7 黑曲霉发酵柠檬酸
教案实验四 黑曲霉发酵生产柠檬酸
实验四黑曲霉发酵生产柠檬酸【目的要求】1. 掌握实验室菌种种子生产方法。
2. 掌握柠檬酸发酵原理及过程，掌握柠檬酸液体发酵及中间分析方法。
3. 熟悉并记录黑曲霉培养过程中培养基中基质的变化与产物的形成情况；4. 掌握钙盐法提取柠檬酸的原理与方法。
【基本原理】黑曲霉发酵生产柠檬酸实验中需要大量活化的孢子，其制备是采用麸皮培养基中保藏的黑曲霉孢子，在新的麸皮培养基上于适当的温度下活化并大量繁殖，从而产生大量活化孢子。
黑曲霉发酵法生产柠檬酸的代谢途径被认为是：黑曲霉生长繁殖时产生的淀粉酶、糖化酶首先将薯干粉或玉米粉中的淀粉转变为葡萄糖；葡萄糖经过酵解途径（EMP）转变为丙酮酸；丙酮酸氧化脱羧形成乙酰辅酶A，然后在柠檬合成酶的作用下生成柠檬酸。
黑曲霉在限制氮源和锰等金属离子条件下，同时在高浓度葡萄糖和充分供氧的条件下，TCA 循环中的酮戊二酸脱氢酶受阻遏，TCA 循环不能充分进行，使柠檬酸大量积累并排出菌体外。
其理论反应式为：C6H12O6+1.5O2→C6H8O7+2H2O除了含有大量柠檬酸外，还有大量的菌体，少量没有被黑曲霉利用的残糖、蛋白质、脂肪、胶体化合物以及无机盐类等。
柠檬酸提取就是从成分复杂的发酵液中分离提纯获得柠檬酸。
从柠檬酸发酵液中提取柠檬酸的方法主要有：钙盐-离子交换法、溶剂萃取法、“吸交”法、离子色谱法等。
目前国外生产主要采用钙盐-离子交换法和溶剂萃取法；国内生产主要采用钙盐-离子交换法，“吸交”法和离子色谱法正在推广中。
钙盐法首先采用过滤或超滤除去发酵液中的菌丝体等不溶残渣，然后在澄清过滤液中加入碳酸钙（或氢氧化钙）发生中和反应，生成难溶的柠檬酸钙沉淀，利用在80-90℃下柠檬酸钙的溶解度极低的特性，通过过滤（或离心）将它与可溶性的糖、蛋白、氨基酸、其它有机酸、无机离子等杂质分离开，用80-90℃热水反复洗涤柠檬酸钙，除去残糖和其他可溶性杂质，经过滤（或离心）获得较净的柠檬酸钙，然后在洗净的柠檬酸钙中缓慢地加入稀硫酸进行酸解反应，生成柠檬酸和硫酸钙沉淀，经过滤（或离心）除去硫酸钙沉淀，获得粗制的柠檬酸。
黑曲霉产柠檬酸最适发酵条件的探讨
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【 键词 】 黑 曲霉 关 柠檬酸 发 酵 条件 添 加 剂 ， ５０×１４个 ／ ｌ接 入 菌 种 ， 床 转 速 ３ ０ 按 ． ０ ｍ 摇 ０ ｒ／ｍ ｎ 温 度 ３ ℃ ｉ， ４ 培 养 ４ ｈ后 记 录产 酸情 况 。 ８
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黑曲霉生产柠檬酸的发酵工艺流程
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黑曲霉产柠檬酸工艺条件的优化解析
生物与化学工程学院专业实验报告题目黑曲霉产柠檬酸发酵工艺条件的优化学生姓名：王一专业班级：生物工程2012010302班学号：1201815076课程名称：发酵生产技术综合实验指导教师：李信义日期：2013.6.2--2013.6.29黑曲霉发酵产柠檬酸工艺条件的优化[摘要]：柠檬酸是生物体主要代谢产物之一，在自然界中分布很广，主要存在于柠檬、柑橘、菠萝、梅、李、梨、桃、无花果等果实中，尤以未成熟者含量居多。
柠檬酸又名枸橼酸,分子式为C6H8O7,物理性质：无色透明或半透明晶体，或粒状、微粒状粉末，有强烈酸味，稍有涩味；极易溶于水，溶解度随温度的升高而增大。
化学性质：从结构上讲柠檬酸是一种三羧酸类化合物，加热至175°C时它会分解产生二氧化碳和水，剩余一些白色晶体。
