DNA克隆技术
基因克隆(包括DNA提取技术步骤)
基因克隆DNA克隆是指在体外将目的基因或DNA片段同能够自我复制的载体DNA 连接，然后将其转入宿主细胞或受体生物进行表达或进一步研究的分子操作的过程，又称为重组DNA技术。
DNA克隆涉及一系列的分子生物学技术，如目的DNA片段的获得、载体的选择、各种工具酶的选用、体外重组、导入宿主细胞技术和重组子筛选技术等。
一 DNA的提取二目的DNA片段的获得（酶切）三体外重组1 LB培养基的配制2大肠杆菌感受态细胞的制备3载体的选择四导入受体细胞五重组子的筛选1插入失活法实验一DNA提取取0.5克以下的鱼类组织或20ul血液：1 准备1.5ml离心管，加入500ul裂解液，取组织放入离心管，破碎。
（常温操作）2 恒温箱裂解，55℃。
30min。
3 加等体积Tris饱和酚(酚：氯仿：异戊醇25：24：1)，先颠倒混匀后静置抽提10分钟，离心4度12000g 10分钟。
（注意酚在油层下面）4 取上清（把枪头去掉部分，注意液面。
蛋白质凝胶停留在水相及氯仿相中间，而DNA位于上层水相中），加入等体积CI(氯仿：异戊醇24：1)，先颠倒混匀后静置抽提10分钟，离心4度12000g 10分钟。
5 汇集上清，加2倍无水乙醇(-30度保存)，颠倒混匀可观察到絮状DNA。
在-30度冰箱沉淀30min。
离心4度12000g 10分钟。
6 弃去上清，75%乙醇洗涤，7500g离心5分钟。
7 重复一次上述操作。
7 在无菌台干燥半小时，乙醇挥发。
8 溶解于200ulddwater。
9 定量DNA。
裂解液的配制1ml体系200ul 0.5M EDTA（PH=8.0高压灭菌。
作用抑制酶的活性。
）螯合DNA酶发挥作用需要的金属离子。
50ul 10%SDS（蛋白质变性剂）10ul 1MTris-cl（PH=8.0高压灭菌）缓冲溶液5ul PK（消化）735ul 灭菌超纯水EDTA（0.5 M，pH8.0）将186.1 g 二水乙二胺四乙酸二钠（EDTA-Na.2H2O）加入800ml水中，在磁力搅拌器上剧烈搅拌。
DNA分子克隆技术(也称基因克隆技术)
DNA分子克隆技术（也称基因克隆技术）：在体外将DNA分子片段与载体DNA片段连接，转入细胞获得大量拷贝的过程中DNA分子克隆(或基因克隆)。
其基本步骤包括：制备目的基因→将目的基因与载体用限制性内切酶切割和连接，制成DNA重组→导入宿主细胞→筛选、鉴定→扩增和表达。
载体（vecors）在细胞内自我复制，并带动重组的分子片段共同增殖，从而产生大量的DNA分子片段。
主要目的是获得某一基因或NDA片段的大量拷贝，有了这些与亲本分子完全相同的分子克隆，就可以深入分析基因的结构与功能，随着引入的DNA片段不同，有两种DNA库，一种是基因组文库（genomic library）,另一种是cDNA库。
载体所谓载体是指携带靶DNA片段进入宿主细胞进行扩增和表达的工具。
细菌质粒是一种细菌染色体外小型双链环状结构的DNA，分子大小为1-20kb，对细菌的某些代谢活动和抗药性表型具有一定的作用。
质粒载体是在天然质粒的基础上人工改造拼接而成。
最常用的质粒是pBR322。
基因库的建造含有某种生物体全部基历的随机片段的重组DNA克隆群体，其含有感光趣的基因片段的重组子，可以通过标记探针与基因库中的重组子杂交等方法而筛选出来，所得到的克隆经过纯化和扩增，可用于进一步的研。
其主步骤包括：（1）构建基因库迅速的载体；(2)DNA片段的制备；（3）DNA片段与载体DNA 的连接；（4）包装和接种。
