第8章荧光免疫试验解读
第八章荧光免疫技术
第八章荧光免疫技术FluoreSCenCe ImmunoaSsay第一部分目的要求和教学内容一、目的要求掌握：荧光免疫技术原理、类型及临床应用，常用的荧光物质；熟悉：荧光免疫技术的技术要点；了解：荧光标记物的制备与保存，镧系稀土元素标记物的制备，荧光免疫技术主要类型的技术要点。
二、教学内容1．荧光标记物的制备：荧光和荧光物质，荧光标记物的制备。
2．荧光免疫显微技术：基本原理，技术类型，技术要点，方法评价，临床应用。
3．荧光免疫测定技术：时间分辨荧光免疫测定(基本原理，技术类型，技术要点，方法评价和临床应用)；荧光偏振免疫测定(基本原理，技术类型，技术要点，方法评价和临床应用)。
第二部分测试题一、选择题(一)单项选择题(A型题)1.如下有关荧光免疫技术正确的提法A．直观性检测抗原和抗体B．直观性检测抗原C．直观性检测抗体D．间接检测抗原或抗体E．间接检测抗原和抗体2．荧光素易受温度影响，操作时通常选择较佳的温度A．10～15℃B．15～20℃C．20～25℃D．25～30℃E．30～35℃3．荧光抗体保存3～4年，应选择A．小量分装、4℃B．瓶分装、4℃C．瓶分装、-10℃D．瓶分装,-20℃E．小量分装、-20℃4．下列组成荧光显微镜的结构中，与普通光学显微镜相同的是A．光源B．聚光器C．目镜D．物镜E．滤光片5．下列哪项方法不属于荧光免疫显微技术类型A．直接法B．夹心法C．间接法D．补体法E．双标记法6．荧光抗体染色标本的观察时间A．当天B.第二天C．第三天D．1周内E．5天7．荧光抗体闭接法应标记A．抗原B．抗体C．补体D．抗抗体E．抗体及补体8．荧光显微技术常用于检验血清中各种自身抗体和多种病原体抗体的方法是A．直接法B．间接法C．双抗体夹心法D．补体法E．双标记法9．荧光抗体间接法可检测A．抗原B．抗体C.补体D．蛋白质E．抗原和抗体lO．在荧光显微镜检查中直接影响检测结果的是A．抗原荧光染色B．抗体荧光染色C．补体荧光染色D．特异性荧光染色E．非特异性荧光染色11．主要用于测定各种激素、蛋白质、酶、药物及病毒抗原的技术A．荧光偏振免疫测定B．荧光免疫显微技术C．时间分辨荧光免疫测定D．底物标记荧光免疫测定E．流式荧光免疫技术12．临床药物浓度检测的首选方法A．时间分辨荧光免疫测定B．荧光偏振免疫测定C．荧光免疫显微技术D．流式荧光免疫技术E．底物标记荧光免疫测定13．最适合于时间分辨荧光免疫测定的荧光物质A．异硫氰酸荧光素B．四乙基罗丹明C．四甲基异硫氰酸罗丹明D．藻红蛋白E．镧系稀土元素(Eu)14．去除过度标记的荧光抗体最好用A.搅拌法B.透析法C.盐析法D.凝胶过滤法E.离子交换层析法15．目前使用最广泛的荧光色素为A.FITCB.RB200C.TRITCD.R-REE.Eu3+16．免疫标记技术中发展最早的技术是A.酶免疫技术B.同位素标记的免疫技术C.化学发光免疫技术D.荧光免疫技术E.免疫金银技术17．作为荧光抗体标记的荧光物质必须具备的条件中，与提高观察效果有关的是A.必须有活性化学基团B.性质稳定C.荧光效率高D.不影响蛋白质的活性E.标记方法简便快速18．决定荧光效率的因素主要是A.物质本身的物理特性B.激发光的波长C.激发光的强度D.溶剂pHE.溶剂极性19．荧光显微镜光路形式为A 衍射光、落射光B.折射光、透射光C. 透射光、落射光D.折射光、衍射光E .