化学发光免疫技术与时间分辨技术的异同点
血检四项化学发光法调查
血检四项化学发光法调查目前血检四项（HBsAg、HCV、HIV、TP）的检测方法主要有酶联免疫（ELISA）、核酸扩增（PCR）、胶体金标记、以及化学发光（CLIA）。
现就CLIA在血检项目中的应用情况做一调查分析。
一．化学发光免疫分析法简介。
化学发光免疫分析法(Chemiluminescence imnunoassay，CLIA)是建立在放射免疫分析技术(radioimmunoassay，RIA)理论的基础上，以标记发光剂为示踪物信号建立起来的一种非放射标记免疫分析法。
CLIA是利用化学反应中释放大量自由能，产生激发态中间体，当其回到稳定的基态时发射出光子（hν），用发光信号测量仪对所发出的光量子进行定量测量。
鲁米诺(1umino1)、异鲁米诺(isolumino1)及其衍生物、吖啶酯(acIidinim ester)衍生物、辣根过氧化物酶(horseradishperoxidase，HRP)和碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)是目前CLIA中使用最多的四类标记物。
表1 化学发光法类型注：* 严格意义上属于荧光免疫。
二．国内外化学发光法的仪器和试剂情况。
国外化学发光法检测仪器的生产厂家以贝克曼、雅培、罗氏、拜耳这四家的市场占有率较高。
其中罗氏拥有唯一的电化学发光技术，雅培则独占微粒子酶联免疫（EMIA）。
不同厂家的仪器有各自的优势检测项目，主流的仪器型号如下：表2 国外主要化学发光免疫分析仪厂家国内也逐渐有厂家研制化学发光试剂，配合国外引进的仪器（多为半自动）共同销售，也有自发研制的化学发光仪（泰格科信）。
针对血检四项（HBsAg、HCV、HIV、TP），除北京科美生物（科美东雅）外，所有厂家试剂均只有HBsAg试剂。
表3 国内主要厂家仪器和试剂情况国外厂家的试剂大多随仪器配送，并没有在SFDA单独注册。
目前SFDA注册的血检四项化学发光法试剂列表如下。
就检测项目来看，除梅毒外，其余三项均可使用化学发光法；就现有资料，国内外只有北京科美东雅配有梅毒检测试剂。
化学发光免疫分析与其他方法对比
化学发光免疫分析与其他方法对比化学发光免疫分析（Chemiluminescent Immunoassay, CLIA）是一种高灵敏度和高特异性的分析方法，常用于检测血液中的生物标志物以及其他生物样品中的分析物。
与其他常用的分析方法相比，化学发光免疫分析具有以下特点：1. 高灵敏度：化学发光免疫分析使用化学荧光产生光信号，荧光强度较高，大大提高了检测灵敏度。
正常情况下，化学发光免疫分析的灵敏度可达到ng/mL或pg/mL级别。
2.高特异性：化学发光免疫分析使用特异性的抗体或配体与待测物结合，能够准确地检测目标物质，避免了其他背景物质的干扰，保证了结果的准确性和可靠性。
3. 宽线性范围：化学发光免疫分析可在一个较宽的浓度范围内进行定量分析，通常可以在pg/mL到μg/mL范围内准确测量待测物质的浓度。
4.快速：化学发光免疫分析的反应速度较快，通常只需要几分钟到几十分钟就可获得结果。
这使得化学发光免疫分析在临床医学等领域中得到广泛应用。
5.自动化程度高：化学发光免疫分析通常使用酶标仪或化学发光仪进行测量，并且具备连续连续、多重测量和自动分析等功能，可适应高通量、多样品同时处理的需求。