cDNA库的建造是指克隆的DNA片段，是由逆转录酶自mRNA制备的cDNA。
cDNA库包括某特定细胞的全部cDNA克隆的文库，不含内含子。
特异基因的筛选常用的方法有：（1）克隆筛选即探针筛选法；（2）抗体检测法，检测其分泌蛋白质来筛选目的基因；（3）放射免疫筛选法，查出分泌特异抗原的基因；（4）免疫沉淀法，进行特异基因的筛选。
核酸序列测定DNA的碱基序列决定着基因的特性，DNA序列分析（测序，sequencing）是分子生物学重要的基本技术。
基因克隆技术的基本步骤
基因克隆技术的基本步骤随着科技的不断发展，基因克隆技术越来越成为生命科学研究的重要手段。
在生命科学、医学等领域，基因克隆技术的应用十分广泛。
本文将介绍基因克隆技术的基本步骤。
一、选择载体DNA在基因克隆中，载体DNA是将外源DNA（待克隆DNA）转化进细胞的基础。
目前主要的载体DNA是质粒，其一般大小在1至20 kb之间。
质粒的选择应遵循以下几个原则：1. 合适的选体标识。
大多数载体都有一些明显的特征，例如特定的抗生素抗性或颜色，因此选择能够用于筛选的选体标识是基本原则之一。
2. 合适的克隆位点。
载体DNA上应具有克隆位点，以便将待克隆DNA插入到其中。
3. 可重复复制。
质粒必须带有在细胞内自我复制所必需的序列。
二、切割DNA通过限制性内切酶切割将待克隆DNA和载体DNA裂解成短的DNA片段。
这些片段在电泳时可以按照大小区分开，以便以后的克隆工作。
三、将外源DNA插入载体DNA外源DNA和载体DNA的连接需要使用DNA连接酶，如DNA ligase。
方法是将两个DNA片段的末端和连接起来形成一个完整的DNA分子。
连接成功后，形成了一个混合DNA。
由于载体的复制和传递，待克隆DNA也可以被大量复制。
四、将混合DNA转化进宿主细胞将混合DNA转化进宿主细胞是整个克隆过程中至关重要的一步，因为宿主细胞受到质粒的干扰，催化质粒遗传信息的传递与表达。
大多数质粒都需要在易感受性细胞中才能存在并复制。
宿主细胞的选择是非常重要的，有些宿主细胞对外源DNA的吸收和扩增效率非常高，充分利用每一个获得的外源DNA分子。
五、筛选克隆基因最后一步是克隆基因的筛选，筛选克隆基因需要具有合适的筛选方法。
常用的筛选方法是使用抗生素抗性，因为载体上通常带有抗生素基因，能够筛选那些携带载体克隆块的细胞。
克隆基因的筛选方法不止于抗生素抗性，还可以根据不同的克隆目标进行选择。
例如，当克隆目标是蛋白质时，可以使用融合蛋白法克隆兴趣的编码DNA，并利用其蛋白质结构的特点分离出融合蛋白。
植物分子生物学利用分子生物学技术手段研究植物分子遗传学和基因组学的学科
植物分子生物学利用分子生物学技术手段研究植物分子遗传学和基因组学的学科植物分子生物学是一门综合多学科的研究领域，通过应用分子生物学技术手段来探索植物的分子遗传学和基因组学。
该学科涉及了许多关键概念和方法，包括DNA克隆、基因表达调控、基因组学、转基因技术以及分子标记等。
通过这些手段的应用，植物分子生物学研究可以进一步深化对植物基因功能、调控网络和进化等方面的理解，推动改良和创新植物育种，以应对全球食品安全和环境挑战。
一、DNA克隆DNA克隆是植物分子生物学研究的核心技术之一。
它是将感兴趣的DNA片段从一个来源复制并插入到宿主植物细胞中的过程。
常用的DNA克隆技术包括限制性内切酶切割、DNA连接、转化和筛选等步骤。
通过DNA克隆，研究人员可以获取大量特定DNA片段以及有关植物基因的信息。