散射光、衍射光20．RB200产生的荧光色泽为A.橘红色B.黄绿色C.蓝紫色D.天青色E.褐黑色21．落射式荧光显微镜的吸收滤片应安装在A.激发滤片与分色镜之间B.分色镜与目镜之间C.物镜与分色镜之间D.物镜与载玻片之间E.光源与激发滤片之间22．能用于抗原定位检测的实验为A.直接法荧光抗体染色B.TRFIAC.荧光偏振免疫分析D.ELISAE.免疫比浊分析23．间接法荧光抗体染色与直接法相比,优点为A.非特异性荧光染色少B.操作更简便C.可用于抗原的定位检测D.可用于抗原定性检测E.检测不同的抗原,只需制备一种荧光抗体24．荧光免疫技术中,应用最广泛的金属元素为A.TbB.CeC.EuD.AuE.Zn25．关于直接法荧光抗体染色的特点,错误的是A.简单易行,特异性高B.敏感度偏低C.非特异性荧光染色因素少D.可检测抗原及抗体E.每检测一种抗原需制备一种相应的荧光抗体26．临床常用的荧光猝灭剂不包括A.亚甲蓝B.甲基红C.碱性复红D.伊文思蓝E.碘溶液27．荧光显微镜观察时的注意事项错误的是A.暗室内观察B.染色后标本立即观察C.37℃观察,效果最好D.不宜长时间观察一个视野E.宜用无荧光镜油28．荧光显微镜与普通光学显微镜的不同之处错误的是A.光源B.滤片C.聚光镜D.电源E.镜头29.不宜用于荧光抗体染色的标本是A.血涂片B.肝印片C.肿瘤切除物切片D.细菌涂片E.尿液30.下述物质不是荧光色素的是A.异硫氰酸荧光素B.四乙基罗丹明C.四甲基异硫氰酸罗丹明D.四甲基伞酮-β-D半乳糖苷E.藻红蛋白(二)多项选择题(x型题)1．对荧光标记物影响的因素有A．pH、温度B．溴化物、碘化物等杂质C．荧光素的浓度D．细胞固定剂E．化合物2．常用的荧光素是指A．异硫氰酸荧光素B．四乙基罗丹明C．四甲基异硫氰酸罗丹明D．藻红蛋白E．镧系稀土元素(Eu2+)3．有关荧光显微技术中制作组织标本过程要求A．尽量保持抗原完整性B．切片尽量薄C．用丙酮或乙醇固定D．制好的标本尽快染色E．制好的标本无法及时染色，应置-20℃下低温干燥保存4．荧光免疫显微技术在临床可用于A．血清中自身抗体的检测B．各种微生物的快速检查和鉴定C．寄生虫感染的诊断D．白细胞分化抗原的检测E．HLA分型检测5．荧光显微技术在组织学检查中具有如下优点A．抗原或抗体的定位B．抗原或抗体的定性检查C．抗原抗体反应的高度特异性D．荧光标本能持久保存E．能在荧光显微镜下清晰地显示其形态，直观性强6．间接荧光免疫法的优点是A．敏感性高于直接法B．制备一种荧光抗体即可检测多种抗原或抗体C．操作时间较短D．不易出现非特异荧光E．反应参与的因素多二、填空题1．荧光免疫技术的主要类型包括()和()。
免疫荧光检测
免疫荧光技术（检测抗核抗体（ANA）的实验方案）荧光免疫技术是以荧光物质标记的特异性抗体或抗原作为标准试剂，用于相应抗原或抗体的分析鉴定和定量测定。
荧光免疫技术包括荧光抗体染色技术和荧光免疫测定两大类。
荧光抗体染色技术是用荧光抗体对细胞、组织切片或其他标本中的抗原或抗体进行鉴定和定位检测，可在荧光显微镜下直接观察结果，称为荧光免疫显微技术，或是应用流式细胞仪进行自动分析检测，称为流式荧光免疫技术。
荧光免疫测定主要有时间分辨荧光免疫测定和荧光偏振免疫测定等。
本次实验以荧光免疫显微技术检测抗核抗体(ANA)为例进行实习。
