化学发光免疫技术与时间分辨技术的异同点
化学发光免疫分析与其他方法对比
化学发光免疫分析与其他方法对比化学发光免疫分析（Chemiluminescent Immunoassay, CLIA）是一种高灵敏度和高特异性的分析方法，常用于检测血液中的生物标志物以及其他生物样品中的分析物。
与其他常用的分析方法相比，化学发光免疫分析具有以下特点：1. 高灵敏度：化学发光免疫分析使用化学荧光产生光信号，荧光强度较高，大大提高了检测灵敏度。
正常情况下，化学发光免疫分析的灵敏度可达到ng/mL或pg/mL级别。
2.高特异性：化学发光免疫分析使用特异性的抗体或配体与待测物结合，能够准确地检测目标物质，避免了其他背景物质的干扰，保证了结果的准确性和可靠性。
3. 宽线性范围：化学发光免疫分析可在一个较宽的浓度范围内进行定量分析，通常可以在pg/mL到μg/mL范围内准确测量待测物质的浓度。
4.快速：化学发光免疫分析的反应速度较快，通常只需要几分钟到几十分钟就可获得结果。
这使得化学发光免疫分析在临床医学等领域中得到广泛应用。
5.自动化程度高：化学发光免疫分析通常使用酶标仪或化学发光仪进行测量，并且具备连续连续、多重测量和自动分析等功能，可适应高通量、多样品同时处理的需求。
除了化学发光免疫分析，目前常用的其他方法包括酶联免疫吸附试验（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, ELISA）、放射免疫分析（Radioimmunoassay, RIA）和免疫荧光分析（Immunofluorescence Assay, IFA）等。
与这些方法相比，化学发光免疫分析具有以下优势：1.安全性高：化学发光免疫分析不需要使用放射性物质，相比放射免疫分析更为安全，没有放射性污染的风险。
2.操作简便：化学发光免疫分析的操作相对简单，只需将样本和试剂添加到试验板中，并通过酶标仪或化学发光仪进行测量，不需要繁琐的实验步骤和长时间的操作。
3.灵敏度更高：相对于常规的ELISA方法，化学发光免疫分析的灵敏度更高。
化学发光方法学比较汇总
免疫学技术的迅速发展对精度的要求越来越高，一般的酶免检测技术已逐渐无法适应这种形势的需要。
现今发展的主流已不再是用放射性同位素标记的测定方法(避免污染环境及对人体损害)，而是转向于能在任何地方操作的快速均相和固相测定，最终趋向于能够枪测到皮克或10负18摩尔级的、非同位素的、自动或半自动的实验室测定技术，发光免疫分析技术顺应了这一潮流，开创了免疫诊断的新纪元。
发光免疫分析是一种灵敏度高、特异性强、检测快速及无放射危害的分析技术。
70年代末以来得到了迅速发展，目前在国际上已经实现商品化和产业化的发光免疫分析产品，基本上可以分为：化学发光、时间分辨荧光(也称时间延迟光致发光)、电化学发光(也称场致发光和电致发光)几种。
1、化学发光化学发光是指在化学反应过程中发出可见光的现象。
通常是指有些化合物不经紫外光或可见光照射，通过吸收化学能(主要为氧化还原反应)，从基态激发至激发态。
退激时通过跃迁(或将激发能转移至受体分子上)，释放能量产生光子，以光形式放出能量从而导致的发光现象。
其主要特点为消耗发光剂。
同时量子效率相对较低。
1.1 按化学反应类型分类：可分为酶促化学发光和非酶促化学发光两类。
其中酶促化学发光主要包括辣根过氧化物酶(HRP)系统、碱性磷酸酶 (ALP)系统、黄嘌呤氧化酶系统等。
酶促发光的共同特点为发光过程中作为标记物的酶基本不被消耗，而反应体系中发光剂充分过最，因此发光信号强而稳定，且发光时间较长。
因此可采用速率法测量，故检测方式简单、成本较低。
酶促反应的主要缺点为工作曲线可能随时间漂移，而且低端斜率容易呈非线性下移。