除了化学发光免疫分析，目前常用的其他方法包括酶联免疫吸附试验（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, ELISA）、放射免疫分析（Radioimmunoassay, RIA）和免疫荧光分析（Immunofluorescence Assay, IFA）等。
与这些方法相比，化学发光免疫分析具有以下优势：1.安全性高：化学发光免疫分析不需要使用放射性物质，相比放射免疫分析更为安全，没有放射性污染的风险。
2.操作简便：化学发光免疫分析的操作相对简单，只需将样本和试剂添加到试验板中，并通过酶标仪或化学发光仪进行测量，不需要繁琐的实验步骤和长时间的操作。
3.灵敏度更高：相对于常规的ELISA方法，化学发光免疫分析的灵敏度更高。
发光免疫分析技术的原理和特点
高灵敏度
• 通常酶联免疫技术的分析灵敏度可达到 10mol/L,新型的微珠包被酶放大免疫技 术的分析灵敏度可达到10mol/L；荧光 免疫及采用沉降法的普通放免技术可达 到10mol/L；固相放免技术可达到 10mol/L。而发光免疫分析技术的分析 灵敏度已经达到10mol/L。
• 如果以每次实验的加样量为50ul，按摩尔常数 为6.02×10 计算，此时样品中仅有几十个待 测物分子。这个灵敏度已经接近了免疫检测技 术的理论极限。在现有的实验模式下，试图检 测更少的待测物分子是不现实的。因为更高的 灵敏度，必须要求加入反应的样品中存在数量 非常恒定的待测物分子，以保证其检测结果的 稳定性；但由于分子运动的存在，这显然是一 个很不确定的随机事件。因此即使存在这样的 方法，其检测结果的可靠性也是根本无法接受 的。所以除目前尚未应用于临床诊断的单分子 检测技术以外，任何宣传采用常规加样方式的 免疫分析技术能够在分析灵敏度上超越这一极 限的论调，显然是荒谬的；因为溶液中分子的 随机运动会毫不留情的扼杀这样的图谋。
• 上述装置之所以称为单光子计数器，是因为仅用 于单光子事件的测量，即待测物的辐射跃迁仅存 在一种可能性，换句话说，其检测的光子能极是 一样的。通常化学发光、生物发光、荧光等均属 于单光子事件因此一般都用单光子计数器测量， 而以往在放射性免疫分析中常用的液体或固体闪 烁计数仪均使用多光子计数仪，其原因为放射性 同位素导致的液体或固体闪烁为多光子事件，即 辐射跃迁存在多种可能性。换句话说，其光子的 能级是多样的，而且不同的同位素具有各自不同 的多个能级和跃迁方式，因此其测量方式为多能 级符合方式。所以在闪烁测定时，不同类型的放 射性同位素要选择与之相应的通道。
最后使阳极产生了一个能量远远高于最初光子的 电脉冲信号。该信号经前置放大器放大，在经过 比较器去除噪声信号，最后由分频器换算出光子 脉冲数。通常以相对发光单位即RLU为单位，一 个RLU相当于10个光子。 • 由于单光子计数器具有的卓越性能，它已成为现 代光学仪器中最重要的部分之一，也是今后临床 检验仪器发展的方向之一。事实上，正是由于它 的发明及应用，使现代免疫及基因分析技术才能 从放射性同位素的束缚中解放出来，真正步入安 全化、非同位素化的新时代。
化学发光介绍
5、糖尿病系列
C肽,INS,INS-AB,GAD,PINS,ICA…
10、不断发展中的其他临床检测 项目
为什么要开展乙肝“两对半”定量检测
