单克隆抗体制备技术
单克隆抗体制备方法(全)
单克隆抗体制备方法1975年Kohler和Milstein发现将小鼠骨髓瘤细胞与和绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞进行融合，形成的杂交瘤细胞既可产生抗体，又可无性繁殖，从而创立了单克隆抗体杂交瘤技术。
这一技术上的突破使血清学的研究进入了一个高度精确的新纪元。
采用杂交瘤技术制备单克隆抗体包括动物免疫、细胞融合、选择杂交瘤、检测抗体、杂交瘤细胞的克隆化、冻存以及单克隆抗体的大量生产，要经过几个月的一系列实验步骤。
主要仪器设备：超净工作台、CO2恒温培养箱、超低温冰箱（-70℃）、倒置显微镜、精密天平或电子天平、液氮罐、离心机（水平转子，4000r/min）、37℃水浴箱、纯水装置、滤器、真空泵等。
其需要的主要器械包括：100ml、50ml、25ml细胞培养瓶，10ml、1ml刻度吸管，试管，滴管（弯头、直头），平皿，烧杯，500ml、250ml、100ml盐水瓶，青霉素小瓶，10ml、5ml、1ml注射器等，96孔、24孔细胞培养板，融合管（50ml圆底带盖玻璃或塑料离心管），眼科剪刀，眼科镊，血细胞计数板，可调微量加样器（~50ul，~200ul，~1000ul），弯头针头，200目筛网，小鼠固定装置等。
此外，一般的单克隆抗体制备方法大同小异。
方法动物的选择与免疫1. 动物的选择BALB/C小鼠，较温顺，离窝的活动范围小，体弱，食量及排污较小，一般环境洁净的实验室均能饲养成活。
目前开展杂交瘤技术的实验室多选用纯种BALA/C小鼠。
2. 免疫方案选择合适的免疫方案对于细胞融合杂交的成功，获得高质量的McAb至关重要。
一般在融合前两个月左右根据确立免疫方案开始初次免疫，免疫方案应根据抗原的特性不同而定。
（1）可溶性抗原免疫原性较弱，一般要加佐剂，半抗原应先制备免疫原，再加佐剂。
常用佐剂：福氏完全佐剂、福氏不完全佐剂。
初次免疫抗原1～50μg加福氏完全佐剂皮下多点注射或脾内注射（一般0.8～1ml,0.2ml/点）↓3周后第二次免疫剂量同上，加福氏不完全佐剂皮下或ip（腹腔内注射）（ip剂量不宜超过0.5ml）↓3周后第三次免疫剂量同一，不加佐剂，ip（5～7天后采血测其效价）↓2～3周加强免疫，剂量50～500μg为宜，ip或iv（静脉内注射）↓3天后取脾融合目前，用于可溶性抗原（特别是一些弱抗原）的免疫方案也不断有所更新，如：①将可溶性抗原颗粒化或固相化，一方面增强了抗原的免疫原性，另一方面可降低抗原的使用量。
单克隆抗体的主要制备步骤
单克隆抗体的主要制备步骤
1. 购买解抗原，根据所需克隆抗体设计免疫原；
2. 免疫动物（如家兔），使免疫动物产生抗体抗原反应；
3. 收集动物血清，并从血清中抽取单克隆抗体；
4. 把抽取到的单克隆抗体配制成适合应用的格式（液体、粉末、悬浮液等）；
5. 对单克隆抗体进行纯化并测定其纯度；
6. 用ELISA等多种方法进行交叉反应性测定；
7. 进行稳定性、非特异性结合和抗原竞争的测定；
8. 制备单克隆抗体的回收量检测及吸附实验；
9. 最后进行细胞实验，确保单克隆抗体与细胞结合稳定和特异。
单克隆抗体的制作流程
单克隆抗体的制作流程一、前期准备工作1. 确定目标抗体：根据研究需求确定需要制备的单克隆抗体。