抗核抗体(antinuclear antibody，ANA)又称抗核酸抗原抗体，是一组将自身真核细胞的各种成分脱氧核糖核蛋白(DNP)、DNA、可提取的核抗原(ENA)和RNA等作为靶抗原的自身抗体的总称，能与所有动物的细胞核发生反应，主要存在于血清中，也可存在于胸水、关节滑膜液和尿液中。
抗核抗体实验原理以小鼠肝细胞或某些培养细胞(如Hep-2)作抗原片，将病人血清加到抗原片上。
如果血清中含有ANA，就会与细胞核成分特异性结合。
加入荧光素标记的抗人IgG抗体又可与ANA结合，在荧光显微镜下可见细胞核部位呈现荧光。
试剂与器材1．抗原片现多用商品试剂。
如需自行制备，方法如下：(1)肝印片制备：取4-8周龄小鼠，断颈杀死后，剖腹取肝。
将肝脏剪成平面块，用生理盐水洗去血细胞，用滤纸吸干渗出的浆液。
将切面轻压于载玻片上，使其在载玻片上留下薄层肝细胞。
冷风吹干，乙醇固定，冰箱可保存1周。
(2)Hep-2细胞抗原片制备：Hep-2细胞是建株的人喉癌上皮细胞。
经适宜培养在载玻片上形成单层细胞抗原片，用洗涤洗去培养基。
干燥后，用无水乙醇固定。
(3)肝切片制备：取小鼠肝组织作冰冻切片，厚4μl。
-30℃保存备用。
2．异硫氰酸荧光素(FITC)标记的抗人IgG抗体(FITC-抗人IgG抗体)有商品供应，临用时按效价稀释。
医学免疫学检验-免疫荧光技术课件
免疫荧光技术的基本原理
样品制备
免疫荧光染色
结果观察
免疫荧光技术的操作步骤
优点
特异性高、灵敏度高、定位准确、能够同时检测多个抗原、适用于各种组织和细胞样品等。
定义
免疫荧光技术利用抗原-抗体反应的特异性，将荧光标记物与抗体结合，对待测样本中的抗原进行特异性识别和结合，形成抗原-抗体复合物，再通过荧光显微镜观察复合物发出的荧光信号，从而确定抗原含量和分布。
原理
免疫荧光技术的定义和原理
1
免疫荧光技术的应用范围
2
3
免疫荧光技术广泛应用于感染性疾病、自身免疫性疾病、肿瘤等临床疾病的诊断和鉴别诊断。
医学免疫学检验-免疫荧光技术课件
xx年xx月xx日
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目录
免疫荧光技术概述免疫荧光技术的基本原理和步骤免疫荧光技术的临床应用免疫荧光技术的质量控制和标准化总结与展望
01
免疫荧光技术概述
免疫荧光技术是一种将抗原-抗体反应与荧光标记相结合的免疫学技术，通过荧光显微镜观察样本中待测抗原的含量和分布。
疾病诊断
疫苗研发
细胞功能研究
药物疗效监测
通过免疫荧光技术了解免疫应答机制，为疫苗研发提供帮助。
利用免疫荧光技术对细胞表面分子的检测，有助于细胞功能研究。
免疫荧光技术可用于监测治疗后的血清抗体水平，评估药物疗效。
05
总结与展望
诊断感染性疾病
免疫荧光技术可以快速准确地检测病毒、细菌和其他微生物感染，有助于早期诊断和治疗。
主管检验师资格考试临床免疫学和免疫检验 复习习题 第八章 荧光免疫技术
主管检验师资格考试临床免疫学和免疫检验复习习题第八章荧光免疫技术（附答案解析）1、荧光效率的决定因素是（）A、荧光素本身特性B、激发光波长C、激发光强度D、环境因素E、温度2、FITC的吸收波长为（）A、495nmB、520nmC、570nmD、450nmE、360nm3、荧光素发射荧光属于（）A、光照发光B、化学发光C、生物发光D、电化学发光E、偏振光4、纯化荧光素标记抗体时，去除游离荧光素可采用的方法是（）A、盐析法B、离子交换层析C、亲和层析D、透析法E、活性炭吸附5、下列何种方法的灵敏度最高（）A、荧光法B、磷光法C、分光光度法D、比浊法E、化学发光法6、下列哪项方法不属于免疫荧光细胞化学（）A、直接法B、夹心法C、间接法D、补体法E、捕获法7、为了保证免疫荧光细胞化学染色的准确性，排除某些非特异性染色，必须在初次实验时进行对照试验。