▪ 乙型病毒性肝炎是世界性的传染病,严重地威胁着人类的健康 我国是乙型病毒 性肝炎高发病国家 据统计全世界无症状携带者 HBsAg携带者 超过2.8亿,我国 占1亿以上,且多数无症状 所以乙肝的早期诊断对控制传染源、降低发病率及 疾病的治疗均具有很重要的意义 酶标 ELISA 检测始于20世纪80年代中期,它 对乙肝“两对半”定性测定在疾病的诊断,病情监测,疗效观察起到了1定的作 用,但酶标检测HbsAg灵敏度较低,不能真正意义上定量测定血清中HbsAg含量 随着临床医学的发展,定性检测已经远远不能满足临床及患者的要求 化学发光 免疫分析定量测定乙肝“两对半”大大弥补了酶标定性测定及灵敏度低的不 足
断病情提供依据 并且目前病毒性肝炎和其他病因所致的肝病甚多,而且临
床症状、体征及肝功能无特殊改变差异,故只有依靠高灵敏度的病原学鉴别
诊断
▪ 1．缩短急性乙肝HBsAg 测定“窗口期”
▪ 2．如病毒发生变异后,表达量较低,常规ELISA测不出抗原,而化学发光 免疫分析定量具有极高的灵敏度,可发现并极有可能同时测定出 HBsAg和HBsAb
▪ 安全性好及使用期长
▪ 免除了使用放射性物质 到目前为止,还未发现其危害性；试剂稳定,保存期 可达1年
目前化学发光开展的项目
1、乙肝两对半 表面抗原、表面抗 6、肝纤维化检测 HA,LN,PCIII,CIV,FN
体、E抗原、E抗体、核心抗体
2、肿瘤标志物
AFP,CEA,PSA,FPSA,FER,CA199,CA1 25,CA153,B-2MG…
甲状腺功能的实验室检测的原理及方法
甲状腺功能的实验室检测的原理及方法甲状腺功能实验室检查主要包括甲状腺激素、促甲状腺激素、甲状腺激素结合球蛋白和相关自身抗体检测。
目前认为，联合进行游离三碘甲状腺原氨酸，游离甲状腺素和超敏促甲状腺激素测定，是甲状腺功能评估的首选方案和第一线指标。
甲状腺激素的测定多采用免疫分析法，但传统的放射免疫法灵敏度有限，不能区别正常人低值和原发性甲亢。
化学发光免疫法和时间分辨荧光免疫法都更为灵敏、准确，其检测限可达0.001mIU/L。
但无论检测方法灵敏度多高，结果多准确，都必须结合临床和其他甲状腺功能检查才能做出正确诊断和治疗决策。
一、甲状腺素甲状腺素（thyroxine，T4）检测具有多种方法，传统检测方法采用放射性碘标记的放射免疫法。
但其操作过程繁琐，在临床应用中受到一定限制。
时间分辨荧光免疫法和电化学发光法均是目前最先进的标记免疫测定技术，其检测快捷，敏感度高，近年来在临床T4 检测中被广泛应用。
时间分辨荧光免疫法测定血清总甲状腺素如下：1.原理加入待测血清、铕标记T4和鼠抗T4的单克隆抗体（单抗）温育，试剂中的8-苯胺-1-萘磺酸（ANS）能将结合状态的T4游离出来。
抗T4单抗和包被在微孔板上的二抗结合的同时，样本中的T4和铕标记T4竞争结合抗T4单抗上的结合位点，温育后洗板，加入解离增强液将标记在复合物中的铕离子解离至溶液中，与增强液中的有关成分形成荧光螯合物微囊，发出的荧光强度与样品中的总甲状腺素（total thyroxin，TT4）浓度成反比。
2.试剂与仪器购买成套的商品试剂盒，主要成分如下：已包被第二抗体的96微孔反应板，T4标准品（6瓶，分别含0、20、50、100、150和300nmol/L 的T4标准品），抗T4单克隆抗体（含ANS），铕标记T4（含ANS），浓缩洗液（25×），缓冲溶液，增强液。
3.操作（1）试剂准备：1）洗涤液：40ml浓缩洗液加960ml蒸馏水混合（pH 7.8）。
荧光和化学发光免疫分析方法
荧光和化学发光免疫分析方法免疫分析是利用抗原抗体反应进行的检测方法，即利用抗原与抗体的特异性反应，应用制备好的抗原或抗体作为试剂，以检测标本中的相应抗体或抗原。