柠檬酸是一种较强的有机酸，有3个H+ 可以电离；加热可以分解成多种产物，与酸、碱、甘油等发生反应。
同时柠檬酸，是重要的工业原料。
可从植物原料中提取，也可由糖进行发酵制得。
本实验研究了不同接种量、温度、PH、发酵有效体积、溶解氧对黑曲霉产柠檬酸发酵的效率，已选出最适宜黑曲霉发酵产酸的条件。
[关键词]：黑曲霉柠檬酸发酵条件优化[Abstract]：Citric acid is one of the main metabolites of the organism, is widely distributed in nature, mainly in lemon, orange, pineapple, peach, pear, plum, fig fruit, especially in the most immature content. citric acid or citric acid. Molecular formula is 786O H C ,physical properties: colorless transparent or translucent crystal, or granular, granular powder, although have strong sour, slightly astringent. Easily soluble in water, the solubility increases with the increasing of temperature. Chemical properties: citric acid from the structure is a kind of three carboxylic acid compounds, heated to 175°C it will decompose to produce carbon dioxide and water, the remaining number of white crystal. Citric acid is a strong organic acid, 3 H ionization; heating can be decomposed into a variety of products, reacts with the acid, alkali, glycerin etc..At the same time, citric acid, is an important industrial raw materials. It can be extracted from plant materials, can also be prepared by sugar fermentation. The experimental study of different inoculation quantity, temperature, PH, dissolved oxygen, fermentation volume on the efficiency of citric acid fermentation of Aspergillus niter, has to choose the most suitable fermentation conditions of Aspergillus niter.[Keywords]：Aspergillus niter Citric acid Fermentation Conditions Optimization目录1.综述 (1)2.实验仪器药品材料及分析方法 (1)2.1实验设备 (1)2.2实验试剂及材料 (1)2.3菌株 (1)2.4分析方法 (1)3.