二、基因表达调控基因表达调控是植物分子生物学研究中的另一个重要方面。
植物基因表达调控的过程涉及多种调控因子和信号通路。
植物中的基因表达不仅仅依赖于基因本身的序列，还受到一系列转录因子、启动子和增强子的作用。
通过分析基因在植物不同组织和环境条件下的表达模式，研究人员可以深入了解基因调控网络的运作机制。
三、基因组学基因组学是植物分子生物学研究的重要分支，它研究植物的基因组结构和功能。
随着高通量测序技术的发展，植物基因组的测序速度和精确度大幅提高。
通过对植物基因组的比较和分析，研究人员可以揭示不同物种间的遗传变异，以及基因组在进化过程中的改变。
同时，基因组学也为植物育种和遗传改良提供了重要的理论支持。
四、转基因技术转基因技术是植物分子生物学研究的重要手段之一。
它通过引入外源基因或抑制内源基因的表达，改变植物的遗传特性。
转基因技术在植物育种中起到了重要的作用，例如提高作物的抗虫性、耐逆性和产量等。
然而，转基因技术也面临伦理和环境安全等问题，需要权衡利弊进行应用。
五、分子标记分子标记是植物分子生物学研究中常用的工具。
它是一种与植物基因或DNA序列有关的分子标记，可以用来鉴定特定基因型或进行基因组遗传分析。
cdna基因克隆的基本原理和流程
一、CDNA基因克隆的基本原理CDNAplementary DNA）是DNA的互补序列，通过反转录酶将mRNA作为模板合成的一种DNA。
CDNA基因克隆是利用逆转录酶将mRNA逆转录合成cDNA，并通过PCR或其他方法将cDNA插入到质粒载体中，实现对目标基因的克隆。
二、CDNA基因克隆的流程1. RNA提取：首先需要从细胞中提取出总RNA，可以使用TRIzol等试剂进行RNA的提取纯化工作。
2. 反转录合成cDNA：将提取得到的RNA作为模版，利用逆转录酶进行cDNA的合成。
反转录反应通常包括RNA模版、随机引物、dNTPs、逆转录酶和缓冲液，并经过一系列温度循环反应，将mRNA 逆转录成cDNA。
3. cDNA纯化：为了避免反转录反应中产生的非特异性产物和杂质，需要对反转录反应产物进行纯化。
4. cDNA扩增：对cDNA进行PCR扩增，以获得目标基因的cDNA 片段。
PCR反应体系包括cDNA模板、引物、dNTPs、Taq聚合酶和缓冲液，通过一系列温度循环反应，扩增目标基因cDNA片段。
5. 酶切与连接：将PCR扩增得到的cDNA片段与质粒载体进行酶切，并在两者的黏端上连接。
6. 转化：将连接得到的质粒转化入大肠杆菌等细菌中，使其进行复制。
7. 筛选与鉴定：通过筛选和鉴定，选出携带目标基因cDNA片段的质粒，进行测序和分析，最终确定目标基因序列。
三、CDNA基因克隆的应用CDNA基因克隆技术已广泛应用于基因克隆、基因表达等多个领域。
在科研领域中，通过CDNA基因克隆技术可以方便快捷地获得目标基因的cDNA，实现对目标基因的研究和功能分析；在医药领域，CDNA基因克隆技术也被应用于基因治疗、蛋白表达等方面。
总结：CDNA基因克隆是一种重要的基因工程技术，通过反转录酶合成cDNA并将其插入到质粒中，可以方便地获取目标基因序列，具有广泛的应用前景。
掌握CDNA基因克隆的基本原理和流程对于开展相关实验研究具有重要意义。
dna克隆名词解释
dna克隆名词解释DNA克隆是一种生物技术，指的是通过复制和操纵DNA分子，在体外产生相同的DNA分子。
它是基因工程中最基础和重要的技术之一，广泛应用于生物学、医学和农业等领域。
DNA克隆能够帮助科学家们理解DNA的结构和功能，也为疾病的诊断和治疗提供了新的方法。