而非酶促化学发光包括吖啶酯系统、草酸酯系统、三价铁一鲁米诺系统等。
非酶促发光的共同特点为发光过程中标记物被消耗，同时作为标记物的发光剂是发光反应的瓶颈，即含量总是相对不足，因此发光信号持续时间较短；如果直接在免疫反应杯中启动发光反应，由于发光剂被很快消耗，故只能进行一次性测量。
所以重复性较差。
化学发光免疫分析与其他方法对比
化学发光免疫分析的优点：
• 4．分析方法简便快速：绝大多数分析测定均为仅需加 入一种试剂（或复合试剂）的一步模式。
• 5．结果稳定、误差小：样品系直接自己发光，不需要 任何光源照射，免除了各种可能因素（光源稳定性、光 散射、光波选择器等）给分析带来的影响，使分析结果 灵敏稳定可靠。
• 6．安全性好及使用期长：在上述优点前提下，更免除 了使用放射性物质。到目前为止，还未发现CLIA的危 害性。有效期可长达1年以上，放射免疫分析由于放射 性同位素的衰变，一般有效期只有一个月，而酶联的底 物贮存性差，都无法与化学发光相比，有效期长可以提 高劳动效率，也利于推广应用。
浅刊物定性或定量分析。
• 化学发光免疫检测的灵敏度与可测范围 远远高于酶免产品，兼具ELISA法简便的 操作方法与较短的反应时间。
化学发光与酶免的对比表：
测量精度 人体伤害 有效期 干扰因素 测试项目
酶标
定性/半定量测量 底物有致癌性 较长 较多 少
化学发光
定量测量 无 长
极少 多
化学发光与放免的对比
．厂商试剂与仪器共同开发，试剂 基本系列化。
化学发光免疫 法（ＣＬＩＡ）
．导入于20世纪90年代，现个别较大 医院开展个别项目； ．产品处于导入期或成长期； ．无厂商开发生产，完全依赖进口
．兴起于20世纪80年代，现已被临床 普遍使用，成为临床免疫诊断的支 柱方法； ．产品处于成熟期；
．厂商试剂与仪器共同开发，仪器 自动化程度高，试剂系列化状态.
总结
• 综合以上优点，目前已有的各种免疫分析 尚没有出其右者，现在国外发达国家在 CLIA的研究和开发方面进展很快，已有全 自动的化学发光（闪光型和辉光型）与电 化学发光免疫分析等系列产品。我国在化 学发光免疫分析方面的研究还比较落后， 这就是我国急需研究和发展CLIA的原因。
时间分辨免疫荧光法和电化学发光法检测HBsAg的对比分析
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化学发光免疫分析法和时间分辨免疫荧光法定量检测不同浓度HBsAg的
结 果 两种 方法 的 直 线 回归 方 程 为 ： Ｙ ＝２ ． ３ ２ ３ Ｘ一８ ９ ６ ． ３ ， 相 关系数 ｒ ＝０ ． ９ ４ ３ ， Ｐ ％０ ． ０ ０ １ 。以 Ｃ ＭＩ Ａ 法 检 测 值 为 参 考， 分 为 ４组 进 行 分 析 ， 结 果 显 示 在 检 测 低 浓 度 ＨＢ ｓ Ａｇ样 本 时 ， ＴＲ Ｉ Ｆ Ａ 数值 较 Ｃ ＭＩ Ａ法偏 低 ， 而高 浓度 样本 以 Ｃ ＭＩ Ａ 法 检 测值 偏 高 。两 种 试 剂 在 检 测 不 同浓 度 的 ＨＢ ｓ Ａ ｇ均 有 较 好 的一 致 性 （ 均 Ｐ％ ０ ． ０ ５ ） ， 其 中以浓度 在１ ０ ０ １ ２ ０ ０ ０ ０ Ｉ ｕ／ ｍＬ 时相 关 性 最好 。结 论 两 种 试 剂 在 ＨＢ ｓ Ａｇ定 量 检 测 上 的准 确 性 基 本 相 当 ， 定 量 相 关 性 以检 测 值 在 １（ ） （ ） １ ～２ （ ） ０ ０ ０ Ｉ Ｕ／ ｍＩ 之 间 最 佳 。Ｔ Ｒ Ｉ Ｆ Ａ成本低廉 、 易操作 ， 更 适 于基 层 医 院 使 用 ， 具 有 广 泛 的应 用前 景 。 ［ 关 键 词 ］ 乙 型 肝 炎 表 面 抗 原 ；ＨＢ ｓ Ａｇ ； 肝炎病 毒 ， 乙 型 ；雅 培 全 自动 化 学 发 光 免 疫 分 析 法 ；时 间 分 辨 免 疫