由于免疫的特异性结合，免疫分析方法具有很好的选择性，荧光免疫分析和化学发光免疫分析是其中典型的两种。
本文将对这两种免疫分析方法进行详细的介绍。
一、免疫免疫是指机体免疫系统识别自身与异己物质，并通过免疫应答排除抗原性异物，以维持机体生理平衡的功能。
免疫是人体的一种生理功能，人体依靠这种功能识别“自己”和“非己”成分，从而破坏和排斥进入人体的抗原物质，或人体本身所产生的损伤细胞和肿瘤细胞等，以维持人体的健康。
特异性免疫系统，是一个专一性的免疫机制，针对一种抗原所生成的免疫淋巴细胞（浆细胞）分泌的抗体，只能对同一种抗原发挥免疫功能。
而对变异或其他抗原毫无作用。
1、抗原1.1抗原的定义抗原：是一类能刺激机体免疫系统使之产生特异性免疫应答（免疫原性），并能与相应抗体在体内或体外发生特异性结合的物质（免疫反应性）。
抗原一般为大分子物质，其分子量在10kD以上。
1.2抗原的分类完全抗原：同时具有免疫原性和免疫反应性的抗原，如细菌、病毒、异种动物血清等。
半抗原：仅具有与相应抗原或致敏淋巴细胞结合的免疫反应性，而无免疫原性的物质。
如大多数的多糖、类脂及一些简单的化学物质，它们本身不具免疫原性，但当与蛋白质大分子结合后形成复合物，便获得了免疫原性，1.3抗原的性质决定簇是指抗原分子表面的基团，它直接决定免疫学反映的特异性。
抗原通过抗原决定簇与相应淋巴细胞表面抗原受体结合，从而激活淋巴细胞，引起免疫应答，抗原也藉此与相应抗体或致敏淋巴细胞发生特异性结合。
因此，抗原决定簇是被免疫细胞识别的靶结构，也是免疫反应具有特异性的物质基础。
2、抗体2.1抗体的定义抗体：是机体受抗原刺激后，由淋巴细胞合成的一类能与相应抗原发生特异性结合的球蛋白。
2.2抗体的结构抗体是机体受抗原刺激后，由淋巴细胞特别是浆细胞合成的一类能与相应抗原发生特异性结合的球蛋白，因其具有免疫活性故又称作免疫球蛋白。
化学发光检测原理介绍
图1 电化学发光原理
代表企业：罗氏、普门
图2 电化学发光反应
光激化学发光免疫分析
光激化学发光技术均就是相化学发光，以纳米级高分子微粒为基础，该系统有两个微球(（供体微球和受 体微球）组成,供体微球含有光敏物质表面覆盖有水凝胶可与链霉亲和素类活性物质结合；受体微球含有 发光物质且表面的水合凝胶可以与活性分子（抗体、生物素）结合。利用作为供体和受体的微珠来检测生 物分子的相互作用，当生物分子存在相互作用时，这种相互作用会将供体和受体微球拉近，从而激发级联 放大的化学反应，产生极大增强了信号。光激化学发光借助“双球”和“双标”的技术可做到无需分离未 参加免疫反应的标记微球，实现均相免疫分析。
体外诊断主要技术手段生命周期
高速发 展期
衰退阶段
体外诊断上下游
免疫检测技术介绍
定义与分类
免疫检测技术的定义
免疫检测：利用抗原和抗体的特异性反应进行检测，利用同位素、酶、化学发光物质等对检测信号进行放大和显示， 常被用于检测蛋白质、激素等微量物质。免疫诊断在临床诊断中占据着非常重要的地位，常见的免疫技术有放射性免 疫、酶联免疫、化学发光、电化学发光、纳米磁微粒化学发光。
举例：人绒毛膜促性腺激素化学发光测定原理 待测物HCG首先与酶标记的抗体以及发光标记物标记的抗体反应， 形成双抗体夹心复合物，随后再加入与含有与发光标记物结合的磁 珠，通过磁铁将复合物聚集，最后加入发光底物产生光信号进行定 量。
化学发光免疫分析法分类
按免疫标记物分类
酶促化学发光
辣根过氧化物酶（HRP）、碱性磷酸酶 （ALP）