2. 筛选免疫原：选择适合的免疫原，如蛋白质、多肽、细胞等。
3. 动物选择：选择适合的动物，如小鼠、大鼠、兔子等。
4. 免疫计划设计：设计出合理的免疫计划，包括免疫剂量、次数、间隔时间等。
二、免疫过程1. 免疫原制备：将所选的免疫原纯化或合成后进行检测和确认。
2. 免疫动物注射：将免疫原与佐剂混合后注射到动物体内，按预定计划进行多次注射。
3. 血清采集：在最后一次注射后采集动物血清，检测抗体滴度是否达到预期水平。
三、杂交细胞制备1. 细胞系选择：选择适合的细胞系如SP2/0或NS0等。
2. 细胞培养：将细胞系培养至稳定生长状态，并进行筛选和确认。
3. 细胞融合：将免疫小鼠脾细胞与SP2/0或NS0细胞进行融合，得到杂交瘤细胞。
4. 杂交瘤筛选：利用HAT培养基对杂交瘤进行筛选，筛选出产生单克隆抗体的杂交瘤。
四、单克隆抗体制备1. 单克隆细胞培养：将单个杂交瘤细胞进行单克隆分离和培养。
2. 单抗酶标法检测：利用ELISA等技术检测单克隆抗体的特异性和亲和力。
3. 大规模培养：将筛选出的单克隆细胞进行大规模培养，得到足够多的单克隆抗体。
4. 纯化和鉴定：通过亲和层析、离子交换层析等技术对单克隆抗体进行纯化，并进行质量鉴定。
五、应用1. 体外实验应用：如ELISA、Western blotting等技术中作为检测试剂使用。
2. 体内实验应用：如流式细胞术、组织切片染色等技术中作为荧光标记或特异性结合试剂使用。
3. 临床应用：如治疗肿瘤、自身免疫性疾病等方面的治疗药物。
六、总结单克隆抗体的制备流程包括前期准备工作、免疫过程、杂交细胞制备、单克隆抗体制备和应用等环节。
其中，前期准备工作和免疫过程是制备成功的关键，而单克隆抗体制备需要经过多次筛选和鉴定才能得到高质量的单克隆抗体。
单克隆抗体在医学和生命科学领域有着广泛的应用前景，对于推动科学发展具有重要意义。
单克隆抗体的制备流程
单克隆抗体的制备流程1.免疫原的制备和动物的免疫：在开始制备单克隆抗体之前，首先需要制备免疫原。
免疫原可以是蛋白质、多肽、多糖、细胞表面抗原等。
制备免疫原的常用方法包括化学合成、原核表达系统、真核表达系统等。
制备好免疫原后，将其与适当的佐剂混合，然后通过注射等方式将免疫原引入到实验动物体内。
通常使用小鼠、大鼠或兔子作为免疫动物。
2.脾细胞的获取和混合瘤细胞的建立：在免疫过程中，免疫原会刺激机体产生大量的抗体。
当机体免疫反应达到一定水平时，需要从免疫动物体内获取脾脏，获得含有抗体产生细胞的脾细胞悬液。
将脾细胞与能激活脾细胞的细胞（如骨髓瘤细胞）进行融合，形成混合瘤细胞。
3.杂交瘤细胞的筛选和鉴定：将混合瘤细胞进行稀释，分装到96孔板中，使每个孔中只包含一个细胞。
这样每个孔中的细胞都是一个潜在的单克隆细胞。
随后，每个孔中的细胞在培养基中进行培养，以使细胞形成单个克隆。
根据杂交瘤细胞产生的特定抗体，可以使用ELISA等方法进行筛选和鉴定，以确定具有所需抗体的杂交瘤细胞。
4.单克隆抗体的生产和纯化：将筛选出来的单克隆杂交瘤细胞进行扩大培养，并定期收集培养上清液以获取单克隆抗体。
为了提高单克隆抗体的纯度和浓度，通常需要对培养上清液进行多次纯化。
典型的纯化方法包括亲和层析、离子交换层析、凝胶过滤层析等。