实验设计 (2)3.1培养基的制备 (2)3.2斜面种子和液体种子的制备 (2)3.3温度对柠檬酸发酵的影响 (2)3.4溶解氧对柠檬酸发酵的影响 (2)3.5接种量对产柠檬酸发酵的影响 (2)3.6发酵液有效体积对产柠檬酸发酵的影响 (3)3.7初始PH值对产柠檬酸发酵的影响 (3)3.8柠檬酸的测定 (3)4.结果与分析 (3)4.1不同初始PH的柠檬酸产率 (3)4.2不同接种量的柠檬酸产率 (4)4.3不同温度的产柠檬酸率 (5)4.4不同发酵液有效体积的产柠檬酸率 (6)4.5不同溶氧的产柠檬酸率 (7)4.6正交实验及结果 (7)5.结论与展望 (8)5.1结论 (8)5.2展望 (8)6.参考文献 (8)7.感受 (9)1.综述柠檬酸（citric acid）又名枸橼酸。
实验七黑曲霉发酵柠檬酸
需要加强黑曲霉发酵柠檬酸的 应用研究，探索其在不同领域
的应用潜力。
感谢您的观看
THANKS
06
结论与展望
本实验的结论
黑曲霉发酵柠檬酸实验表明，在适宜的条件下， 黑曲霉能够有效地将葡萄糖转化为柠檬酸。
通过优化培养基成分和发酵条件，可以提高柠檬 酸的产量和产率。
本实验为黑曲霉发酵生产柠檬酸提供了理论依据 和技术支持，为工业化生产提供了参考。
黑曲霉发酵柠檬酸的应用前景
01
柠檬酸是一种重要的有机酸，广泛应用于食品、医药、化工等 领域。
柠檬酸的生物合成途径主 要涉及糖酵解、三羧酸循 环和柠檬酸循环三个过程。
丙酮酸在丙酮酸羧化酶的 作用下生成草酸，草酸进 一步被还原成柠檬酸。
ABCD
在糖酵解过程中，葡萄糖 被降解为丙酮酸，产生 ATP和NADH。
柠檬酸在三羧酸循环中被 氧化成二氧化碳和水，同 时释放能量供细胞代谢使 用。
影响柠檬酸发酵的因素
溶氧量控制
通过控制发酵罐内的搅拌速度和通气 量来调节溶氧量，以确保黑曲霉的正
常生长和代谢。
pH值监测与调节
定期监测发酵液的pH值，并适时添 加酸或碱来调节pH值至适宜范围。
泡沫控制
通过添加消泡剂或调节搅拌速度来控 制发酵过程中的泡沫。
柠檬酸的提取与测定
提取
发酵结束后，将柠檬酸菌泥与发酵液 分离，然后用有机溶剂将柠檬酸提取 出来。
01
02
03
营养物质
碳源、氮源、磷源等营养 物质的种类和浓度对柠檬 酸的产量有显著影响。
温度和pH值
适宜的温度和pH值可以提 高黑曲霉的发酵活性和柠 檬酸的产量。
溶氧浓度
溶氧浓度对柠檬酸的产量 也有影响，过高或过低的 溶氧浓度都不利于柠檬酸 的积累。
实验24-黑曲霉发酵生产柠檬酸
黑曲霉发酵生产柠檬酸柠檬酸（citric acid ）又名枸橼酸，学名2-羟基丙烷三羧酸（2-hydroxytricarboxylic acid ）、2--羟基丙烷-1，2，3-三羧酸（2-hydroxy propane-1，2，3-tricarboxylic acid ）。
商品柠檬酸有两种形式：一种为无色透明，有光泽的含一个结晶水的晶体，其分子式为C 6H 807·H 2O,相对分子质量为210.14。
另一种为无色半透明全对称晶体的无水柠檬酸，分子式为C 6H 8O 7，相对分子质量192.13。
柠檬酸因无毒、水溶性好、酸味适度、易被吸收和价格低廉等优点，被广泛应用于食品、医药、化工、化妆品、清洗（洗涤）、建筑等工业部门。
1893年前，人们主要从柑橘、菠萝和柠檬等果实中制取柠檬酸。
1893年后发现微生物可产生柠檬酸，1951年美国Miles 公司首先采用深层发酵法生产柠檬酸。
我国在20世纪40年代初期开始浅盘发酵生产柠檬酸，60年代开始采用薯干粉直接深层发酵法生产柠檬酸。
能够产生柠檬酸的微生物很多，青霉、毛霉、木霉、曲霉、葡萄孢菌及酵母中的一些菌株都能够利用淀粉质原料或烃类大量积累柠檬酸。
