实验三血红蛋白吸收及其衍生物光谱分析(终版2012-11-27)
导学案课题3血红蛋白的提取和分离.doc
课题3血红蛋白的提取和分离一、学习目标：尝试对血液中血红蛋白的提取和分离，了解色谱法，电泳法等分离生物大分子的基本原理二、重点：凝胶色谱法的原理和方法一、凝胶色谱法1、概念：也称做；是根据分离蛋白质的有效方法。
2、原理(1)由构成的凝胶，内部有许多贯穿的的。
(2)当不同的蛋白质通过凝胶时，相对分子质量的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程,移动速度，而相对分子质量的蛋白质无法进入凝胶内部的通道,只能在移动，路程,移动速度,从而使不同的蛋白质分子得以分离。
二、缓冲溶液1、作用：在一定范围内，抵制的对溶液pH的影响，维持pH o2、配制：由种缓冲剂溶解于中配制而成，通过调节缓冲剂的就可以得到不同pH范围内使用的缓冲液。
三、电泳1、概念：指在电厂的作用下发生的过程。
2、原理：在一定的下，、等生物大分子的可解离基团会带上或,在的作用下，这些带电分了会向着与其所带电荷的电极移动O3、作用：电泳利用了待分离样品中各种分子的差异及分子本身的、的不同，使带电分子产生不同的，从而实现样品中的分离。
4、方法：常用的电泳方法有和。
测定蛋白质分子量时通常使用。
四、实验操作1、样品处理:通过、、等操作收集血红蛋白溶液。
(1)红细胞的洗涤：目的是0分离时采取,直至上清液中没有,表明红细胞己洗涤干净。
(2)血红蛋白的释放：在和的作用下，红细胞破裂，释放出血红蛋白。
(3)分离血红蛋白溶液：把离心后，将试管中的液体用过滤、除去，于中静置片刻后，分离出下层的。
2、粗分离：即透析(1)方法：将血红蛋白溶液装入，将放入一定量适宜浓度的中，透析0(2)目的：将的杂质除去。
(3)原理：透析袋能使小分子自由进出，而将大分子物质保留在袋内。
3、纯化:通过凝胶色谱柱将相对分子质量较大的杂质蛋白除去。
操作如下：(1)凝胶色谱柱的制作。
(2)凝胶色谱柱的装填%1材料：本实验使用的是。
%1方法：凝胶用充分溶胀后。
配成, 一次性倒人色谱柱内。
不能有存在；不能发生流干露出凝胶颗粒的现象。
吸收光谱实验报告(3篇)
第1篇一、实验目的1. 理解吸收光谱的基本原理及其在物质分析中的应用。
2. 掌握紫外-可见分光光度计的操作方法。
3. 通过实验学习如何制备标准溶液，并绘制标准曲线。
4. 应用标准曲线法测定未知样品的浓度。
二、实验原理吸收光谱是一种物质对特定波长光的吸收特性，通常用于物质的定性和定量分析。
当一束单色光通过含有特定分子的溶液时，溶液中的分子会吸收特定波长的光，从而产生吸收光谱。
根据朗伯-比尔定律，吸光度与溶液的浓度和光程成正比。
三、实验仪器与试剂1. 仪器：- 紫外-可见分光光度计- 烧杯- 移液管- 移液器- 洗瓶- 吸收池- 镜头纸2. 试剂：- 标准溶液：已知浓度的待测物质溶液- 未知溶液：待测浓度的溶液- 试剂水- 乙醇四、实验步骤1. 仪器调试：- 打开紫外-可见分光光度计，预热30分钟。
- 调整仪器至最佳工作状态，包括波长选择、光程设置等。
2. 标准溶液制备：- 使用移液管准确量取一定体积的标准溶液，加入烧杯中。
- 加入适量的试剂水，搅拌均匀。
- 使用移液器将溶液转移至吸收池中，用镜头纸擦拭干净。
3. 吸光度测量：- 将制备好的标准溶液放入紫外-可见分光光度计中。
- 设置适当的波长，测量溶液的吸光度。
- 记录各标准溶液的吸光度值。
4. 标准曲线绘制：- 以吸光度为纵坐标，以溶液浓度为横坐标，绘制标准曲线。
- 通过线性回归分析，确定标准曲线的方程。
5. 未知溶液浓度测定：- 按照与标准溶液相同的步骤，制备未知溶液。
- 测量未知溶液的吸光度。
- 根据标准曲线方程，计算未知溶液的浓度。