综上所述，单克隆抗体的制备流程包括免疫原的制备和动物的免疫、脾细胞的获取和混合瘤细胞的建立、杂交瘤细胞的筛选和鉴定，以及单克隆抗体的生产和纯化等几个主要步骤。
每个步骤都需要精确操作和耐心等待，但最终可以获得高纯度和高特异性的单克隆抗体，这在生物医学研究和临床诊断中具有重要的应用价值。
简述单克隆抗体的制备过程
简述单克隆抗体的制备过程单克隆抗体的制备过程主要分为以下几个步骤：
1. 免疫原制备：首先需要准备免疫原，即待检测的抗原物质。
免疫原可以是蛋白质、多肽、糖类等各种生物分子。
在免疫原制备的过程中，需要注意选择合适的纯度、稳定性、活性等因素，并对其进行适量的处理和加工，以确保其具有较好的免疫原性能。
2. 动物免疫：将免疫原注入到动物体内（如小鼠、兔子等），让其自身免疫系统产生抗体。
免疫的方式可以是皮下、腹腔或肌肉注射等，不同的免疫方式会对抗体的种类和数量产生影响。
此外，需要注意控制免疫过程中的免疫原剂量和免疫频率，以免对动物造成损伤。
3.细胞融合：在免疫后，从免疫动物的脾脏等免疫器官中抽取免疫细胞（主要是B细胞）和肿瘤细胞进行细胞融合（如用聚乙二醇等），以形成杂交瘤细胞。
由于肿瘤细胞具有无限增殖能力，可以保证后续获得足够的单克隆抗体。
4.筛选单克隆：在进行细胞融合之后，需要进行筛选并获得单克隆抗体。
筛选包括对细胞培养物中的单克隆进行筛选和鉴定，主要有免疫荧光筛选、酶联免疫吸附测定、流式细胞术等方法。
在筛选过程中，需要对单克隆进行鉴定，包括对其亲和力、特异性、精确度等性质进行测定。
5.大规模生产：最后，需要进行大规模单克隆抗体的生产。
通常
采用的是培养杂交瘤细胞，以获得足够的单克隆抗体。
在培养过程中，需要注意细胞培养条件和产物提取方法，以保证单克隆抗体的质量和
效能。
总之，单克隆抗体的制备过程相当复杂且耗费时间，需要经过多
个环节的把控。
最终获得的单克隆抗体具有高度特异性和亲和力，可
以被广泛应用于生命科学、医药等领域。
3.细胞融合及单克隆抗体的制备
(3) 细胞融合： 50%PEG(400~1000), pH8.0, 37oC, 2min
3.融合细胞的筛选
融合后细胞混合液
HAT培养基
2 weeks later
HT培养基
1 week later
正常培养基
4.抗体的检测
常用方法：
要求： ➢ 简便、快速、敏感; ➢ 在短时间内能检测大量样品
+3.6ml M
150ul/孔
E、F、 G、H
调细胞浓度为1-5х103cell/ml 取100个cell于7.2ml完全培养液 (M)中
2个cell/孔
1个cell/孔
0.5个cell/孔
6.杂交瘤细胞的鉴定
染 色 体 核 型 分 析
大规模培养——批量生产单克隆抗体
常用的大规模培养方法：
动物接种法 转瓶培养法
溶液能产生最多杂交细胞。 PEG溶液在pH6.0时细胞融合率最高。
PEG诱导融合的特点：其优点是融合成本低，勿 需特殊设备；融合子产生的异核率较高；融合过 程不受物种限制。其缺点是融合过程繁琐，PEG 可能对细胞有毒害。
PEG的作用机理： Kao等认为，由于PEG分子具有 轻微的负极性，故可以与具有正极性基团的水、蛋 白质和碳水化合物等形成H键，从而在在质膜之间 形成分子桥，其结果是使细胞质膜发生粘连进而促 使质膜的融合；另外，PEG能增加类脂膜的流动 性，也使细胞的核、细胞器发生融合成为可能。
电融合的基本过程：
细胞膜的接触：当原生质体置于电导率很低的溶液