免疫诊断从结果判断的方法学上可分：
化学发光免疫 分析法
放射免疫法
免疫胶体金法
时间分辨荧光 免疫分析法
化学发光免疫分析技术原理和类型
化学发光免疫分析技术原理和类型化学发光免疫分析(chemiluminescence immunoassay,CLIA),是将具有高灵敏度的化学发光测定技术与高特异性的免疫反应相结合，用于各种抗原、半抗原、抗体、激素、酶、脂肪酸、维生素和药物等的检测分析技术。
是继放免分析、酶免分析、荧光免疫分析和时间分辨荧光免疫分析之后发展起来的一项最新免疫测定技术。
1、化学发光免疫分析原理化学发光免疫分析包含两个部分, 即免疫反应系统和化学发光分析系统。
化学发光分析系统是利用化学发光物质经催化剂的催化和氧化剂的氧化, 形成一个激发态的中间体, 当这种激发态中间体回到稳定的基态时, 同时发射出光子(hM) , 利用发光信号测量仪器测量光量子产额。
免疫反应系统是将发光物质(在反应剂激发下生成激发态中间体) 直接标记在抗原(化学发光免疫分析) 或抗体(免疫化学发光分析) 上, 或酶作用于发光底物。
2、化学发光免疫分析的类型化学发光免疫分析法以标记方法的不同而分为两种:(1)化学发光标记免疫分析法(2)酶标记、以化学发光底物作信号试剂的化学发光酶免疫分析法2. 1 化学发光标记免疫分析化学发光标记免疫分析又称化学发光免疫分析(CL IA ) , 是用化学发光剂直接标记抗原或抗体的免疫分析方法。
常用于标记的化学发光物质有吖啶酯类化合物——acridin ium ester (A E) , 是有效的发光标记物[ 3 ] , 其通过起动发光试剂(N aOH2H2O 2 ) 作用而发光, 强烈的直接发光在一秒钟内完成, 为快速的闪烁发光(见图1)。
吖啶酯作为标记物用于免疫分析, 其化学反应简单、快速、无须催化剂; 检测小分子抗原采用竞争法(见图2) , 大分子抗原则采用夹心法(见图3) , 非特异性结合少, 本底低; 与大分子的结合不会减小所产生的光量, 从而增加灵敏度。
2. 2 化学发光酶免疫分析从标记免疫分析角度, 化学发光酶免疫分析( chem ilum inescen tenzym e imm unoassay,CL E IA ) , 应属酶免疫分析, 只是酶反应的底物是发光剂, 操作步骤与酶免分析完全相同[ 5 ]: 以酶标记生物活性物质(如酶标记的抗原或抗体) 进行免疫反应, 免疫反应复合物上的酶再作用于发光底物, 在信号试剂作用下发光, 用发光信号测定仪进行发光测定。
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化学发光免疫技术与时间分辨技术的异同点
概念
化学发光免疫分析(chemiluminescence immunoassay,CLIA),是将具有高灵敏度的化学发
光测定技术与高特异性的免疫反应相结合，用于各种抗原、半抗原、抗体、激素、酶、脂肪
酸、维生素和药物等的检测分析技术。是继放免分析、酶免分析、荧光免疫分析和时间分辨
荧光免疫分析之后发展起来的一项最新免疫测定技术。
时间分辨荧光免疫测定（TRFIA）是以镧系元素标记抗原或抗体，并与时间分辨测定技术结
合而建立起来的一种新型非放射性微量免疫分析技术，它根据镧系元素螯合物的发光特点，
用时间分辨技术测量荧光，同时检测波长和时间两个参数进行信号分辨，可有效地排除非特
异荧光的干扰，极大地提高了分析灵敏度。
原理