下列选项中不必要的（）A、替代对照B、吸收试验C、阴性对照D、阳性对照E、补体对照8、下列组成荧光显微镜的结构中，与普通光学显微镜相同的是（）A、光源B、滤板C、聚光器D、目镜E、物镜9、荧光色素中呈现明亮黄绿色荧光的是（）A、藻红蛋白B、四甲基异硫氰酸罗丹明C、四乙基罗丹明D、异硫氰酸荧光素E、亮绿10、荧光效率是（）=A、指荧光色素将吸收的光能转变为荧光的百分率B、指荧光色素产生荧光的强度C、指接受激发光后，荧光物质所产生的荧光的色调D、指特异性荧光和非特异性荧光的强度比E、指物质产生荧光的效率11、在荧光素标记抗体技术中，荧光素的抗体之间的结合是靠（）A、范德华力B、氢键C、离子键D、共价键E、静电引力12、免疫荧光技术的基本原理是（）A、将特异性抗体标记上荧光检测抗原B、将特异性抗原标记上荧光检测抗体C、将特异性抗体标记上荧光检测抗原或抗体D、将特异性抗原标记上荧光检测抗原或抗体E、以上都不对13、荧光免疫技术中，间接法所使用的第二抗体可以是（）A、抗种属特异性IgA荧光抗体B、抗种属特异性IgG荧光抗体C、抗种属特异性IgM荧光抗体D、以上都正确E、以上都不正14、免疫荧光技术的基本原理是（）A、将特异性抗体标记上荧光检测抗原B、将特异性抗原标记上荧光检测抗体C、将特异性抗体标记上荧光检测抗原或抗体D、将特异性抗原标记上荧光检测抗原或抗体E、以上都不对15、下列哪项方法不属于免疫荧光细胞化学（）A、直接法B、夹心法C、间接法D、补体法E、捕获法16、实验本身即可避免内源性非特异性荧光干扰的检测方法为（）A、时间分辨荧光免疫测定B、荧光偏振免疫测定C、荧光酶免疫测定D、直接荧光抗体染色法E、间接荧光抗体染色法17、下述间接法描述不确切的是（）A、第一抗体为针对抗原的特异性抗体.B、第二抗体为荧光标记抗体，是针对第一抗体的抗抗体C、可用于检测抗原，也可用于检测抗体D、操作简便，特异性高E、可以用于多种抗体的检测18、下列有关间接荧光法的叙述错误的是（）A、敏感性高于直接荧光法B、以荧光素标记针对抗原的特异性抗原C、既可检测抗原，也可检测抗体D、荧光素标记抗体是抗抗体E、一种标记物可对多种抗原进行检测19、用于标记抗体的荧光素应符合下列要求，除外（）A、与蛋白质分子形成离子键B、荧光效率高，与蛋白结合后仍能保持较高的荧光效率C、荧光色泽与背景组织色泽对比鲜明D、与蛋白质结合后不影响蛋白质原有的生化与免疫学性质E、标记方法简单，安全无毒20、双标记法荧光素标记抗体技术的主要用途是（）A、提高荧光强度B、提高荧光效率C、可同时检测同一标本中两种抗原D、使用一种标记物可检测多种抗原E、减少非特异性荧光21、下列不符合荧光素标记免疫技术直接法的描述是（）A、荧光抗体直接加于标本上B、常用于抗核抗体的检测C、每检查一种抗原需制备特异的荧光素标记抗体D、灵敏度偏低E、特异性高，非特异荧光染色因素少22、目前公认的最有效的检测抗核抗体的方法（）A、ELISAB、放射免疫技术C、直接荧光法D、间接荧光法E、补体法答案部分1、【正确答案】 A【答案解析】荧光效率的决定因素是荧光素本身特性。