中时，电场通电后，电流即通过原生质体而不是通过 溶液，其结果是原生质体在电场作用下极化而产生偶 极子，从而使原生质体紧密接触排列成串；
单克隆抗体制备
1. 免疫动物：三只Balb/c小鼠2. 佐剂：首先用完全弗氏佐剂（CFA），后用不完全弗氏佐剂（IFA）。
3. 免疫原：蛋白或KLH偶联多肽。
每次免疫使用50-100µg免疫原。
4. 免疫：用PBS稀释免疫原，然后与相应的佐剂1：1混合。
抗原和佐剂完全混合形成稳定的乳剂，将该乳剂在小鼠双肩周围的皮肤下进行皮下注射和后腿进行肌肉注射。
每个区域大约用1/8的免疫原。
接着将1/2的免疫原进行腹腔注射，这样免疫原可以持久存在从而提高免疫应答。
以后每个星期进行腹腔注射直到达到要求的效价。
5. 第0星期预采血完全弗氏佐剂（CFA）混合的100µg抗原免疫小鼠。
第2星期完全弗氏佐剂（CFA）混合的50µg抗原免疫小鼠。
第3星期不完全弗氏佐剂（IFA）混合的50µg抗原免疫小鼠。
第4星期溶解在PBS中的50µg抗原免疫小鼠。
第5星期取适当的细胞或组织进行ELISA和WB检测，溶解在PBS中的50µg抗原免疫小鼠。
第X星期取适当的细胞或组织进行ELISA和WB检测，溶解在PBS中的50µg抗原免疫小鼠。
6. 杂交瘤融合和筛选：用PEG方法将效价最好的小鼠脾细胞和骨髓瘤细胞F0进行融合。
用抗原对融合的杂交瘤克隆进行筛选，检测它们的特异性和敏感性。
ELISA阳性的克隆可用WB检测，筛选出来的克隆至少还需要亚克隆两次。
7. 大规模抗体生产：筛选得到两个克隆最后进行大规模培养（每个克隆1L）或者取腹水（每个克隆5只小鼠）。
用蛋白A/G对培养液或腹水进行纯化，平均每个克隆可以得到3-5mg 抗体。
8. 注意：每个融合平均可以得到900多个克隆，对于多肽抗原可以得到100个左右的ELISA阳性克隆，重组蛋白抗原可以得到100-150个ELISA阳性克隆。
亚克隆实验做的越早，越容易保存克隆。
因此，为了保存和复苏阳性克隆，尽早进行筛选检测是必需的。
单克隆抗体的主要步骤
单克隆抗体的主要步骤
单克隆抗体的制备主要分为以下几个步骤：
首先，选定合适的抗原并进行免疫，采集含有抗原特异性淋巴细胞的动物脾脏。
运用免疫规划原则，通过周期性注射抗原刺激动物的免疫系统生成大量特异性B
淋巴细胞。
其次，通过粘膜炎症急性期反应融合技术，将抗原特异性B淋巴细胞和肿瘤细胞进行融合，得到的细胞即为混源杂交瘤细胞。
然后，对获得的杂交瘤细胞进行筛选，挑选出能稳定分泌目标抗体的杂交瘤克隆。
利用ELISA、FACS等方法，能对杂交瘤筛选进行优化。
接着，研究人员会对所选克隆进行鉴定，了解其分泌的抗体与抗原的亲和力。
结合测序和质粒制备，进一步明确杂交瘤克隆的免疫学特征。
随后，利用无菌操作技术进行体外扩增和冻存，保证抗体质量的稳定。
最后，通过体内成瘤或者体外不系细胞培养的方式进行大量抗体生产，然后提取，纯化单克隆抗体。
密集摇瓶和生物反应器培养技术是临床试验阶段常用的抗体生产策略。
单克隆抗体的研究和生产是一个复杂且需要精细操作的过程，旨在通过这些步骤高效、可靠地生产出具有特异性的单克隆抗体。
对于抗体药物研发、生物技术、诊断试剂等领域，具有不可替代的重要价值。