化学发光免疫分析包含两个部分, 即免疫反应系统和化学发光分析系统。化学发光分
析系统是利用化学发光物质经催化剂的催化和氧化剂的氧化, 形成一个激发态的中间体,
当这种激发态中间体回到稳定的基态时, 同时发射出光子(hM) , 利用发光信号测量仪器测
量光量子产额。免疫反应系统是将发光物质(在反应剂激发下生成激发态中间体) 直接标记
在抗原(化学发光免疫分析) 或抗体(免疫化学发光分析) 上, 或酶作用于发光底物。鲁米诺
(1umino1)、异鲁米诺(isolumino1)及其衍生物、吖啶酯(acIidinim ester)衍生物、辣根过氧
化物酶(horseradishperoxidase，HRP)和碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)是目前
CLIA中使用最多的四类标记物。
时间分辨荧光免疫测定（TRFIA）基本原理
用三价稀土离子及其鳌合剂作为示踪物，代替荧光物质、同位素或酶，标
记蛋白质、激素、抗原、抗体、核酸探针等物质，当免疫反应体系发生后，根据稀土
离子螯合物的荧光光谱的特点，用时间分辨荧光分析仪测定免疫反应最后产物中荧光强度。
根据荧光强度或相对荧光强度比值，来判断反应体系中分析物的浓度，达到定量分析之目的。
应用
化学发光免疫分析技术
（CLIA）
各种激素、病毒抗原抗体、肿瘤标志物、感染性疾病、心脏标志物、治疗药物检测
等各种抗原、抗体和半抗原
时间分辨荧光免疫测定（TRFIA）应用广泛
1. 多肽类：蛋白质、激素（甲状腺激素、甾体类激素）。
2.病原体抗原/抗体
3.病毒性肝炎标志物
4.肿瘤相关抗原
5.药物
6.核酸
优缺点
优点
化学发光免疫分析法
（CLIA）
➢ 单个样本检测速度快，适合做急诊；
➢ 灵敏度较高；
➢ 自动化程度高；
时间分辨荧光免疫技术（TRFIA）
➢ 发射光和激发光有较大的STOKES位移——高特异性
➢ 长寿命荧光，降低其他物质的荧光干扰——高灵敏度
➢ 半衰期长达几十万年，试剂受干扰小——高稳定性
➢ 荧光寿命长，易于自动化
➢ 重复性好
➢ 标准曲线范围宽
➢ 结果可靠
与其它技术的相对优势：
（1）、是现有的免疫检测方法中灵敏度最高的
（2）、是现有的免疫检测方法中稳定性最好的
（3）、多标记检测是目前所有免疫检测技术中独一无二的
缺点
化学发光免疫分析法
（CLIA）
➢ 发光过程短
➢ 本底较高
➢ 仪器故障率较高
➢ 试剂稳定性差
➢ 检测精度不高
试剂价格高
时间分辨荧光免疫测定（TRFIA）
➢ 测量方式复杂
➢ 仪器成本及维护费用高
➢ 环境及样品中同元素可导致本底干扰等
类型 原理及试剂 发光类型
化学发光免疫分析（CLIA） 用化学发光物质直接标记抗原或抗体组成 吖啶酯
（acrydinum esters）
时间分辨免疫荧光分析（TRFIA）* 是用三价稀土离子及其螯合剂作为示踪物 铕（ Eu3+ ）、 铽（ Te3+ ）
及钐（ Sm3+ ）、 镝
（ De3+ ）
化学发光与时间分辨荧光方法学比较
化学发光 时间分辨荧光
发光效率
1% 95%
重复检测 不可重复 可无数次重复
本底噪声 干扰大 零本底
灵敏级数
10 -15 10
-18
标记物 大分子化合物 原子
标记位点 1个/抗体 可达20个/抗体
标准曲线 稳定2~4周 稳定达一年以上
多标记 无 有，最多可达四个标记
科研开发 无 有
化学发光免疫技术原理图
时间分辨免疫技术原理图
镧系元素的荧光光谱stokes位移示意图