时间分辨荧光免疫分析技术
时间分辨荧光免疫 镧系元素
时间分辨荧光免疫镧系元素
时间分辨荧光免疫分析是一种用于检测和测量样品中存在的特定物质的方法。
在这种分析中，使用镧系元素作为荧光标记物，其具有独特的荧光特性，能够在特定激发光的作用下发出特定的荧光信号。
以下是关于时间分辨荧光免疫和镧系元素的一些方面：
1. 方法原理，时间分辨荧光免疫分析是基于样品中目标物质与特定抗体结合形成复合物，然后加入标记有镧系元素的二抗，通过激发光激发镧系元素，测量其发出的荧光信号来定量分析目标物质的含量。
2. 镧系元素的选择，镧系元素由于其稀土特性，具有多种发射波长和长寿命的荧光特性，能够减少背景干扰，提高检测灵敏度和准确性，因此被广泛应用于时间分辨荧光免疫分析中。
3. 应用领域，时间分辨荧光免疫分析结合镧系元素标记物已被广泛应用于生物医学、环境监测、药物研发等领域，用于检测蛋白质、激素、细胞因子等生物分子的含量和活性。
4. 技术优势，与传统的荧光免疫分析方法相比，时间分辨荧光
免疫分析结合镧系元素标记物具有更高的检测灵敏度、更低的背景干扰和更广泛的应用范围，因此受到了广泛关注和应用。
总的来说，时间分辨荧光免疫分析结合镧系元素标记物是一种高效、灵敏度高的分析方法，在生命科学和医学领域有着广泛的应用前景。
希望以上信息能够帮助你更全面地了解这一技术。
时间分辨荧光免疫层析 技术原理
时间分辨荧光免疫层析技术原理
时间分辨荧光免疫层析技术（TRFIA）是一种非同位素免疫分析技术，利用
镧系元素标记抗原或抗体，通过时间分辨技术测量荧光。
具体来说，当含有待测抗原（抗体）的样品滴在加样区时，待测样品中的抗原（抗体）与结合垫中的荧光纳米微球标记的抗体（抗原）结合并通过毛细作用向前层析。
当达到检测区后，与检测线上固定的抗体（抗原）结合，形成微粒-抗体-抗原-抗体夹心复合物并被固定在检测线上，而多余的荧光微
球标记物继续向前层析，与固定在质控线上的二抗结合。
反应结束后，用紫外光源（340nm）对检测区扫描检测，检测线和质控线
上荧光纳米微球发出高强度的荧光（615nm），且衰变时间也较长。
通过
测量延缓时间，待样品基质中自然发生的短寿命荧光（1-10ns）全部衰变后，再测量稀土元素的特异性荧光，这样就可以排除非特异本底荧光的干扰。
通过检测线和质控线荧光强度的强弱及其比值，即可分析出样品中待测物的浓度。
这种技术具有高灵敏度、高特异性和可定量分析等特点。
以上内容仅供参考，如需更多信息，建议查阅时间分辨荧光免疫层析相关文献或咨询该领域专家。
实验一时间分辨荧光免疫分析法检测乙肝病毒血清20120406
乙型肝炎病毒e抗体定量测定试剂盒（时间分辨荧 光免疫分析法）
所需仪器包括微量移液器、离心机、振荡仪、洗板 机、时间分辨免疫分析仪。
实验一 时间分辨荧光免疫分析法检测
乙肝病毒血清标志物
目的要求
掌握时间分辨荧光免疫分析的检测原理。 了解时间分辨荧光免疫分析仪的构造、工作原
理。 采用时间分辨荧光免疫分析仪检测乙肝病毒血
清标志物的操作过程。
一、实验原理
时间分辨荧光免疫分析（TRFIA，Time Resolved Fluorescent Immunoassay），又称解离增强镧系荧光免 疫分析（DELFIA，Dissociation Enhancement Lanthamide Fluoro Immunoassay），是以镧系元素为 标记物和时间分辨荧光测量相结合，建立的一种新的非放射 性微量检测技术。
3. 分别取100μL校准品和待测样本加入相应的孔中， 并加贴封条。
4. 孔号1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11中， 分别加入校准A、校准B、校准C、校准D、校准E、 校准F、样本1、样本2、样本3、样本4、样本5。
注意：加样时，一定要注意加入顺序，从左至右 依次加入！
5. 置于振荡仪上缓慢振荡，室温孵育40分钟。 6. 配制铕标记物工作液：按检测所需将浓缩铕标记物稀释50
洗涤除去游离的铕标记抗-HBs，加入增强液将复合物上的 Eu3+解离到溶液中，并与增强液中的有效成分形成高荧光 强度的螯合物。
荧光强度与样本中的HBsAg浓度成正比，通过剂量-反应曲 线得出样本HBsAg浓度值。
时间分辨荧光技术