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换液：融合之后5d换液，吸出150μL，加入200 μL HT营 养液。
融合过程中注意事项
SP2/0细胞与免疫脾细胞数比例适当。 两种细胞要处于较好的状态，吹吸细胞时要 轻柔。 PEG融合之后，加营养液中和时要缓慢，以 免将破坏融合细胞。
阳性杂交瘤的筛选
杂交瘤细胞长到孔底1/5-1/10时可以进行检测，一般情况 下10d即可；还可以当营养液发黄时检测。 取样：无菌取杂交瘤培养上清，然后在原孔中加入HT培 养液。 应用已经建立起的检测方法筛选阳性孔，以制备PCV2Cap单抗为例： 用重组PCV2-Cap蛋白和野生型杆状病毒包被ELISA板 进行平行检测，每孔加入50μL杂交瘤细胞培养上清液 （如果同时检测项目繁多，可以统一稀释2-5倍进行检 测）。重组PCV2-Cap蛋白检测为阳性而野生型杆状病毒 为阴性的的杂交瘤细胞转入24孔板进行扩大培养（HT培 养液）， 长至80%单层时再检测一次，如果仍然为阳性 则立即进行进行亚克隆。
杂交瘤细胞的亚克隆的方法
24孔中细胞生长状态良好的杂交瘤细胞可以进行亚 克隆，将细胞用营养液吹起，适当稀释后进行细胞 计数，取100个细胞加入到20mL含20% FBS营养液 中，混匀后加到96孔板中，200μL/孔。也可以亚克 隆前一天制备饲养层细胞，再进行亚克隆。当细胞 长至孔底1/5-1/10时（大约10天）进行检测，将具 有单个克隆的阳性细胞孔继续进行第二次亚克隆， 当亚克隆之后检测到每个杂交瘤细胞孔都为阳性为 止，一般要经过3次亚克隆。
前3 d加强免疫，腹腔注射0.5 mL含50-100 µ g纯化的蛋白。 3-5
天后用于融合。
免疫程序
免疫时是否采用佐剂和事先处理抗原，要依抗原性的
强弱而定。一般来讲可溶性抗原用完全佐剂效果较好。抗
原量同样与抗原强弱有关，以IgG为例，第一次为100g，
第二次为50g，免疫途径第一次可经腹腔注射。对于细胞
单克隆抗体的制备
培养上清法 将阳性杂交瘤扩大培养，直到细胞全部死 亡，收集培养液冻存备用，该法单抗含量少。 腹水的制备 常规是先腹腔注射0.5mL Pristane (降植烷) 或液体石腊于BaLb／c鼠，1周后腹腔注射1×106个杂交 瘤细胞，接种细胞7～10天后可产生腹水，密切观察动 物的健康状况与腹水征象，待腹水尽可能多，而小鼠频 于死亡之前，处死小鼠，用滴管将腹水吸入试管中，一 般一只小鼠可获1～10mL腹水。也可用注射器抽取腹水， 可反复收集数次。腹水中单克隆抗体含量可达520mg/ml， 这是目前最常用的方法，还可将腹水中细 胞冻存起来，复苏后转种小鼠腹腔则产生腹水快、量多。
单克隆抗体的鉴定
抗体特异性的鉴定 McAb的Ig类与亚类的鉴定 Western-blot分析 McAb中和活性的鉴定 McAb识别抗原表位的鉴定 McAb亲和力的鉴定
抗体特异性的鉴定
除用免疫原(抗原)进行抗体的检测外， 还应用与其抗原成分相关的其它抗原 进行交叉试验，方法可用ELISA、 IFA、IPMA等法。
融
合