通过DNA克隆，科学家们可以获取和复制特定的DNA片段，然后将其插入到合适的目标细胞中，使目标细胞具备引入DNA片段所编码的新的特性或功能。
在这个过程中，需要包括DNA提取、切割、连接、转化等多个步骤。
首先，科学家们需要从生物体中提取DNA。
DNA可以来源于细菌、植物、动物等, 例如, 从细菌体中提取的DNA经过PCR扩增后可以得到大量的DNA。
提取的DNA会通过酶切等方法进行切割，切割产生的DNA片段通常会有不同的引物，以便后续连接。
接下来，科学家们需要将DNA片段连接到适当的载体上。
载体是DNA的携带者，通常为圆环状的DNA分子，称为质粒。
质粒可以自主复制，被细胞所识别并复制。
科学家们需要将切割后的DNA片段与质粒通过酶切片段轻松地进行连接，以获得重组DNA分子。
然后，科学家们将重组的DNA分子引入宿主细胞中，这一过程称为转化。
转化可以利用热激或电激等方式进行，以使细胞吸收DNA分子并合成新的蛋白质。
一旦DNA分子成功转化进入细胞，细胞就能够利用这些新获得的基因进行蛋白质合成。
最后，科学家们将细胞培养并分离出含有重组DNA的细胞，这些细胞称为克隆细胞。
克隆细胞在培养和扩增过程中可以形成一定数量的细胞群落。
科学家们可以从这些克隆细胞中提取出DNA，进一步研究其结构和功能。
DNA克隆在生物学研究和应用中具有广泛的意义。
它可以帮助科学家们研究基因组结构和功能，探索人类和其他物种的遗传变异。
此外，DNA克隆也在医学上扮演着重要角色，例如基因治疗、疫苗生产和药物开发等方面。
在农业领域，DNA克隆也被用于改良作物和畜禽的基因，提高产量和抗性。
总之，DNA克隆是一种重要的生物技术，通过复制和操纵DNA分子，能够获取特定的DNA片段并将其插入到目标细胞中。
DNA分子克隆技术(也称基因克隆技术)
DNA分子克隆技术（也称基因克隆技术）：在体外将DNA分子片段与载体DNA片段连接，转入细胞获得大量拷贝的过程中DNA分子克隆(或基因克隆)。
其基本步骤包括：制备目的基因→将目的基因与载体用限制性内切酶切割和连接，制成DNA重组→导入宿主细胞→筛选、鉴定→扩增和表达。
载体（vecors）在细胞内自我复制，并带动重组的分子片段共同增殖，从而产生大量的DNA分子片段。
主要目的是获得某一基因或NDA片段的大量拷贝，有了这些与亲本分子完全相同的分子克隆，就可以深入分析基因的结构与功能，随着引入的DNA片段不同，有两种DNA库，一种是基因组文库（genomic library）,另一种是cDNA库。
载体所谓载体是指携带靶DNA片段进入宿主细胞进行扩增和表达的工具。
细菌质粒是一种细菌染色体外小型双链环状结构的DNA，分子大小为1-20kb，对细菌的某些代谢活动和抗药性表型具有一定的作用。
质粒载体是在天然质粒的基础上人工改造拼接而成。
最常用的质粒是pBR322。
基因库的建造含有某种生物体全部基历的随机片段的重组DNA克隆群体，其含有感光趣的基因片段的重组子，可以通过标记探针与基因库中的重组子杂交等方法而筛选出来，所得到的克隆经过纯化和扩增，可用于进一步的研。
其主步骤包括：（1）构建基因库迅速的载体；(2)DNA片段的制备；（3）DNA片段与载体DNA 的连接；（4）包装和接种。
cDNA库的建造是指克隆的DNA片段，是由逆转录酶自mRNA制备的cDNA。
cDNA库包括某特定细胞的全部cDNA克隆的文库，不含内含子。
特异基因的筛选常用的方法有：（1）克隆筛选即探针筛选法；（2）抗体检测法，检测其分泌蛋白质来筛选目的基因；（3）放射免疫筛选法，查出分泌特异抗原的基因；（4）免疫沉淀法，进行特异基因的筛选。