时间分辨荧光技术时间分辨荧光免疫测定（TRFIA）是一种非同位素免疫分析技术，它用镧系元素标记抗原或抗体，根据镧系元素螯合物的发光特点，用时间分辨技术测量荧光，同时检测波长和时间两个参数进行信号分辨，可有效地排除非特异荧光的干扰，极大地提高了分析灵敏度。
（一）TRFIA分析原理在生物流体和血清中的许多复合物和蛋白本身就可以发荧光，因此使用传统的发色团进而进行荧光检测的灵敏度就会严重下降。
大部分背景荧光信号是短时存在的，因此将长衰减寿命的标记物与时间分辨荧光技术相结合，就可以使瞬时荧光干扰减到最小化。
时间分辨荧光分析法（TRFIA）实际上是在荧光分析（FIA）的基础上发展起来的，它是一种特殊的荧光分析。
荧光分析利用了荧光的波长与其激发波长的巨大差异克服了普通紫外-可见分光分析法中杂色光的影响，同时，荧光分析与普通分光不同，光电接受器与激发光不在同一直线上，激发光不能直接到达光电接受器，从而大幅度地提高了光学分析的灵敏度。
但是，当进行超微量分析的时候，激发光的杂散光的影响就显得严重了。
因此，解决激发光的杂散光的影响成了提高灵敏度的瓶颈。
解决杂散光影响的最好方法当然是测量时没有激发光的存在。
但普通的荧光标志物荧光寿命非常短，激发光消失，荧光也消失。
不过有非常少的稀土金属（Eu、Tb、Sm、Dy）的荧光寿命较长，可达1～2ms，能够满足测量要求，因此而产生了时间分辨荧光分析法，即使用长效荧光标记物，在关闭激发光后再测定荧光强度的分析方法医学教|育网搜集整理。
平时常用的稀土金属主要是Eu（铕）和Tb（铽），Eu荧光寿命1ms，在水中不稳定，但加入增强剂后可以克服；Tb荧光寿命1.6ms，水中稳定，但其荧光波长短、散射严重、能量大易使组分分解，因此从测量方法学上看Tb很好，但不适合用于生物分析，故Eu最为常用。
（二）时间分辨信号原理普通物质荧光光谱分为激发光谱和发射光谱，在选择荧光物质作为标记物时，必须考虑激发光谱和发射光谱之间的波长差，即Stakes位移的大小。
时间分辨免疫荧光微球
时间分辨免疫荧光微球1. 引言1.1 背景介绍时间分辨免疫荧光微球是一种新型的生物标记技术，可以对免疫学实验数据进行高效、准确的检测分析。
随着生物技术的发展和应用，对于细胞分析和药物筛选等领域的需求日益增加，传统的免疫荧光检测方法已经不能满足科研和临床的需求。
研究人员开始探索新的技术手段来提高实验的灵敏度和准确度。
时间分辨免疫荧光微球具有高灵敏度、高通量和高分辨率的特点，可以同时检测多种生物标记物，实现快速、准确地定量分析。
其原理基于微球上包裹有特定的免疫荧光标记物，当这些微球与待测样品中的靶分子结合时，通过流式细胞仪等仪器可以实时监测免疫反应的强度和时间，从而获得更精确的实验数据。
通过时间分辨免疫荧光微球技术，研究人员可以更加深入地了解细胞内的免疫反应过程，快速筛选药物的活性和副作用，为疾病诊断和治疗提供重要的参考依据。
随着该技术在生命科学领域的不断应用和发展，相信将会有更多的创新和突破出现，为人类健康和生命的发展带来积极的影响。
1.2 研究目的研究目的是通过研究时间分辨免疫荧光微球，深入探究其在生物医学领域中的应用潜力。
通过了解其原理和实验方法，我们的目的是揭示其在疾病诊断、药物递送和细胞标记等方面的优势和局限性，为其未来的应用前景做出预测。
通过这项研究，我们希望能够为生物医学领域的研究和临床实践提供新的技术手段和思路，为推动医疗健康行业的发展做出贡献。
2. 正文2.1 原理介绍时间分辨免疫荧光微球是一种新型的生物分析技术，利用微球作为载体，结合免疫荧光标记技术，实现对不同生物标记物的高灵敏、高特异性检测。
其原理基于时间分辨光谱技术，通过采集微球悬液中的荧光信号，在不同时间点进行检测和分析，从而实现对样品中不同荧光标记物的准确识别和定量测定。
在时间分辨光谱技术中，光谱仪器以一定的时间间隔对样品中的荧光信号进行连续检测，通过对这些时间点上的信号强度和波长进行分析，可以区分出不同的荧光标记物并消除背景信号的干扰。
时间分辨荧光免疫技术
定量
ELISA（定性）
意义
0~10mIU/ml 10~100mIU/ml
>100mIU/ml
阴性（-） 阳性（+）` 阳性（+）
机体对乙肝病毒无免疫力，易感染 乙肝病毒
机体对乙肝病毒的免疫力很弱，甚 至不能预防HBV感染，仍有感染 HBV的危险
机体对乙肝病毒有较强的免疫力， 使机体有抵抗HBV入侵的作用，较 大程度上减少感染HBV的风险