将骨髓瘤细胞与脾细胞按1：10-1：5的比例混合在一起，在15mL离 心管中用无血清1640洗1次，离心，1000rpm,5min;弃上清，用吸管吸 净残留液体，以免影响PEG浓度。轻轻弹击离心管底，使细胞沉淀 略松动。 60s内加入37℃预温的1mL 50%PEG溶液，边加边轻微摇动。37℃水 浴静置作用90s。 加37℃预温的1640培养液以终止PEG作用，首先，1 min加入1 mL， 然后在5 min内缓慢加入10mL，终止后置于37℃作用5min。 离心，800rpm, 5min。 弃上清，轻轻弹击离心管底，使细胞沉淀略松动，用40mL含HAT选 择培养液轻轻重悬。 将上述细胞，加到已有饲养细胞层的96孔板内，每孔加100μL。一般 一个免疫脾脏可接种4-6块96孔板。 将培养板置37℃、5%CO2培养箱中培养。
饲养层细胞的制备
融合前一天制备饲养细胞，一般选用8周龄Balb/C小鼠腹 腔巨噬细胞，步骤如下： 1. 将Balb/C小鼠摘除眼球采血（留做阴性对照），然后拉 颈处死，浸泡在75%酒精内，5min。 2. 用无菌剪刀剪开皮肤，用无菌镊子撕开皮肤，暴露腹膜。 3. 用5mL无菌注射器吸取5mL HAT选择培养液注入到小鼠 腹腔中（严禁刺破肠管），注射器不拔出，然后用无菌 镊子轻轻触动几次左右两侧腹膜，吸出营养液。 4. 重复1次上步操作，补足20mL HAT选择培养液，混匀后 加入2块96孔板，100μL/孔，放入37℃ CO2培养箱培养。 （此为经验操作，标准操作要进行细胞计数，浓度为 1×105/mL；如果做2块饲养细胞，吹两次即可，如果做3 块则加吹一次）
单克隆抗体制备技术
2008年11月6日
杂交瘤技术的基本原理
杂交瘤技术的基本原理
1：HAT选择培养基： 次黄嘌呤(hypoxanthine,H) 氨基蝶呤(aminopterin,A) 胸腺嘧啶核苷(thymidine,T). 2：细胞的DNA合成一般有两条途径： A：由糖和氨基酸合成核苷酸，进而合成DNA，叶酸作为 重要的辅酶参与反应。 B：在次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷存在下，经次黄嘌呤磷酸 核糖转化酶(HGPRT)或胸腺嘧啶核苷激酶(TK)的催化下合 成DNA。
细胞的冻存与复苏
单抗的制备是一个较长的过程，中途可能会发生污 染而前功尽弃，所以要及时进行细胞的冻存：各个 时期的阳性孔杂交瘤细胞都要冻存。 将生长状态良好的细胞吹起后，1000rpm离心 5min，弃上清，用冻存液将细胞重悬，之后冻存， 程序如下：4 ℃放置1h，-20 ℃放置4h，-80 ℃过 夜，然后置液氮中保存。 细胞的复苏：从液氮中取出细胞，迅速置于37 ℃ 水浴锅中迅速融化细胞，营养液稀释后1000rpm离 心5min，弃上清，用营养液将细胞重悬之后常规培 养。
McAb识别抗原表位的鉴定
采用间接ELISA法相加试验，计算相加指数（AI） 来分析单抗决定簇，具体做法如下： 在包被好抗原的ELISA板中分别加入各种单抗（均 为稀释5倍）各100μL，以及各单抗两两组合各50 μL，37℃孵育1 h，后序步骤与常规ELISA相同。根 据下列公式计算AI，A1，A2分别为各株单抗的A值， A1+2为两两组合的混合单抗的A值。AI 大于10%表 示两株单抗针对不同抗原表位，具有相加效应； AI小于10%则表示两株单抗针对抗原表位相同或相 近。 AI= （A1+2- A1）/ A2×100%
性抗原不用佐剂，每次腹腔注射1×l06-1×107。
检测方法的建立及免疫效果的评价