核酸序列测定DNA的碱基序列决定着基因的特性，DNA序列分析（测序，sequencing）是分子生物学重要的基本技术。
重组DNA-分子克隆技术
重组DNA技术 Recombinant DNA Techniques
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主要内容
CONTENTS
基本知识
实验流程
实验操作
01
相关问题
02
03
04
克隆与克隆化
01
克隆：指同一副本或拷贝的集合
02
克隆化：获取同一拷贝的过程称为克隆化。
03
分子克隆：为某一研究目的，从众多不同的分子群体中分离的某一感兴趣分子，继而经无性繁殖（扩增）产生的很多相同分子的集合。
粘端连接
CCGG CCGG
GGCC GGCC
CGG C
C GGC
CGG C
C GGC
08
上幸存并形成菌落。
09
标志补救：若克隆的基因能够在宿主菌
01
表达，且表达产物与宿主菌的营养缺陷
02
互补，那么就可以利用营养突变菌株进
03
行筛选，这就是标志补救筛选。
04
01
挑取单菌落，于液体培养基中培养；
03
对质粒进行限制性内切酶酶切；
05
根据酶切产物的大小，鉴定阳性克隆。
02
收集菌体，提取纯化质粒；
在有模板DNA、引物及dNTP存在时，向
DNA合成体系中引入热稳定的Taq DNA聚
合酶。反应体系经变性、退火及扩增循环
自动。反复进行感兴趣DNA片段的酶促合
成，使目的基因按指数增长。
变性、退火、延伸三步曲
变性：双链DNA解链成为单链DNA
退火：部分引物与模板的单链DNA的特定互
补部位相配对和结合
04
琼脂糖凝胶电泳检测；
酶切和电泳
挑取平板上生长的单菌落直接进行PCR；
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Am
lacZ
N2H
COOH
片段
片段
目录
Lac Z
X-gal 蓝色化合物
X-gal
目录
α 互 补 的 检 测
目录
（LacZ基因 N端序列） LacZ基因 C端序列
插入片段 （LacZ基因失活）
LacZ酶
目录
（二）酶切鉴定
DNA Marker
加 样 孔
空质粒 重组质粒
重组质粒酶切 重组质粒的PCR 扩增片段
大肠杆菌（ E.coli）受体细胞
目录
1 E.coli表达体系
优势：
一种成熟的基因克隆表达的受体细胞 繁殖迅速，培养代谢易于控制
易于进行遗传操作和高效表达
目录
不足之处：
1）缺乏适当的转录后和翻译后加工机制。
2）缺乏表达蛋白质复性系统，表达蛋白无特 异性空间结构。 3）表达产物不稳定，易被细菌蛋白酶降解。
凝胶电泳检测
目录
（三） DNA序列检测
A C T G A A G G C T
目录
（四） 菌落杂交筛选法
原位杂交
目录
（五）免疫化学检测法
滤膜（固定抗体）
+
放射性抗体检测法
目录
分
目的基因 基因载体
切
接
重组体
总 体 技 术 路 线
转
筛
表
目录
表
外源基因在宿主细胞中的表达
重组子 目的基因 的mRNA 表达蛋白质
催化多聚核苷酸5´羟基末端磷酸化，或标记探针
在3´羟基末端进行同质多聚物加尾 切除末端磷酸基
目录
（一）限制性核酸内切酶
1 核酸酶的分类
2 限制性核酸内切酶(restriction endonuclease,
RE)是识别DNA的特异序列, 并在识别位点或其周 围切割双链DNA的一类内切酶。
Bam HⅠ
pUC系列
目录