而且半寿期也长，介于10-1000us之间，比普通荧光标记物高5-6 个数量级（1000ns=1us)。 含有铕或钐的螯合物的荧光衰变时间分别为730000ns和50000 ns。 因此利用延缓测量时间，待测样品中短寿命的自然荧光完全衰变 后，再检测稀土离子螯合物的荧光信号（见图1）。消除了来自样 品、试剂及其他非特异荧光，从而达到降低自然本底荧光和消除 样品荧光的干扰，大大提高了检测灵敏读。这既是我们长提到的 时间分辨。
放射性（125I），对环境的污染及对 身体的危害，已经为重视环保的国家
命性的贡献，是一项 逐步取消。（如整个欧洲仅尚存几个
较为成熟的诊断技术。 放免试验室）
125I的半衰期短而导致其试剂有效期
夹心法、竞争法的标 记原理为以后的检测
短。 标记物125I的稳定性差，导致试剂盒
技术的发展奠定了基 础。
WALLAC和新波公司使用疝灯，主要用于临床
标记物为具有独特荧光特性的稀土金属---镧系元素
镧系元素共有15种，属三价元素，应用在时间分辨荧光免疫技术中 有四种：
铕(Eu)、钐Sm)、镝(Dy)、铽(Te)
Eu3 +的应用最为广泛， Sm3+ 可作为第二种选择以进行双标记或多标记技术
时间分辨荧光免疫测定原理
时间分辨荧光免疫测定原理时间分辨荧光免疫测定（TRFIA，Time Resolved Fluorescence Immunoassay）是一种非同位素免疫分析技术。
它利用镧系元素（如铕、铽等）标记抗原或抗体，通过测量荧光强度和时间两个参数来检测待测物。
与传统的荧光免疫分析相比，TRFIA具有更高的灵敏度和特异性，能有效排除非特异性荧光的干扰。
TRFIA的分析原理主要包括以下几个方面：1.镧系元素标记：将镧系元素与抗原或抗体结合，形成具有荧光性质的标记物。
镧系元素的荧光具有较长的寿命，且发光强度与抗原或抗体的结合程度密切相关。
2.时间分辨技术：通过时间分辨技术对荧光信号进行测量，即在一定时间内对荧光信号进行积分和分析。
这种技术能够有效地区分特异性荧光信号和背景荧光信号，提高分析灵敏度。
3.信号分辨：通过检测波长和时间两个参数来分辨特异性荧光信号和非特异性荧光信号。
由于生物流体和血清中的许多复合物和蛋白本身就可以发荧光，因此使用传统的发色团进而进行荧光检测的灵敏度会严重下降。
而TRFIA方法通过时间分辨技术使瞬时荧光干扰减到最小化。
4.激发光控制：TRFIA方法在测量时采用延迟测量时间的方法，有效地消除背景荧光的干扰。
同时，解决激发光的杂散光影响也是提高灵敏度的关键。
5.数据分析：通过对测量得到的荧光信号进行数据分析，得到待测物的浓度。
TRFIA方法能够实现对超微量样品的高灵敏度检测，具有很高的分析精度。
总之，时间分辨荧光免疫测定（TRFIA）是一种基于镧系元素标记、时间分辨技术、信号分辨、激发光控制和数据分析等原理的一种高灵敏度、高特异性的免疫分析方法。
在生物医学、环境监测、食品安全等领域具有广泛的应用前景。
时间分辨荧光免疫分析法(Time-resolved fluoroimmunoassay)操作
时间分辨荧光免疫分析法(Time-resolved fluoroimmunoassay)是在荧光分析的基础上发展起来的一种特殊的荧光分析。
它利用具有长效荧光的稀土金属（Eu、Tb、Sm、Dy）作标记物，充分利用激发光与发射光之间的降移与发射光较长的半寿期，在激发光后延时测量发射光的强度。
从而所测的荧光不受激发光和被检物中的非特异荧光干扰，提高了检测的特异性与灵敏度。
在激发光后延时400微秒，测量400微秒，间歇200微秒后进入下一个测量周期，每一个周期为1000微秒。
对每一个样品实施1秒钟的测量，意味着完成了1000个周期的测量，测量精确度极高。
（一）Auto DELFIA自动时间分辨荧光免疫分析仪开/关程序1 开机1.1 依次打开样品处理器电源，微孔板处理器电源，打印机电源。
1.2 打开计算机显示器。
1.3 启动计算机。
1.4 运行系统软件：Auto DELFIA与Multicalc系统软件在Windows启动后自动运行。
Auto DELFIA workstation软件用于控制Auto DELFIA的运行，MultiCalc的主要功能是与主机通讯，对测试结果进行评估和对质控及其他数据处理（可通过双击屏幕上图标不运行）。
在MultiCalc Auto DELFIA环境下，只有键盘有效，鼠标无效。