五、实验结果与分析1. 标准曲线：- 标准曲线呈线性关系，相关系数R²接近1，表明实验数据具有良好的线性。
2. 未知溶液浓度：- 通过标准曲线方程，计算得到未知溶液的浓度为X mol/L。
六、讨论与心得1. 误差分析：- 实验过程中可能存在的误差包括：仪器误差、操作误差、试剂误差等。
- 仪器误差可通过定期校准仪器来减少；操作误差可通过提高操作技能来降低；试剂误差可通过选用高纯度试剂来减小。
实验三血红蛋白吸收及其衍生物光谱分析
重复测量
为确保数据的可靠性，对每个样品进行多次 测量，并对结果取平均值。
数据处理与分析
数据整理
01
将测量得到的光谱数据整理成表格形式，便于后续分
析。
光谱拟合
02 采用适当的数学方法对光谱数据进行拟合，提取出各
物质的特征吸收峰及其对应的吸光度值。
数据分析
03
根据拟合结果，分析各物质在光谱上的差异，并结合
已知的化学结构信息，推测可能的相互作用机制。
04 结果与讨论
血红蛋白及其衍生物的光谱数据
血红蛋白光谱数据
在可见光范围内，血红蛋白表现出几个明显的吸收峰，这些峰对应于不同电子跃迁的吸 收。
血红蛋白衍生物光谱数据
在血红蛋白光谱的基础上，通过化学修饰或生物合成得到的衍生物也表现出类似的光谱 特征。
光谱数据的分析
光谱分析的应用
光谱分析在化学、生物学、医学等领域有广泛的应用 。
血红蛋白光谱吸收的机制
血红蛋白光谱吸收的定义
血红蛋白光谱吸收是指血红蛋白分子对特定波 长的光吸收能力。
血红蛋白光谱吸收的机制
血红蛋白分子中的亚铁血红素基团光谱吸收的应用
血红蛋白光谱吸收可用于研究血红蛋白的结构和功能，以及诊断和治疗相关疾 病。
衍生物的光谱变化
当血红蛋白与某些物质结合形成衍生物时， 其光谱特性发生明显变化。特别是在某些波 长范围内，吸收强度显著增加或减少，这表 明血红蛋白与这些物质的相互作用影响了其 光谱特性。
本实验的局限性
样本来源限制
实验使用的血红蛋白样本来源于实验室，而非实际生物体内的血红蛋白。因此，实验结果可能与实际生理环境中 的情况存在差异。
峰位分析
通过对光谱数据的峰位进行分析，可以确定血红蛋白及其衍生物的电子跃迁类型和能级结构。
实验一、血红蛋白吸收光谱的测定
实验一、血红蛋白吸收光谱的测定一、溶血液的制备擒拿固定小白鼠，用手术镊摘除其一只眼球，取眼底血2滴于10ml蒸馏水（D.W）中，混匀。
二、吸光度测定与A-λ曲线的绘制取两只比色皿，分别装入蒸馏水、溶血液，在波长（λ）520nm~600nm的范围内，每次均以D.W调零，用分光光度计测溶血液吸光度A值，再在坐标纸上绘制A-λ曲线，并找出λmax值。
λ520 525 530 535 537 539 541 543 Aλ545 550 555 560 565 568 570 572 Aλ574 576 578 580 585 590 595 600 A▲注意事项：1.λ的选择原则：远离吸收峰时，间隔5nm；靠近吸收峰时，间隔2nm。
2.溶血液的A值在0.2~0. 8之间与溶血液的浓度线性较好。
3.氧合血红蛋白在波长为541nm、577nm、404nm、280nm及210nm处有峰值；还原血红蛋白在波长555nm处有峰值。
本次实验对象为氧合血红蛋白。
4.在A-λ曲线中描出λmax1、λmax2，并写出具体波长值。
三、结果及结果分析实验二、蛋白质性质实验一、等电点（pI）测定当蛋白质溶液处于某一pH值时，蛋白质解离成正负离子的趋势相等，所带静电荷为零，则溶液pH值称为蛋白质的等电点，此时蛋白质易从溶液中析出。
1.操作及结果1号管（pH=5.9）2号管（pH=5.3）3号管（pH=4.7）4号管（pH=4.1）5号管（pH=3.5）0.01mol/L醋酸0.3 — — — —0.1mol/L醋酸— 0.15 0.5 2.0 —1mol/L醋酸— — — — 0.8D.W（ml） 4.2 4.35 4.0 2.5 3.7混匀，各加入0.5ml酪蛋白液，混匀，静置，观察浑浊度。