（3）病毒载体 （4）粘性质粒
目录
2 载体的条件
有扩增所需的复制起始点，即能自主复制； 有多克隆位点（外源DNA插入点），常具有 多个单一酶切位点； 具有两个以上的遗传标记物，便于重组体的 筛选和鉴定； 表达型载体必须具有指导基因表达的调控元 件。
目录
多克隆位点
polylinker
的或人工的DNA）与载体DNA接合成一具有自我
复制能力的DNA分子——复制子(replicon)，继而 通过转化或转染宿主细胞，筛选出含有目的基因 的转化子细胞，再进行扩增提取获得大量同一 DNA 分 子 ， 也 称 基 因 克 隆 或 重 组 DNA (recombinant DNA) 。
目录
生物技术工程: 基因工程、蛋白质工程、 酶工程、细胞工程等
目录
分
三 目的基因及载体的分离
（一）目的基因的获取
直接从染色体DNAR 直接索取
目录
（二） 基因载体
定义 能携带目的基因进入宿主细胞并且在 宿主细胞中进行扩增和表达的一类DNA分 子。 1 载体的种类
质粒DNA
噬菌体DNA
①
能
Klenow片段
又名DNA聚合酶I大片段，具有完整DNA聚合酶I的53 聚合、35外切活性，而无53外切活性。常用于 cDNA第二链合成，双链DNA 3末端标记等 合成cDNA ② 替代DNA聚合酶I进行填补，标记或DNA序列分析
①
反转录酶
多聚核苷酸激酶
末端转移酶 碱性磷酸酶
细菌人工染色体 (bacterial artificial chromosome, BAC) 动物病毒DNA改造的载体 （如腺病毒，腺病毒相关病毒，逆转录病毒）
目录
切四 限制性内切酶剪切目的基因与载体
酶切
目录
同 一 限 制 酶 切 位 点 连 接
GGATCC CCTAGG G CCTAG 目的基因用 Bam HⅠ切割
Bam HⅠ
GTCGAC CAGCTG
GGATCC CCTAGG
GTC GAC CAG + CTG
G + GATCC G CCTAG
平端切口
粘端切口
目录
（二）大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ （三）T4噬菌体DNA聚合酶 （四）TaqDNA聚合酶 （五）反转录酶 （六）连接酶 （七）末端（脱氧核苷酸）转移酶 （八）碱性磷酸酶
目录
连接方式
相同粘性末端的连接 平头末端的连接 不同粘性末端的连接 人工粘性末端的连接
目录
CCGG GGCC
CCGG GGCC
CGG C
C GGC
CCGG GGCC
HapⅡ
T4-DNA 连接酶
CGG C C GGC
粘端连接
目录
AGCT TCGA
AGCT TCGA
AGCT TCGA
AluⅠ
DNA连接酶
目录
2目的基因在E.coli中的高效表达 三个因素：
强化蛋白质的生物合成
抑制蛋白质的降解 恢复蛋白质的空间构象
目录
3目的基因表达产物的检测
1）蛋白质的PAGE
对照 样品 Marker
目录
2）表达蛋白生物学功能检测
淀粉酶基因表达
目录
3目的蛋白的分离纯化
分子筛
亲和柱
离子交换
抗原抗体
目的蛋白
目录
DNA克隆
颗粒细胞-巨噬细胞集落剌激因子
促红细胞生成素 生长因子(bFGF, EGF) 生长素 胰岛素 干扰素( 1b, 2a, 2b, ) 白细胞介素 超氧化物歧化酶
剌激白细胞生成
剌激白细胞生成 刺激细胞生长与分化 治疗侏儒症 治疗糖尿病 抗病毒感染及某些肿瘤 激活、剌激各类白细胞 抗组织损伤 利用其结合特异性进行诊断试验、肿 瘤导向治疗 预防乙肝 预防霍乱
DNA克隆技术
许丽辉