2 开机后准备1.1 清洗液准备1.1.1 微孔板处理器洗液（250ml浓缩液＋600ml去离子水混合），每做一块板至少1升用量，洗液在密闭条件可保存2周时间。
1.1.2 准备样品处理器洗液（50ml浓缩液＋5000ml去离子水混合），每做一块板至少需要800ml洗液，洗液在密闭条件下可保存1周时间。
1.2 样品处理器准备1.2.1 在Wash bottle（清洗液瓶）、Rinse bottle (冲洗液瓶)分别注入足够用量的清洗液和去离子水，倒空废液瓶。
拧紧各瓶盖，确保废液瓶管路向下。
1.2.2 如样品需要稀释，放入稀释杯和稀释液。
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1984年， Hemmila确定了DELFIA(Dissociation Enhanced Lanthanide Fluoroimmunoassay)这种时间分辨免疫分析技术方案,从而使DELFIA成 为Wallac的专利技术
国外仪器（Wallac公司<PerkinElmer>） 国内其他公司生产的仪器(上海新波、广州丰华等) 达瑞抗体公司自主研发的仪器及软件（DR-M6601）
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19
Wallac AutoDELFIA 1235
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20
半自动 VICTOR2 1420
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时间分辨荧光免疫分析技术
达瑞抗体
2020/12/19
1
标记免疫学分析技术发展历程
免疫荧光分析(Coons, 1941) 放射免疫分析(Berson和Yalow, 1960) 酶免ELISA (Engvall, 1971) 金标免疫分析(Faulk和Taylor, 1971) 化学发光免疫分析(Arakawa， 1977) 时间分辨荧光免疫分析(Soini和Hemmila，1979) 电化学发光免疫分析(Leland, 1990) 液相芯片(美国Luminex公司, 1997)
小分子抗原竞争抑制示意图
固相包被二抗 + 一抗
孵育
+
+
孵育 Eu
待测抗原
铕标抗原
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+ 增强液 Eu
Eu
+ Eu 16
时间分辨技术重点和难点
固定相（96孔板） 标准品 铕标记物
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二、时间分辨荧光免疫分析（TRFIA） 测试仪
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目前的TRFIA测试仪：
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半自动 ANYTEST2000
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DR-M6601时间分辨荧光免疫分析仪
【粤食药管械（准）字2005第2400226】
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达瑞公司开发的系列TRF试剂
内分泌科检查 肿瘤科检查
甲状腺系列：T3、T4、FT3、FT4、TSH、 TBG、TG、TGAb、TPoAb
糖尿病系列：insulin、C-Peptide 生长激素：hGH 其他：Cortisol AFP、CEA、tPSA 、β2-MG 、hTG、 CA-242、CA-724 、 CA-50 、 fPSA 、 NSE 、 cyfra 211 、 CA-199、CA-125、CA153
传染病检查
妇产科检查
血液科检查 遗传科检查 2020/12/19
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2
⑥电化学发光 ⑤时间分辨荧光 ④化学发光 ③酶联免疫 ②放射免疫 ①免疫荧光
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3
标记免疫技术的理论检测灵敏度