免疫荧光检测
免疫荧光技术(检测抗核抗体(ANA)得实验方案)荧光免疫技术就是以荧光物质标记得特异性抗体或抗原作为标准试剂,用于相应抗原或抗体得分析鉴定与定量测定。
荧光免疫技术包括荧光抗体染色技术与荧光免疫测定两大类。
荧光抗体染色技术就是用荧光抗体对细胞、组织切片或其她标本中得抗原或抗体进行鉴定与定位检测,可在荧光显微镜下直接观察结果,称为荧光免疫显微技术,或就是应用流式细胞仪进行自动分析检测,称为流式荧光免疫技术。
荧光免疫测定主要有时间分辨荧光免疫测定与荧光偏振免疫测定等。
本次实验以荧光免疫显微技术检测抗核抗体(AＮＡ)为例进行实习、抗核抗体(aｎtinｕclear anｔibodｙ,ANA)又称抗核酸抗原抗体,就是一组将自身真核细胞得各种成分脱氧核糖核蛋白(DNP)、DNＡ、可提取得核抗原(ＥNA)与ＲNＡ等作为靶抗原得自身抗体得总称,能与所有动物得细胞核发生反应,主要存在于血清中,也可存在于胸水、关节滑膜液与尿液中、抗核抗体实验原理以小鼠肝细胞或某些培养细胞(如Heｐ－2)作抗原片,将病人血清加到抗原片上。
如果血清中含有ANA,就会与细胞核成分特异性结合。
加入荧光素标记得抗人ＩgG抗体又可与ANA结合,在荧光显微镜下可见细胞核部位呈现荧光。
试剂与器材1.抗原片现多用商品试剂。
如需自行制备,方法如下:(１)肝印片制备:取4-8周龄小鼠,断颈杀死后,剖腹取肝。
将肝脏剪成平面块,用生理盐水洗去血细胞,用滤纸吸干渗出得浆液。
将切面轻压于载玻片上,使其在载玻片上留下薄层肝细胞。
冷风吹干,乙醇固定,冰箱可保存1周。
(2)Hｅｐ—2细胞抗原片制备:Hｅp－２细胞就是建株得人喉癌上皮细胞。
经适宜培养在载玻片上形成单层细胞抗原片,用洗涤洗去培养基。
干燥后,用无水乙醇固定。
(3)肝切片制备:取小鼠肝组织作冰冻切片,厚４μl。
-3０℃保存备用。
2.异硫氰酸荧光素(ＦITC)标记得抗人IgＧ抗体(FITC—抗人IｇＧ抗体)有商品供应,临用时按效价稀释。
医学免疫学检验免疫荧光技术课件
由于免疫荧光技术需要使用昂贵的荧光标记抗体，因此检测成本 较高，限制了其在临床上的广泛应用。
对实验人员要求高
免疫荧光技术需要具备一定的实验技能和经验，对实验人员的专业 素质要求较高。
免疫荧光技术的应用前景和研究方向
应用前景
免疫荧光技术在医学、生物学和化学等领 域具有广泛的应用前景，特别是在医学诊 断和研究中发挥着重要作用。
医学免疫学检验免疫荧光 技术课件
xx年xx月xx日
目录
• 免疫荧光技术概述 • 免疫荧光技术的基本原理和分类 • 免疫荧光技术的应用 • 免疫荧光技术的操作流程 • 免疫荧光技术的优缺点 • 免疫荧光技术在医学检验中的应用案例分析
01
免疫荧光技术概述
免疫荧光技术的定义与特点
定义
免疫荧光技术是一种在生物体上应用荧光素标记抗体，从而 检测特异性抗原的方法。
荧光显微镜观察
使用荧光显微镜观察样品，并在激发波长下观察荧光信号。
结果记录与分析
记录荧光信号的强度、分布和颜色等信息，并对这些信息进行分析，以确定 抗原的存在和定位。
影响因素和注意事项
温度和湿度
抗原分布和抗体特异性
免疫荧光技术的结果受温度和湿度的影响较 大，因此需要在恒温恒湿的环境中进行操作 。
抗原在细胞中的分布和抗体与抗原的特异性 结合是影响免疫荧光技术结果的重要因素。