测， 对 于 ＨＢ ｓ Ａｇ 滴 度 超 过 检 测 上 限 的样 本 ， 采用稀释液手动稀 释后 ， 再 进 行 定 量 分 析 。将 ＨＢ ｓ Ａ ｇ水 平 分 为 ４组 ：
≤１ ０ ０ Ｉ Ｕ／ ｍＩ １ ０ １ ～１ ０ ０ ０ Ｉ Ｕ／ ｍＩ １ ０ ０ １ ～２ （ ） ０ ０ ０ Ｉ Ｕ／ ｍＩ 、 ＞２ ０ ０ ０ ０ Ｉ Ｕ ／ ｍＩ ， 分析两 种方法 阳性标 本定量相 关性 。
时间分辨荧光免疫法和电化学发光法检测AFP的比较
时间分辨荧光免疫法和电化学发光法检测AFP的比较仝德胜;许国新;沈国强【期刊名称】《实验与检验医学》【年(卷),期】2010(028)001【摘要】目的对时间分辨荧光免疫分析法(TRFIA法)国产试剂盒与电化学发光免疫分析法(ECLIA法)检测血清AFP作比较分析,了解两种方法特点.方法分别采用国产TRFIA法试剂盒与ECLIA法检测正常人50例、肝癌患者40例血清AFP的含量:用高、中、低3种浓度AFP标准品采用两种方法进行批内测定,n=10,观察重复性,所得结果计算CV值;将高值标准品血清(250 ng/ml)按1:1比例加入每份正常对照组血清中,肝癌组病人血清与生理盐水按1:1稀释后再按1:1比例加入高值标准品血清(250ng/ml).每份检测2 次(TRFIA法)取平均值,计算回收率.结果肝癌组AFP值(TRFIA法:558±319.10ng/ml;ECLIA法:552.31±302.67g/ml)明显高于正常组(TRFAIA:6.51+5.42ng/ml;ECLIA法:6.32±5.14ng/m)(P<0.05),两种方法结果无显著差异(P>0.05).其相关系数为0.9150,测定结果呈正相关.高、中、低3种浓度标准品的重复性试验TRFIA法与ECLIA批内变异系数分别低于7.9%和3.1%,后者优于前者,两种方法略有不同.无明显差异(P>0.05).回收试验结果 ,TRFIA 法回收率在92.3%～103.9%.结论国产TRFIA法试剂盒和ECLIA法检测AFP相比较具有良好的相关性,灵敏度和稳定性也较好,可应用于临床血清AFP检测.【总页数】2页(P45-46)【作者】仝德胜;许国新;沈国强【作者单位】江苏省血吸虫病防治研究所,江苏无锡,214064;无锡市第四人民医院;无锡市滨湖医院【正文语种】中文【中图分类】R446.62;R735.7【相关文献】1.酶联免疫法与电化学发光法检测AFP肿瘤标志物结果的对比分析 [J], 韩晓燕2.时间分辨荧光免疫法定量检测AFP试剂盒临床应用研究 [J], 徐伟文;吴英松;杭建峰;王从容;周志聪;余伟鸿;裘宇容;李明3.酶联免疫法与电化学发光法检测AFP肿瘤标志物结果的对比分析 [J], 韩晓燕;4.电化学发光法与时间分辨荧光免疫法检测AFP的临床应用 [J], 邬登敏;陈启红;柳兵;曾同祥5.时间分辨荧光免疫法与电化学发光法检测结直肠肿瘤标志CEA的比较 [J], 张青云;孙丽;张书耕;王琼因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
直接化学发光标记物合成、时间分辨荧光免疫检测
发光平台转化情况 2018年左右搭建起吖啶 酯平台，已有直接发光
产品注册
两个平台同时进展
公司名称
发光模式
中生北控 博奥生物 豪迈生物 勤邦生物 四川沃文特生 物 武汉明德 湖南远璟生物 润达医疗 科华生物 迈瑞医疗 深圳雷杜 菲鹏生物 万孚生物 珠海丽珠 利德曼 北京热景 复星诊断