至今世界上消费的柠檬酸主要采用发酵法，而最具商业竞争优势的是采用黑曲霉（Asp.niger ）、文氏曲霉(Asp.Wentii )和解脂假丝酵母等菌种的深层液体发酵。
目前国内外普遍采用黑曲霉的糖质原料发酵生产柠檬酸。
本实验以薯干粉或玉米粉为原料，采用黑曲霉，通过深层液体（摇瓶）发酵产生柠檬酸。
柠檬酸发酵液经过滤除去菌丝体和残存杂质，过滤液中加入碳酸钙中和，生成柠檬酸钙沉淀。
将获得柠檬酸钙再用稀硫酸酸解生成柠檬酸和硫酸钙沉淀而制得粗制柠檬酸液，粗制柠檬酸液再经活性碳脱色、离子交换脱盐制得精制柠檬酸液。
精制柠檬酸液经真空浓缩、结晶制得符合英国药典BP-98版标准的无水或一水柠檬酸。
5.3.1 柠檬酸发酵 1、 实验目的了解柠檬酸发酵原理及过程，掌握柠檬酸深层液体发酵及发酵过程中生化指标的分析方法。
(完整word版)黑曲霉发酵柠檬酸
黑曲霉发酵生产柠檬酸（中北)生物技术18083108 陈园园摘要：黑曲霉,半知菌亚门，丝孢纲,丝孢目，丛梗孢科，曲霉属真菌中的一个常见种。
广泛分布于世界各地的粮食、植物性产品和土壤中，是重要的发酵工业菌种。
大多数曲霉菌如泡盛曲霉、米曲霉、温氏曲霉、绿色木霉和黑曲霉都具有产柠檬酸的能力,而黑曲霉的产酸能力更强。
黑曲霉从土壤中分离培养，土壤来源有要求。
黑曲霉和黑根霉菌种用于发酵产柠檬酸，了解产物发酵生产的机理，柠檬酸发酵的发酵条件，掌握发酵过程步骤,了解产物提取的几种方法,学习利用沉淀法提取柠檬酸的原理,掌握沉淀法提取柠檬酸的方法是本次实验的目的要求。
关键词：黑曲霉、黑根霉、柠檬酸实验材料和试剂:样品：新鲜土壤样品（来源于食堂垃圾堆处)培养基:查氏培养基、马铃薯培养基无菌水：带有玻璃珠装有20mL无菌水三角瓶试剂：400U/mL庆大霉素液、10％苯酚、酚酞指示剂、碳酸钙、0。
1M NaOH 、0.1M H2SO4实验器材:无菌培养皿、培养箱、无菌吸管、无菌离心管、电子天平、记号笔、玻璃涂棒、酒精灯、火柴、圆底烧瓶、抽滤瓶、玻璃棒、抽滤设备、冰箱实验步骤一．黑曲霉、黑根霉菌种的分离和培养1。
黑曲霉的分离培养①土壤样品的采集用取样铲，将表层5cm左右的浮土除去，取5～25cm处的土样10～25g，装入事先准备好灭菌容器内扎好。
编号并记录地点、土壤质地、植被名称、时间及其他环境条件。
一般样品取回后应马上分离，以免微生物死亡。
②制平板：在融化好的查氏培养基中加入链霉素0。
2mL/瓶制3块PDA培养基、3块查氏培养基平板。
③制备土壤稀释液：1。
称取土壤2g，放入18mL带有玻璃珠的无菌水三角瓶中，同时加入3滴10％苯酚溶液，振荡5min，即为稀释10－1的土壤悬液。
2。
另取无菌离心管2支,用记号笔编上10－2、10－3、10－4，再加入0.9mL无菌水.取10－1的土壤稀释液，吸取0。
1mL加入第一只离心管中,并在试管内轻轻吹吸数次，使之充分混匀，即成10－2土壤稀释液。
一种提高黑曲霉发酵生产柠檬酸产量的方法
一种提高黑曲霉发酵生产柠檬酸产量的方法在工业生产中，柠檬酸是一种重要的有机酸，广泛应用于食品、医药、化工等领域。
而黑曲霉是目前最主要的柠檬酸生产微生物，因其高效、高产等优点而备受青睐。
然而，对于黑曲霉发酵生产柠檬酸的方法，如何提高其产量一直是一个备受关注的问题。
本文将从深度和广度的角度，探讨一种提高黑曲霉发酵生产柠檬酸产量的方法。
一、原理解析在进行黑曲霉发酵生产柠檬酸时，关键的生产环节是发酵过程。
而要提高柠檬酸的产量，需要从以下几个方面进行优化：发酵菌株的选取、培养基的配方、发酵条件的控制等。
1. 发酵菌株的选取在选择发酵菌株时，需要考虑其对柠檬酸产量的影响。
一般来说，通过筛选高产菌株，可以有效提高柠檬酸的产量。
选择某些高柠檬酸产量的黑曲霉菌株，能够在一定程度上提高发酵产酸量。