04
免疫荧光技术的操作流程
样品制备
01
样品选择与处理
选择适当的临床样品，如血清、组织切片等，并进行适当的预处理，
以去除杂质和提高样品质量。
02
细胞固定
将样品在室温下与适量的缓冲液混合，然后加入适量的甲醛或乙醇，
以固定细胞并保持其完整性。
关于荧光免疫技术详细介绍
关于荧光免疫技术详细介绍荧光免疫技术是一种基于抗体-抗原反应原理的分析方法，利用荧光染料标记的抗体或抗原与靶标结合后，通过测量荧光信号的强度来检测和定量分析靶标物质。
荧光免疫技术的原理主要包括标记物准备、信号检测和结果分析三个方面。
首先，需要将抗体或抗原与荧光染料标记结合，一般通过共价键合、生物素-链霉亲和素体系或其他化学反应进行标记。
标记物的选择应该满足荧光发射波长范围广、发射光强、稳定性好等要求。
然后，标记物与待检测样品中的靶标物质结合，形成抗原-抗体复合物。
最后，通过荧光检测仪器，测量荧光信号的强度，并将其转化为定量结果。
荧光免疫技术具有以下优势：首先，荧光信号强度大，可以实现高灵敏度的检测。
其次，荧光染料具有多样化的波长特性，可以实现多通道的同时测量。
此外，荧光免疫技术还具有选择性高、重复性好、灵敏度高、分析速度快、自动化程度高的特点。
荧光免疫技术在医学、生物学和环境监测等领域有广泛的应用。
在医学上，荧光免疫技术可以用于疾病的早期诊断和预防，如肿瘤标记物检测、感染病原体的检测和体液中特定蛋白质的定量等。
在生物学研究中，荧光免疫技术可以用于检测细胞和分子的定位、定量和相互作用等。
在环境监测中，荧光免疫技术可以用于检测污染物、重金属和有害物质等。
衡量荧光免疫技术的指标主要包括检测灵敏度、检测限、特异性、线性范围、准确性和重现性等。
检测灵敏度是指该技术能够检测到的最低浓度，一般以荧光信号的强度来表示。
检测限是指能够可靠地检测到的最低浓度，一般是指信号与噪声之间的差异。
特异性是指该技术与其他分子之间的交叉反应能力。
线性范围是指该技术在一定浓度范围内与浓度之间的线性关系。
准确性是指该技术的结果与真实值之间的接近程度。
重现性是指该技术在相同条件下的重复实验结果的一致度。
在实际应用中，荧光免疫技术还可以与其他技术相结合，如酶标记技术、化学发光技术等，以扩大分析范围和提高灵敏度。
同时，随着荧光探针和检测仪器的不断发展，荧光免疫技术将会不断创新和完善，为医学和生物科学研究提供更多的选择和便利。
临床免疫学检验-课件-第8章-荧光免疫技术
二、荧光物质
(一)荧光色素：具有光致荧光的特性。
1、荧光色素应具备的条件 P87
①能与蛋白质共价结合，结合蛋白质后不易解离，而未 与蛋白质结合的色素及其降解产物容易被清除
②荧光效率高 ③荧光的颜色与背景组织的颜色对比鲜明 ④结合蛋白质后，不影响蛋白质的生化性质及免疫
离心
抗体溶液
②透析法：蛋白质含量低，样品体积小。
优点：标记均匀，非特异性荧光低。 缺点：时间长，荧光素用量多
TITC 抗体溶液 反应过夜
PBS
FITC标记 的抗体溶液
③ 影响因素
温度和时间： pH：8.8～9.5 蛋白含量：20 ～25mg/mL蛋白为宜 荧光素的纯度：不应低于75%
四、 荧光标记抗体的纯化
常用于双重标记或对比染色；
激发峰和荧光距离较大，易于选择滤光系统。
(4)藻红蛋白（ PE） 最大吸收光谱: 565nm 。 最大发射光谱: 575nm 。 荧光颜色: 橙色。 应用：