碱性磷酸酶 碱性磷酸酶 碱性磷酸酶 碱性磷酸酶
0.4IU/ml
2.1 IU/mL 3.97IU/ml
检测范围
0.1-1000IU/ml 0.5-1000IU/ml 1.661660.00IU/ml 2.1-2478 IU/mL /
灵敏度
/ / 2.42IU/L
检测范围
0.5-10000IU/L 0.1-190 IU/L 2.4-15000IU/L
• 吖啶酯标记工艺面临的挑战
1）吖啶酯分子疏水性强，标记和纯化过程易出现聚沉，影响蛋白理化性质和可重复性 2）NHS易水解 3）吖啶酯在碱性溶液易水解
Ab NH2
pH 7 or 9
8
二、吖啶酯平台标记物开发
• 吖啶衍生物
吖啶酯类
吖啶磺酰胺类
9
二、吖啶酯平台标记物开发
• 商业化吖啶衍生物
DAME-NHS
• 吖啶酯PEG亲水改造
Siemens, EP2074101B1, 2007. 14
三、异鲁米诺平台标记物开发
鲁米诺衍生物的发光性能 ABEI
ABEI
ANALYTICAL CHEMISTRY, VOL. 50, NO. 8, JULY 1978
15
三、异鲁米诺平台标记物开发
• ABEI的合成
Methods in Enzymology, VOL 57, 1978, 424-445
化学发光免疫技术与时间分辨技术的异同点
化学发光免疫技术与时间分辨技术的异同点概念化学发光免疫分析(chemiluminescence immunoassay,CLIA),是将具有高灵敏度的化学发光测定技术与高特异性的免疫反应相结合，用于各种抗原、半抗原、抗体、激素、酶、脂肪酸、维生素和药物等的检测分析技术。
是继放免分析、酶免分析、荧光免疫分析和时间分辨荧光免疫分析之后发展起来的一项最新免疫测定技术。
时间分辨荧光免疫测定（TRFIA）是以镧系元素标记抗原或抗体，并与时间分辨测定技术结合而建立起来的一种新型非放射性微量免疫分析技术，它根据镧系元素螯合物的发光特点，用时间分辨技术测量荧光，同时检测波长和时间两个参数进行信号分辨，可有效地排除非特异荧光的干扰，极大地提高了分析灵敏度。
原理化学发光免疫分析包含两个部分, 即免疫反应系统和化学发光分析系统。
化学发光分析系统是利用化学发光物质经催化剂的催化和氧化剂的氧化, 形成一个激发态的中间体, 当这种激发态中间体回到稳定的基态时, 同时发射出光子(hM) , 利用发光信号测量仪器测量光量子产额。
免疫反应系统是将发光物质(在反应剂激发下生成激发态中间体) 直接标记在抗原(化学发光免疫分析) 或抗体(免疫化学发光分析) 上, 或酶作用于发光底物。
鲁米诺(1umino1)、异鲁米诺(isolumino1)及其衍生物、吖啶酯(acIidinim?ester)衍生物、辣根过氧化物酶(horseradishperoxidase，HRP)和碱性磷酸酶(alkaline?phosphatase，ALP)是目前CLIA中使用最多的四类标记物。
时间分辨荧光免疫测定（TRFIA）基本原理用三价稀土离子及其鳌合剂作为示踪物，代替荧光物质、同位素或酶，标记蛋白质、激素、抗原、抗体、核酸探针等物质，当免疫反应体系发生后，根据稀土离子螯合物的荧光光谱的特点，用时间分辨荧光分析仪测定免疫反应最后产物中荧光强度。
根据荧光强度或相对荧光强度比值，来判断反应体系中分析物的浓度，达到定量分析之目的。
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化学发光免疫技术与时间分辨技术的异同点
概念
化学发光免疫分析(chemiluminescence immunoassay,CLIA),是将具有高灵敏度的化学发