A：建立成熟的检测方法是关键，一般有以下 几种方法： ELISA IPMA 免疫荧光 B：免疫效果的评价 一般于三免疫后一周，通过尾静脉采血检测 抗体产生情况，一般以稀释1000倍仍为阳性 判为免疫成功。
杂交瘤细胞株的建立
McAb中和活性的鉴定
以抗PCV2单抗为例，用固定病毒稀释抗体的方法 进行病毒中和试验用于检测单抗的中和活性。将杂 交瘤细胞培养上清液和腹水按 1: 2系列稀释，分别 与含有 200 个TCID50 的 PCV2/LG 株等体积混合， 置37 ℃感作3 h；同设 PCV2 阳性血清、SP2/0 细胞 培养上清作为阳性和阴性对照。病毒接种细胞培养 至72 h，固定细胞，用 PCV2 阳性血清进行IPMA检 测各孔病毒抗原反应，将能够抑制50 %病毒增殖的 抗体最高稀释倍数定为抗体中和效价。
阳性杂交瘤的筛选过程中注意事项
检测杂交瘤细胞的时机很重要，早了抗体产 生量少，不易检出；晚了细胞死亡较多，不 利于后续培养及亚克隆。 从96孔板中取样品之后应立即补上HT培养 液，利于细胞保持较好的状态。 取样时做好标记，以免造成错误。
杂交瘤细胞的亚克隆原则
对于检测抗体阳性的杂交克隆应尽早进行克 隆化，否则抗体分泌的细胞会被抗体非分泌 的细胞所抑制，因为抗体非分泌细胞的生长 速度比抗体分泌的细胞生长速度快，二者竞 争的结果会使抗体分泌的细胞丢失。即使克 隆化过的杂交瘤细胞也需要定期的再克隆， 以防止杂交瘤细胞的突变或染色体丢失，从 而丧失产生抗体的能力。
SP2/0细胞的准备 饲养层细胞的制备 免疫脾细胞的制备 融合 阳性杂交瘤的筛选 细胞的冻存与复苏 单克隆抗体的制备
SP2/0细胞的准备
SP2/0细胞在融合前应先用含8-氮鸟嘌呤的培养基 作适应培养，使生存的细胞对HAT呈均一的敏感 性。 融合前24-48 h将SP2/0细胞分瓶扩大培养，融合前 6 h，弃去瓶中培养液，换上新液。 融合时，选择形态良好、呈对数生长的SP2/0细胞， 将其从瓶壁上轻轻吹下，收集于15 mL离心管内， 1000 rpm离心5 min，用5 mL无血清的1640悬浮沉 淀，再离心一次，然后用无血清的1640培养液重 新悬浮，细胞计数，取107细胞悬液备用。
McAb相对亲和力的鉴定
采用ELISA法，用抗原包被ELISA板，一抗 为不同稀释度的单抗，二抗为羊抗鼠IgG， ABTS显色后测定A值。再以单抗的浓度的浓 度为横坐标，以其相应的A值为纵坐标，绘 制标准曲线。从标准曲线上根据直线中点对 应的各株单抗的浓度，即可求出各株单抗的 相对亲和力。
杂交瘤技术的基本原理
HAT培养基的选择原理： A：氨基蝶呤 (A)是叶酸拮抗剂，可阻断细胞利用正常 途径合成DNA，细胞在含有氨基蝶呤的培养基中不 能通过正常途径合成DNA。 B ：瘤细胞是 HGPRT 酶阴性细胞，自身不能通过替代 途径合成DNA而繁殖。 C：B细胞虽含有HGPRT，但不能在体外培养存活（只 存活5~7d，且功能下降)。 D：融合细胞含有B细胞和瘤细胞，其中瘤细胞核利用 B细胞的HGPRT酶进行旁路合成DNA而存活。
免疫程序与检测方法的建立
免疫程序 建立检测方法 检测免疫效果
免疫程序
取6-8周龄Balb／C雌鼠，首免，每只鼠用0.5 mL含50 µ g的 重组蛋白与10 % 体积的ISA15A VG 佐剂混匀，颈背部皮下多点 注射；间隔3 w进行二免，免疫原、剂量和方法同上；再间隔2