘤细胞
取对数生长骨髓瘤细胞离心
↓
用无血清培养液洗2次
↓
计数，取得×107细胞备用
（4）融合
①将骨髓瘤细胞与脾细胞按1：10或1：5的比例混合在一起，在50ml离心管中用无血清不完全培养液洗1次，离心，1200rpm,8min;弃上清，用吸管吸净残留液体，以免影响聚乙二醇（PEG）浓度。
轻轻弹击离心管底，使细胞沉淀略松动。
②90s内加入37℃预温的1ml 45%PEG（分子量4000）溶液，边加边轻微摇动。
37℃水浴作用90s。
③加37℃预温的不完全培养液以终止PEG作用，每隔2min分别加入1ml、2ml、3ml、4ml、5ml和6ml。
④离心，800rpm, 6min。
⑤充上清，用含20%小牛血清HAT选择培养液重悬。
⑥将上述细胞，加到已有饲养细胞层的96孔板内，每孔加100μl。
一般一个免疫脾脏可接种4块96孔板。
⑦将培养板置37℃、5%CO2培养箱中培养。
（三）选择杂交瘤细胞及抗体检测
1．HAT选择杂交瘤细胞脾细胞和骨髓瘤细胞经PEG处理后，形成多种细胞的混合体，只有脾细胞与骨髓细胞形成的杂交瘤细胞才有意义。
在HAT选择培养液中培养时，由于骨髓瘤细胞缺乏胸苷激酶或次黄嘌呤鸟嘌呤核糖转移酶，故不能生长繁殖，而杂交瘤细胞具有上述两种酶，在HAT选择培养液可以生长繁殖。
在用HAT选择培养1～2天内，将有大量瘤细胞死亡，3～4天后瘤细胞消失，杂交细胞形成小集落，HAT选择培养液维持7～10天后应换用HT培养液，再维持2周，改用一般培养液。
在上述选择培养期间，杂交瘤细胞布满孔底1/10面积时，即可开始检测特异性
抗体，筛选出所需要的杂交瘤细胞系。
在选择培养期间，一般每2～3天换一半培养液。
2．抗体的检测检测抗体的方法应根据抗原的性质、抗体的类型不同，选择不同的筛选方法，一般以快速、简便、特异、敏感的方法为原则。
常用的方法有：（1）放射免疫测定（RIA）可用于可溶性抗原、细胞McAb的检测。
（2）酶联免疫吸附试验（ELISA）可用于可溶性抗原、细胞和病毒等McAb的检测。
（3）免疫荧光试验适合于细胞表面抗原的McAb的检测。
（4）其它如间接血凝试验、细胞毒性试验、旋转粘附双层吸附试验等。
（四）杂交瘤的克隆化
杂交瘤克隆化一般是指将抗体阳性孔进行克隆化。
因为经过HAT筛选后的杂交瘤克隆不能保证一个孔内只有一个克隆。
在实际工作中，可能会有数个甚至更多的克隆，可能包括抗体分泌细胞、抗体非分泌细胞、所需要的抗体（特异性抗体）分泌细胞和其它无关抗体的分泌细胞。
要想将这些细胞彼此分开就需要克隆化。
克隆化的原则是，对于检测抗体阳性的杂交克隆尽早进行克隆化，否则抗体分泌的细胞会被抗体非分泌的细胞所抑制，因为抗体非分泌细胞的生长速度比抗体分泌的细胞生长速度快，二者竞争的结果会使抗体分泌的细胞丢失。
即使克隆化过的杂交瘤细胞也需要定期的再克隆，以防止杂交瘤细胞的突变或染色体丢失，从而丧失产生抗体的能力。
克隆化的方法很多，最常用的是有限稀释法
1．有限稀释法克隆
（1）克隆前1天制备饲养细胞层（同细胞融合）。
（2）将要克隆的杂交瘤细胞从培养孔内轻轻吹干，计数。
（3）调整细胞为3～10个细胞/ml。
（4）取头天准备的饲养细胞层的细胞培养板，每孔加入稀释细胞100μl。
孵育于37℃、5%CO2孵箱中。
（5）在第7天换液，以后每2～3天换液1次。
（6）8～9天可见细胞克隆形成，及时检测抗体活性。
（7）将阳性孔的细胞移至24孔板中扩大培养。
（8）每个克隆应尽快冻存。
（五）杂交瘤细胞的冻存与复苏
1．杂交瘤细胞的冻存
细胞冻存液：50%小牛血清；40%不完全培养液；10%DMSO（二甲基亚砜）。
冻存液最好预冷，操作动作轻柔、迅速。
冻存时从室温可立即降至0℃后放入-70℃超低温冰箱，次日转入液氮中。
2．细胞复苏方法
将玻璃安瓿自液氮中小心取出，放37℃水浴中，在1min内使冻存的细胞解冻，将细胞用完全培养液洗涤两次，然后移入头天已制备好的饲养层细胞的培养瓶内，置37℃、5%CO2孵箱中培养，当细胞形成集落时，检测抗体活性。
（六）单克隆抗体的大量生产
大量生产单克隆抗体的方法主要有两种：
（1）体外使用旋转培养管大量培养杂交瘤细胞，从一清液中获取单克隆抗体。
但此方法产量低，一般培养液内抗体含量为10～60μg/ml,如果大量生产，费用较高。
（2）体内接种杂交瘤细胞，制备腹水或血清。
①实体瘤法：对数生长期的杂交瘤细胞按1～3×107/ml接种于小鼠背部皮下，每处注射
0.2ml,共2～4点。
待肿瘤达到一定大小后（一般10～20天）则可采血，从血清中获得单克隆抗体的含量可达到1～10mg/ml。
但采血量有限。
②腹水的制备：常规是先腹腔注射0.5ml Pristane (降植烷)或液体石蜡于BALB/C鼠，1～2周后腹腔注射1×106个杂交瘤细胞，接种细胞7～10天后可产生腹水。
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