常可作为FITC的补充。
(二)其他荧光物质 1、镧系螯合物 铕(Eu3+)（应用最广）、 铽(Tb3+) 、铈(Ce3+)的螯合物 应用：荧光衰变时间长，用于时间分辨荧光免疫测定 2、酶作用后产生荧光的物质(荧光底物) 如碱性磷酸酶（4-甲基伞酮磷酸盐）、辣根过氧化物酶
学活性，而且标记方法简单、快速，结合物稳 定，易于保存。 ⑤安全无毒，不具有附加的抗原性。
2、常用的荧光色素： (1)异硫氰酸荧光素(FITC） 最大吸收光谱: 490-495nm 。 最大发射光谱: 520-530nm 。 荧光颜色: 黄绿色。 应用最广：
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三、注意事项
1.荧光染色时间：一小时内或2~8℃保存4小时， 2.三种对照：①阳对：阳性血清+荧光标记物
②阴对：阴性血清+荧光标记物 ③荧光标记物对照：PBS+荧光标记物 3.标本片需保持湿润，避免干燥 4.滴加抗体或荧光标记物,始终保持在未知抗原标本 上
荧光抗体染色及结果判断
-：无或仅见极微弱荧光。 +：荧光较弱但清楚可见。 ++ ：荧光明亮。 +++：耀眼强荧光。
间接荧光抗体染色法示意图
间接免疫荧光法示意图
间接法：
优点：敏感度高于直接法 制备一种荧光抗体可检测多种抗原 既可用于检测抗原，也可检测抗体
缺点：易出现非特异性荧光 方法较麻烦 操作时间较长
应用：自身抗体的检测
二、实验方法
标本片上滴加特异性抗体 37℃30min PBS洗涤 滴加二抗
37℃30min PBS洗涤 镜检
双标记FAT、流式 细胞术
双标记或多标记 FAT
时间分辨荧光免疫 测定
二、荧光显微镜
荧光显微镜
利用一定波长的激发 光对待测标本进行激发， 产生一定波长的荧光， 对组织细胞结构或其组 分进行定性、定位和半 定量分析检测。
滤光片
荧光显微镜
隔热滤光片： 位于灯室聚光器前， 作用阻断红外线通过而隔热。
激发滤光片： 位于光源和物镜之间， 作用能选择性地透过紫外线可
荧光免疫试验（fluoroimmunoassay):
以荧光物质标记抗体和抗原，通过与 相应抗原或抗体发生特异性结合反应，以 此对待测物进行定位、定性和定量分析的 检测技术，具有高度特异性、敏感性和直 观性，是最早出现的免疫标记技术。
第一节 荧光免疫试验的组成要素
荧光物质吸收激发光的能量后， 电子从基态跃迁到激发态，当其回 复至基态时，以发射光形式释放出 能量，称为荧光。
第四节
其他与荧光检测相关的免疫试验
其他荧光免疫试验
时间分辨荧光免疫测定 荧光偏振免疫测定 荧光酶免疫测定
一、时间分辨荧光免疫测定
（一）基本原理
1.时间分辨
➢自发荧光寿命短:1ns～10ns ➢镧系元素寿命长:10μs～ 1000μs ➢短寿命荧光完全衰变后再测定 镧系元素特异荧光
时间分辨检测原理示意图
1、抗体要求
高特异性 高亲和力 经纯化提取IgG
2 荧光素要求
❖有能与蛋白质形成共价健的化学基团 ❖荧光效率高， ❖荧光色泽与背景组织的色泽对比度高。 ❖与蛋白质结合后不影响蛋白质原有性质。 ❖标记方法简单、安全无毒。 ❖与蛋白质的结合物稳定，易于保存。
第二节 间接免疫荧光试验
一、基本原理
特异性抗体与相 应抗原反应，荧 光素标记的抗抗 体再与第一抗体 结合。
特异荧光强度+以上判定为阳性，对照光应呈或±。 根据+的血清最高稀释度判定特异性抗体效价。