10min后的浑浊度30min后的浑浊度pH≈pI时，试管中底部沉淀最多，上端较清亮。
2.结论二、茚三酮反应蛋白质的基本结构单位是氨基酸，水解后产生氨基酸。
血红蛋白及其衍生物的吸收光谱测定
血红蛋白及其衍生物的吸收光谱测定一、实验目的：1、了解722s型分光光度计的结构原理，并掌握其使用方法。
2、掌握血红蛋白及其衍生物的吸收光谱曲线的绘制。
3、了解血红蛋白及其衍生物的吸收光谱的测定。
二、实验原理：1、可见-紫外分光光度法：利用物质的分子或离子对某一波长范围的光的吸收作用，对物质进行定性、定量及结构分析的方法。
单色光通过吸光溶液后，吸光度与溶液的浓度和厚度之间呈正比关系。
即符合光吸收的基本定律：Lanbert－Beer定律2、血红蛋白（Hb）及其衍生物具有特征性的吸收光谱，可作为它们定性和定量分析的基础。
如氧合血红蛋白（HbO2），在可见光波长400～700nm范围内有三个特征性的吸收峰，分别称为γ、α及β吸收带，其峰值或最大吸收波长（λmax）分别在415、541和576nm处。
γ带是由原卟啉的电子云所引起，α及β带则决定于铁原子电荷及其配体性质。
在正常人的动脉血中，Hb大部分以HbO2形式存在。
当向HbO2溶液中通入CO时，因Hb与CO的结合力比氧大得多，故可迅速转变为碳氧血红蛋白（HbCO），此时光谱发生改变，峰值蓝移（向短波方向移动），并在波长419、540和569nm处出现三个特征性的吸收峰。
3、本实验先制备Hb及其衍生物，然后在不同波长下测其吸光度A（又称光密度），以A 为纵坐标，波长为横坐标绘制吸收光谱曲线，由此可以确定它们最大的吸收波长。
对定量而言，在峰值波长下进行测定，其灵敏度较大。
三、实验步骤：1.样品的制备①氧合血红蛋白（HbO2）液：取贮存血红蛋白液0.lmL（2滴）盛于小烧杯中，用量筒加20mL蒸馏水，混匀，此即HbO2液，呈鲜红色。
②碳氧血红蛋白（HbCO）液：取上述HbO2液约5mL至大试管中，通入CO约30s～1min，，当鲜红色变为樱桃红色时停止通气，HbO2即变成HbCO。
2.吸收光谱曲线的绘制①将上述制备的2种血红蛋白溶液分别盛于比色杯内，在722s型分光光度计上以蒸馏水作为溶剂空白调节吸光度零点。
测定血红蛋白含量实训报告
#### 一、实验目的1. 理解血红蛋白在人体中的作用及其与健康状况的关系。
2. 掌握血红蛋白含量测定的原理和方法。
3. 学会使用分光光度计等仪器进行血红蛋白定量分析。
4. 通过实验，提高实验操作技能和数据分析能力。
#### 二、实验原理血红蛋白（Hemoglobin，Hb）是红细胞内的一种含铁蛋白质，主要负责氧气的运输。
血红蛋白含量是衡量血液携氧能力的重要指标。
本实验采用邻甲联苯胺法测定血红蛋白含量，该方法是利用血红蛋白中的亚铁离子与邻甲联苯胺反应生成蓝色化合物，通过测定该化合物的吸光度来计算血红蛋白含量。
#### 三、实验材料与仪器1. 实验材料：- 血浆样本- 邻甲联苯胺试剂- 盐酸- 水浴锅- 分光光度计- 移液器- 试管2. 实验仪器：- 邻甲联苯胺试剂- 盐酸- 水浴锅- 分光光度计- 移液器- 试管#### 四、实验步骤1. 样本准备：取适量血浆样本，置于试管中，用移液器加入适量的邻甲联苯胺试剂，混匀。
2. 反应：将混合后的样本置于水浴锅中，加热至60℃，反应5分钟。
3. 冷却：将反应后的样本取出，冷却至室温。
4. 测定：使用分光光度计，在540nm波长处测定样本的吸光度。
5. 计算：根据标准曲线，计算血红蛋白含量。
#### 五、实验结果与分析1. 标准曲线的制作：根据不同浓度的血红蛋白标准溶液，绘制标准曲线。
2. 血浆样本的测定：根据实验步骤，测定血浆样本的吸光度。