2. 培养基的配方培养基的配方是影响柠檬酸产量的重要因素之一。
通过优化培养基的氮源、碳源、矿物盐等成分比例，可以为黑曲霉提供更适宜的生长环境，从而增加柠檬酸的产量。
添加适量的葡萄糖、氨基酸等营养物质，可以刺激黑曲霉的生长，提高柠檬酸的产量。
3. 发酵条件的控制发酵过程中的温度、pH值、氧气供应等条件的控制对柠檬酸产量也有着重要的影响。
合理的温度和pH值可以促进黑曲霉的生长和柠檬酸的产生，而充足的氧气供应则能提高发酵效率，进而增加柠檬酸的产量。
二、实践应用上述原理虽然看似简单，但在实际应用中却需要综合考虑各个因素，并进行合理的优化。
在进行黑曲霉发酵生产柠檬酸时，可以通过以下方法来提高产量：1. 优化菌株选取首先需要对已有的黑曲霉菌株进行筛选，选择出高产柠檬酸的菌株。
这需要借助研究机构或者实验室的支持，通过采用分子生物学技术等手段进行筛选和改良。
2. 调整培养基配方针对不同菌株、不同生产条件，可以优化培养基的配方，以满足黑曲霉生长和柠檬酸产量的需求。
在生产实践中，可以根据具体情况进行调整，以获得最佳效果。
3. 控制发酵条件在实际生产过程中，通过精确控制发酵过程中的温度、pH值和氧气供应，可以更好地满足黑曲霉生长和柠檬酸产量的需求。
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实验目的
了解产物发酵生产的机理； 了解产物发酵生产的机理； 柠檬酸发酵的发酵条件 掌握发酵过程步骤
实验原理
柠檬酸的发酵
80%的糖代谢走EMP途径
生产菌中存在TCA的酶系
草酰乙酸的来源不是由TCA 供应，而是由2个CO2固定 提供，故C0mL三角瓶） 每组2瓶，其中一瓶放置数颗玻璃珠 其他灭菌物品 （每组1套） 小包装1.5mL离心管、蓝色黄色枪头若干， 培 养皿每组1包（每包不少于6个）
问题与思考 影响黑曲霉发酵生产柠檬酸的因 素有哪些？ 素有哪些？ 试设计分离筛选酵母菌发酵生产 酒精实验并阐述酒精产生机理
实验步骤
菌种获得（纯种） 种子液制备 无菌操作，取5mL无菌水至黑曲霉平板上， 用接种环轻轻刮下孢子，用枪吹吸数下制 成孢子悬液。 液体深层发酵 无菌操作，取3mL孢子悬液接种于玉米粉摇 瓶发酵培养基中。在转速为200rpm旋转摇 床上，30℃培养5～6天。
后续实验准备 黑根霉的分离培养 制作马铃薯培养基平板2块 单号组用接种环无菌操作，从酒酿样品中挑取 1环，在1块马铃薯培养基平板上进行划线分离。 双号组取安琪菌剂0.1g加入10mL带玻珠的无 菌水三角瓶进行稀释溶解，取稀释液0.1mL， 在1块马铃薯培养基平板上进行均匀涂布。 另外一块平板置于冷藏柜备用。 将划好的培养基平板置于517房间30℃培养箱 内正置培养3天，至周一进行结果观察和转接。
柠檬酸发酵的条件： 柠檬酸发酵的条件：
1、合适的碳源（淀粉、麦芽糖、甘露糖 等），高浓度的糖； 2、限制有机氮源、选择适量的无机氮源 （铵盐）； 3、合适的pH值； 4、发酵液中溶氧量要高（摇床的转速 250r/m）； 5、限制重金属离子如Mn2＋、Fe2＋、Zn2＋含 量。
工业化发酵生产示意图
柠檬酸合成的代谢调节
1、由于锰离子的缺乏，抑制了蛋白 质的合成，而导致细胞内的NH4+ 浓 度升高，促进了EMP途径的畅通。 2、由组成型的丙酮酸羧化酶源源不 断提供草酰乙酸。 3、在控制Fe2+含量的情况下，顺乌 头酸酶活性低，从而使柠檬酸积累。 4、丙酮酸氧化脱羧生成乙酰辅酶Ａ 和丙酮酸固定CO２反应相平衡，以及 柠檬酸合成酶不被抑制，增强了合成 柠檬酸的能力。 5、柠檬酸积累增加，pH降低，在低 pH条件下，顺乌头酸水合酶和异柠 檬酸脱氢酶失活，从而进一步促进了 柠檬酸自身的积累。