第三节 流式荧光免疫试验
流式荧光免疫试验(flow cytometry and fluorescence immunoassay):
采用人工微球和流式检测方式对可溶性物质进行 高通量分析的检测方法。
悬浮阵列；流式微球阵列
基态
吸收能量
激发态
荧光效率
荧光特点：
1 可产生荧光的分子或原子在接受 能量后即刻引起发光；
2 一旦停止供能，荧光随之瞬间消 失；
一 荧光及荧光物质基础知识
(一)荧光的基本知识 1.发射光谱:指固定激发光波长，在不同 波长下记录到的标本发射荧光的谱图。
2.激发光谱:指固定检测发射光波长，用 不同波长的激发光照射标品得到的荧光 的谱图。
3.荧光物质将吸收的光能转变成荧光的百分率 ------荧光效率
激发光强度及激发光波长
决定于
发射荧光的光量子数（荧光强度）
荧光效率 ＝
吸收光的光量子数（激发光强度）
决定于
荧光色素本身的物理特性
4.荧光寿命
➢定义:荧光物质被激发后所产生 的荧光衰减到一定程度时所用的 时间。 ➢各种荧光物质的荧光寿命不同。
5.荧光淬灭:荧光物质在某些理化因素 作用下，发射荧光减弱甚至消退称为 荧光淬灭。 如紫外线照射、高温（≥20℃）、苯 胺、酚、硝基苯、I-等 。
荧光淬灭
如何避免： 勿长时间照射 脉冲瞬间照射 避光保存
猝灭剂：具有荧光猝灭作用的物质
（二）荧光物质
荧光物质 异硫氰酸荧光素 (FITC) 四乙基罗丹明 (RB200)
时间分辨荧光免疫测定
2.stokes位移:激发光谱和发射光谱的波 长差。 stokes位移小，相互干扰，影响结果准确性。 镧系元素Stokes位移大(273nm)，激发光 谱和发射光谱不重叠
时间分辨荧光免疫测定
3.发射光谱和激发光谱
发射光谱带较窄：613nm±10nm，干扰少 激发光谱带较宽：300nm～350nm，灵敏 度高
最大吸收 光谱
490～ 495nm
570～ 575nm
最大发射光谱
520～530nm （黄绿色） 595～600nm （橙红色）
应用
FAT、荧光偏振免 疫测定 FITC的衬比染色或 双标记FAT
藻红蛋白（PE） 7-氨基-4-甲基香豆素
490560nm
354nm
Eu3ꦦnm （蓝色） 613nm
时间分辨荧光免疫测定
4.荧光标记物的相对比活性 比活性 ：单位时间内每个标记分子 可被探测到的信号量。
Eu3+螯合物 反复激发 1000次/秒 大大提高了荧光标记物比活性
时间分辨荧光免疫测定
5.信号增强
见波长的光域，提供合适的激发光。 吸收滤光片： 位于物镜和目镜之间，
作用阻断激发光而使发射的荧 光透过，保护眼睛。
光路
荧光显微镜
透射光：照明光线从标
本下经聚光器透过标本
进入物镜。
落射光：照明光线从标
本上经垂直照明器落射
到标本，经标本反射进
入物镜。
透射荧光显微镜光路 落射荧光显微镜光路
(a)
(b)
三、荧光素-抗体结合物
第八章
荧光免疫试验
Fluoroimmunoassay
齐齐哈尔医学院免疫教研室
教学目的
掌握：荧光的基本知识；荧光抗体染色 与结果判断。
熟悉：荧光物质。 了解：荧光抗体的制备；荧光显微镜的
基本结构；荧光免疫分析；荧光免疫 技术的应用。
第一节 荧光免疫试验的组成因素 第二节 间接免疫荧光试验 第三节 流式荧光免疫试验 第四节 其他与荧光检测相关的免疫试验 第五节 荧光免疫试验的临床应用 第六节 影响荧光免疫试验的主要因素