3. 血红蛋白含量的计算：根据标准曲线，计算血浆样本中血红蛋白的含量。
4. 结果分析：通过比较实验结果与正常值，分析受试者的血红蛋白含量是否在正常范围内。
#### 六、实验总结1. 通过本次实验，掌握了血红蛋白含量测定的原理和方法。
2. 学会了使用分光光度计等仪器进行血红蛋白定量分析。
3. 提高了实验操作技能和数据分析能力。
4. 认识到血红蛋白含量对人体健康的重要性。
#### 七、实验讨论1. 影响血红蛋白含量的因素有哪些？如何进行预防和治疗？2. 邻甲联苯胺法测定血红蛋白含量的优缺点是什么？3. 如何提高实验结果的准确性和重复性？#### 八、实验反思1. 在实验过程中，应严格按照实验步骤进行操作，确保实验结果的准确性。
实验报告血红蛋白
实验报告血红蛋白篇一：生化实验报告实验5 血红蛋白凝胶过滤实验报告课程名称：生化实验B实验日期：班级：姓名学号：血红蛋白凝胶过滤一、背景及目的血红蛋白是高等生物体内负责运载氧的一种蛋白质。
存在于脊椎动物、某些无脊椎动物血液和豆科植物根瘤中。
人体内的血红蛋白由两个α亚基和两个β亚基组成。
每个亚基均成球状，内部有一个血红素。
血红素上的亚铁离子可以可逆的与氧分子结合，起到运输氧气的作用。
当携带氧气时，血红蛋白呈鲜红色，无氧时为暗红色。
凝胶过滤法又称凝胶排阻层析或分子筛层析，主要是根据蛋白质的大小和形状，即蛋白质的质量进行分离和纯化。
层析柱中的填料是某些惰性的多孔网状结构物质，多是交联的聚糖(如葡聚糖或琼脂糖)类物质，使蛋白质混合物中的物质按分子大小的不同进行分离。
一般是大分子先流出来，小分子后流出来。
凝胶过滤的突出优点是层析所用的凝胶属于惰性载体，不带电荷，吸附力弱，操作条件比较温和，可在相当广的温度范围下进行，不需要有机溶剂，并且对分离成分理化性质的保持有独到之处。
对于高分子物质有很好的分离效果。
影响分离效果的因素主要有以下几点：1.基质的(本文来自：小草范文网:实验报告血红蛋白)颗粒大小、均匀度2.筛孔直径和床体积的大小3.洗脱液的流速4.样品的种类等，5.缓冲液的pH6.而最直接的影响是 Kav 值的差异性， Kav 值差异性大，分离效果好； Kav 值差异性小，则分离效果很差，或根本不能分开。
影响凝胶过滤的因素主要有：1、层析柱的选择：长的层析柱分辨率要比短的高，但层析柱长度不能过长。
2、加样量：加样过多，会造成洗脱峰的重叠；加样过少，提纯后各组分量少、浓度较低。
3、凝胶柱的鉴定：凝胶柱填装后用肉眼观察应均匀、无纹路、无气泡。
4、洗脱速度：洗脱速度应保持适中。
目前凝胶过滤技术的应用主要是以下几点：1、脱盐2、用于分离提纯3、测定高分子物质的分子量4、高分子溶液的浓缩5、蛋白质的复性二、实验原理层析法是基于不同物质在流动相和固定相之间的分配系数不同而将混合组分分离的技术。
实验三血红蛋白吸收及其衍生物光谱分析(终版2012-11-27)
图-3 MetHbCN吸收光谱
图-4 脱氧Hb吸收光谱
三、操作步骤
1、样品制备
（1）HbO2液：
取全血0.1ml（1滴）盛于小烧杯中，加蒸馏水10ml，
混匀，此即HbO2液。
（2）MetHbCN液：
取上述氧合血红蛋白约5ml于小试管中，加新鲜配制
的10%K3Fe(CN)6 2滴，然后加1滴1%NaCN液，混匀
②不同浓度的同一种物质，其吸收曲线形状相似λmax
不变。而对于不同物质，它们的吸收曲线形状和λmax
则不同。
③在λmax处吸光度随浓度变化的幅度最大，所以测定
最灵敏。吸收曲线是定量分析中选择入射光波长的重
要依据。
3、血红蛋白（Hemoglobin，简称Hb）
血红蛋白四聚体结构模式
4、Hb及其衍生物
二、实验原理
1、吸收光谱曲线：将各种波长（）的单色光