放射免疫 酶联免疫 化学发光 时间分辨荧光 电化学发光
10-10-10-12 mol 10-9-10-10 mol 10-15 mol 10-18 mol 10-18 mol
孵育
Eu + 增强液
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Eu
+ Eu 13
双抗原夹心法示意图
固相包被抗原 +
孵育
待测抗体
Eu +
增强液
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Eu
孵育
+
铕标记抗原
+
EuBiblioteka 14中和法示意图(回滴定法)
+
+
中和抗原 待测抗体
孵育
+ Eu
铕标记抗体
孵育
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+ 增强液 Eu
Eu + Eu 15
600 发射光波长(nm)
0 200 400
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TRFIA技术特点
极长的荧光衰退时间 铕：730000ns
Stokes位移大 铕：激发光340nm，发射光613nm
狭窄的发射峰
解离-增强技术可使其荧光性提高100万倍
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12
双抗体夹心法示意图
固相包被抗体
Eu
+
+
待测抗原
铕标记抗体
1988年，加拿大CyberFluor公司的Diamandis创立了一种不同于DELFIA 的时间分辨荧光免疫分析，即FIAgen
2003年，时间分辨荧光分析技术获国家科技进步二等奖
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6
基本原理
三价稀土离子包括有铕(Eu)，钐（Sm)，铽 (Tb) ，镝 (Dy) 等，它们的荧光光谱具有特异性强﹑ Stokes位移大﹑寿命长 的特点
乙肝系列： HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb、HBcAb
340nm激发光
第二个循环
荧 光
613nm长寿命荧光 短 寿 命 荧 光
0
400
800
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测值时间
1000
时间:(µs） 9
激发光 荧 光 强 度
发射光
300
400
500
600
波长(nm)
2020/12/19
10
500 2020/12/19
Tb
Dy
Eu
Sm
发 射 光 强 度
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4
一、时间分辨荧光免疫分析（TRFIA） （Time-resolved fluorescence immunoassay）
背景介绍 基本原理 技术特点 反应模式
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5
背景介绍
1979年，芬兰Wallac公司研发部的Soini 和 Hemmila首次提出了建立 稀土离子标记物的“时间分辨荧光免疫分析”理论
DELFIA采用异硫氰酸苄基二亚乙基三胺四乙酸铕(DTTA-Eu) 为双功能螯合试剂，其一端螯合Eu3+，另一端可与蛋白质的NH2 连接。在中性或接近中性pH 条件下，DTTA 与Eu3+具 有足够的螯合稳定性，而在增强液（呈酸性）作用下，DTTAEu 又能将螯合的Eu3+迅速、彻底地释放出来并与增强液中的 配体螯合﹑进入胶束的疏水内核，使Eu3+荧光得以成千万倍地 放大
FIAgen采用的是以Eu3+螯合物配基BCPDA为标记物， 通过检测其与过量Eu3+形成的螯合物荧光进行定量。由于 BCPDA 的可检测性不够理想，FIAgen 需要利用生物素亲合素信号放大来弥补BCPDA 检测灵敏度的不足
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7
碱性
DELFIA标记技术
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8
通过时间延迟，将特异性荧光与非特异性荧光 分辨开来，使理论本底达到0