光测定技术与高特异性的免疫反应相结合，用于各种抗原、半抗原、抗体、激素、酶、脂肪酸、维生素和药物等的检测分析技术。
是继放免分析、酶免分析、荧光免疫分析和时间分辨荧光免疫分析之后发展起来的一项最新免疫测定技术。
时间分辨荧光免疫测定（TRFIA）是以镧系元素标记抗原或抗体，并与时间分辨测定技术结合而建立起来的一种新型非放射性微量免疫分析技术，它根据镧系元素螯合物的发光特点，用时间分辨技术测量荧光，同时检测波长和时间两个参数进行信号分辨，可有效地排除非特异荧光的干扰，极大地提高了分析灵敏度。
原理
化学发光免疫分析包含两个部分, 即免疫反应系统和化学发光分析系统。
化学发光分析系统是利用化学发光物质经催化剂的催化和氧化剂的氧化, 形成一个激发态的中间体,
当这种激发态中间体回到稳定的基态时, 同时发射出光子(hM) , 利用发光信号测量仪器测
量光量子产额。
免疫反应系统是将发光物质(在反应剂激发下生成激发态中间体) 直接标记在抗原(化学发光免疫分析) 或抗体(免疫化学发光分析) 上, 或酶作用于发光底物。
鲁米诺(1umino1)、异鲁米诺(isolumino1)及其衍生物、吖啶酯(acIidinim ester)衍生物、辣根过氧化物酶(horseradishperoxidase，HRP)和碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)是目前CLIA中使用最多的四类标记物。
时间分辨荧光免疫测定（TRFIA）基本原理
用三价稀土离子及其鳌合剂作为示踪物，代替荧光物质、同位素或酶，标
记蛋白质、激素、抗原、抗体、核酸探针等物质，当免疫反应体系发生后，根据稀土离子螯合物的荧光光谱的特点，用时间分辨荧光分析仪测定免疫反应最后产物中荧光强度。
根据荧光强度或相对荧光强度比值，来判断反应体系中分析物的浓度，达到定量分析之目的。
应用
化学发光免疫分析技术（CLIA）
各种激素、病毒抗原抗体、肿瘤标志物、感染性疾病、心脏标志物、治疗药物检测等各种抗原、抗体和半抗原
时间分辨荧光免疫测定（TRFIA）应用广泛
1. 多肽类：蛋白质、激素（甲状腺激素、甾体类激素）。
2.病原体抗原/抗体
3.病毒性肝炎标志物
4.肿瘤相关抗原
5.药物
6.核酸
优缺点
优点
化学发光免疫分析法（CLIA）
➢单个样本检测速度快，适合做急诊；
➢灵敏度较高；
➢自动化程度高；
时间分辨荧光免疫技术（TRFIA）
➢发射光和激发光有较大的STOKES位移——高特异性
➢长寿命荧光，降低其他物质的荧光干扰——高灵敏度
➢半衰期长达几十万年，试剂受干扰小——高稳定性
➢荧光寿命长，易于自动化
➢重复性好
➢标准曲线范围宽
➢结果可靠
与其它技术的相对优势：
（1）、是现有的免疫检测方法中灵敏度最高的
（2）、是现有的免疫检测方法中稳定性最好的
（3）、多标记检测是目前所有免疫检测技术中独一无二的缺点
化学发光免疫分析法（CLIA）
➢发光过程短
➢本底较高
➢仪器故障率较高
➢试剂稳定性差
➢检测精度不高
试剂价格高
时间分辨荧光免疫测定（TRFIA）
➢测量方式复杂
➢仪器成本及维护费用高
➢环境及样品中同元素可导致本底干扰等
类型原理及试剂发光类型
化学发光免疫分析（CLIA）用化学发光物质直接标
记抗原或抗体组成
吖啶酯
（acrydinum esters）
时间分辨免疫荧光分析（TRFIA）*是用三价稀土离子及其
螯合剂作为示踪物
铕（Eu3+）、铽（Te3+）
及钐（Sm3+）、镝
（De3+）
化学发光与时间分辨荧光方法学比较
化学发光时间分辨荧光发光效率1%95%
化学发光免疫技术原理图
时间分辨免疫技术原理图
镧系元素的荧光光谱stokes位移示意图。