依次通过一定浓度的某一溶液，测量该溶液对各种
单色光的吸收程度（吸光度A），以为横坐标，以A
为纵坐标，可得到一条曲线，即吸收光谱曲线或称
为吸收曲线。
2、吸收曲线的特点
①同一种物质对不同波长光的吸光度不同。
吸光度最大处对应的波长称为最大吸收波长λmax 。
五、思考题：
1、什么叫吸收光谱？测定血红蛋白及其衍生物的吸 收光谱有何意义？
四、结果记录及曲线绘制
1、记录各波长下的A（制成表格） 2、绘制吸收曲线（*并确定最大吸收波长）
以波长为横坐标，吸光度为纵坐标描点，并将 各点连接成光滑曲线，即为血红蛋白及其衍生物 的吸收光谱。
四、注意事项
1、NaCN溶液是剧毒物，要注意安全，切忌口服， 实验完毕注意洗手。 2、取全血前要混匀。 3、比色时每次换波长都要重新调零和100%。 4、绘图时，纵横坐标比例要适当，要用圆滑线把 点连起来。
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（*在相应峰值的10nm范围内每隔5nm记录一次吸光
度读数，其余均每隔10nm记录一次吸光度读数）。
四、结果记录及曲线绘制
1、记录各波长下的A（制成表格） 2、绘制吸收曲线（*并确定最大吸收波长）
以波长为横坐标，吸光度为纵坐标描点，并将 各点连接成光滑曲线，即为血红蛋白及其衍生物 的吸收光谱。
四、注意事项
为纵坐标，可得到一条曲线，即吸收光谱曲线或称
为吸收曲线。
2、吸收曲线的特点
①同一种物质对不同波长光的吸光度不同。
吸光度最大处对应的波长称为最大吸收波长λmax 。
②不同浓度的同一种物质，其吸收曲线形状相似λmax
不变。而对于不同物质，它们的吸收曲线形状和λmax
则不同。
③在λmax处吸光度随浓度变化的幅度最大，所以测定
最灵敏。吸收曲线是定量分析中选择入射光波长的重
要依据。
3、血红蛋白（Hemoglobin，简称Hb）
血红蛋白四聚体结构模式
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
4、Hb及其衍生物
吸收峰数量 Hb + O2 Hb + CO HbO2 HbO2 HbCO Hb + O2 2个 2个 1个
500~650nm 峰 值 541nm，576nm 540nm，569nm 555nm
1、NaCN溶液是剧毒物，要注意安全，切忌口服， 实验完毕注意洗手。 2、取全血前要混匀。 3、比色时每次换波长都要重新调零和100%。 4、绘图时，纵横坐标比例要适当，要用圆滑线把 点连起来。
五、思考题：
1、什么叫吸收光谱？测定血红蛋白及其衍生物的吸 收光谱有何意义？
（2）MetHbCN液：
取上述氧合血红蛋白约5ml于小试管中，加新鲜配制
的10%K3Fe(CN)6 2滴，然后加1滴1%NaCN液，混匀
，此即为MetHbCN液。
(3)混匀，静置5min。
2、比色
将以上制备的两种血红蛋白液分别盛于比色杯内，
在722型分光光度计上以蒸馏水为空白调节0和100%。
在500~650nm分别测定HbO2和MetHbCN液的吸光度
实验三 血红蛋白及其衍生物 的吸收光谱测定
生物技术专业实验室 王小英
一、实验目的
1、熟悉Hb及其衍生物吸收光谱测定的原 理及操作方法。 2、掌握吸收光谱曲线绘制的方法。
二、实验原理
1、吸收光谱曲线：将各种波长（）的单色光
依次通过一定浓度的某一溶液，测量该溶液对各种
单色光的吸收程度（吸光度A），以为横坐标，以A
HbO2 + K3Fe(CO)6 + NaCN
MetHbCN 1个 540nm
图1 HbO2吸收光谱
图2 HbCO吸收光谱
图-3 MetHbCN吸收光谱
图-4 脱氧Hb吸收光谱
三、操作步骤
1、样品制备
（1）HbO2液：
取全血0.1ml（1滴）盛于小烧杯中，加蒸馏水10ml，
混匀，此即HbO2液。