目录
一、概述
（一）基本概念 1 克隆(clone) 来自同一始祖的相同副本或拷贝的集合。 获取同一拷贝的过程称为克隆化(cloning)， 即无性繁殖。 2 动物克隆 3 杂交
目录
克隆羊：
个体水平
细胞克隆：
DNA克隆：
细胞水平
分子水平
目录
Ａ母绵羊
Ｂ母绵羊 细胞拆合技术 乳腺细胞
重组体转 入细菌
CaCl2处理
目录
Am
JM109感受态
重组 质粒
感受态
含氨苄平板
目录
转化后的克隆群体：
目录
筛 七、重组体克隆的筛选与鉴定
连接
目的基因
转化
基因载体
连接酶
宿主细胞
含氨苄平板
目录
（一）初筛：遗传检测法
1）抗药性标志的选择
Amp Tet 插入片段
pBR322
Tet平板
Amp平板
目录
2）标志补救（ß-半乳糖苷酶法）
病毒DNA
目录
（1）质粒 (plasmid)
特点 能在宿主细胞内独立自主复制；带有某 些遗传信息, 会赋予宿主细胞一些遗传性状。
目录
（2）噬菌体(phage)
λ噬菌体DNA改造系统
λgt系列（插入型，适用cDNA克隆）
EMBL系列（置换型，适用基因组克隆） M13噬菌体DNA改造系统（含lacZ基因） M13mp系列
平端连接
目录
目的基因
载体
限制性内切酶 限制性内切酶
T4 DNA连接酶 15º C
重组体
载体自连
目的基因 自连
目录
转
六、重组体的转化
受体细胞
目录
转化方法
CaCl2诱导转化 电穿孔 PEG介导转化 人工体外包装
受体细胞
特殊处理
细胞膜特性 改变
目录
50-100mmol/L CaCl2
受体细菌
感受态 细菌
不同限制酶切位点（非配伍末端）的连接
Eco RⅠ切割位点
GAATTC CTTAAG
Bg lⅡ切割位点
AGATCT TCTAGA
GAATTC CTTAAG AGATCT TCTAGA
EcoRⅠ+ Bg lⅡ 双酶切
AATTC G A TCTAG
AATTC G GATCT A
Eco RⅠ+ Bg lⅡ 双酶切
卵细胞
细胞质 细胞核移植
细胞核 融合后的卵细胞 卵裂
早期胚胎
胚胎移植
C母绵羊子宫 妊娠 分娩 多莉羊
目录
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
连接形成重组DNA 分子。
质粒DNA
4 重组：不同的DNA分子间发生共价
基因片段
重组DNA
目录
目录
5 DNA克隆
应用酶学的方法，在体外将各种来源的遗传
物质（同源的或异源的、原核的或真核的、天然
目录
克隆载体(cloning vector)
为使插入的外源 DNA序列被扩增而特意 设计的载体称为克隆载体。 表达载体(expression vector) 为使插入的外源 DNA序列可转录翻译成 多肽链而特意设计的载体称为表达载体。
目录
其他载体
酵母人工染色体 (yeast artificial chromosome, YAC)
目录
单克隆抗体
乙肝疫苗(CHO, 酵母) 口服重组B亚单位菌体霍乱菌苗
（三）重组DNA技术技术路线
目的基因的获取 克隆载体的选择和构建 DNA导入受体菌
外源基因与载体的连接
重组体的筛选
克隆基因的表达
目录
二、重组DNA技术中常用的工具酶
工具酶 限制性核酸内切酶 DNA连接酶 DNA聚合酶Ⅰ 功 识别特异序列，切割DNA 催化DNA中相邻的5´磷酸基和3´羟基末端之间形成磷酸 二酯键，使DNA切口封合或使两个DNA分子或片段连接 合成双链cDNA分子或片段连接 ② 缺口平移制作高比活探针 ③ DNA序列分析 ④ 填补3´末端