兽医现代监测诊断技术(终稿)

PCR反应原理图
反转录PCR技术
即RT-PCR技术。用于检测RNA
病毒。首先提取总RNA，然后加入
引物在反转录酶的作用下合成cDNA
RT
，加热变性成为单链cDNA后，加入
与之互补的另一引物，进行PCR反
应。
分为一步法和两步法两种
RT-PCR反应原理图
多重PCR技术(Multi-PCR）
它是一种特殊的PCR形式，其最突出的特点是 一次PCR反应．在同一反应体系中同时加入多对 不同PCR引物和相应的模板，可同时检测、鉴别
其可分为以下几种方法：
原理及分类
常用的直接法ELISA（测抗体）
分子生物学检测技术
用于动物疫病特异性快速诊断和病原基因变异与进化分 析，及时准确掌握动物疫病分子流行病学动态，为疫病 防治提供基因理论分析依据。
核酸探针技术、基因序列分析
比如基因芯片试剂盒。
聚合酶链反应（PCR）（应用最广）
猪圆环病毒ELISA；
哈尔滨兽医研究所 禽流感H5血凝抑制抗原；
鸡新城疫血凝抑制抗原； 其他：猪蓝耳病ELISA——法国进口；
猪伪狂犬、猪细小病毒ELISA——荷兰赛迪诊断公司； 猪蓝耳病RT-PCR，猪乙型脑炎RT-PCR， 猪细小病毒PCR等——北京爱德士元亨生物技术有限公司。
疫苗种类各异、诊断试剂和方法多样
检测成本高。
实时荧光定量PCR反应软件分析截图
鉴别诊断技术
鉴别诊断技术的重要性：
A：区分自然感染抗体和疫苗免疫抗体的鉴别诊断技术； B：从普遍免疫的动物群体中甄别出自然感染和带毒的动 物。
该项技术的核心是基因工程技术、单克隆抗体技术与诊断
技术的综合运用，其科技水平高，研究的难度叶较大。
单克隆抗体技术
目前市场上已有部分利用单克隆抗体制备的金标快速 检测卡和ELISA试剂盒 （比如猪瘟）。
原位PCR——分子病理学新技术
是一种将PCR技术与原位杂交技术结合起来的可 以检测组织细胞中微量DNA或RNA且可精确定位 的新技术。
特点：敏感度更高，优于免疫组化技术。
目前应用情况：主要用于病毒检测，也有检测组 织中寄生虫感染的报道。
以口蹄疫为例 抗体检测试剂品种
正向间接血凝 琼脂凝胶免疫扩散试剂 液相阻断ELISA试剂盒 非结构蛋白ELISA试剂盒
(3ABC) 结构蛋白ELISA试剂盒（VP1） 免疫胶体金试剂盒（测抗体）
病原检测试剂品种
RT-PCR试剂盒 荧光RT-PCR试剂盒 ELISA试剂盒 免疫胶体金试剂盒（测抗原） 反向间接血凝试剂
产品质量：不齐？
1.质量水平低，试验特异性不高，产品保质期短；
2.适用范围窄，操作复杂；
3.生产能力小，购买难；
4.检测目的不明确（型/亚型、感染/免疫抗体等）。
国外动物疫病诊断试剂
进口兽用诊断试剂质量好，但是成本高、购 买周期长，有的不适合中国的实际情况。
国内兽用诊断试剂问题之根源
行业特点
产品种类多，成分复杂，生命周 期长，技术含量高，质量要求严 格，单位用量小
1. 疫病的早期诊断和不完整病原的检测
2.
快速、准确、安全的检测病原体
3.
在病原体分类和鉴别中的应用
基因芯片仪
PCR仪
聚合酶链式反 应（PCR)
是以DNA变性、复 制的某些特性为原 理设计的。通过 PCR技术获取病原 微生物的特异DNA 片段，从而为疾病 诊断提供重要依据 。
特点：快速； 敏感；
步骤较多。
B. 操作过程：尽可能的保证样品被全部加入反应孔；每次滴加抗原
前应充分摇匀，从稀释度高的孔开始加起，并避免滴头和孔内的液 体直接接触；避免稀释时孔内产生气泡，直接影响结果判定。
C. 结果判定：
正确识别“++”的凝集现象。
待检样品1 待检样品2 阳性对照 阴性对照
正向间接血凝反应原理图
抗体
致敏红细胞
国内动物疫病诊断试剂存在的主要问题
技术方法：标准? 各企业生产诊断试剂的的标准不一。
诊断试剂：文号？
302个产品中，有新兽药证书产品7.6%，有生产批准文号产品 4.3%，列入标准产品7%。 法规管理：完善？
市场秩序混乱：国内生产企业不具有资质、产品无新兽药证书或批 准文号、
非法生产产品
国外生企业注册生产的产品进入国内未经注册、
动物疫病诊断试剂行业发展建议
• 先进的产学研模式，提高 自主创新能力，建设科研 院所和企业的产业链
•
严格市场准入
• 完善的质量监控体系，进 行规范化、标准化管理
达到扩充兽用诊断试剂 种类，提高产品质量， 满足动物疫病监测、诊 断工作需要
2
动物疫病诊断技术现状
常用实验室检测技术
➢ 组织病理学检测技术 ➢ 血清学检测技术 ➢ 分子生物学检测技术 ➢ 病原学检测技术
➢ H5亚型：变异株不断出现…… 疫苗：-1、-4、-5株……
➢ PRRS：1996年美洲型； 2006年变异株； 2009年欧洲型1株。
➢ 另外，还有小反刍兽疫（西藏）、疯牛病、非洲猪瘟、尼帕病…… 等外来重大疫病的威胁
2010年列入国家监测计划的动物疫病（16种）
高致病性禽流感、口蹄疫、高 致病性蓝耳病、猪瘟
合的诊断技术将逐步应用于临床。
结束语
正确的制定动物疫病监测方案，合理的综合 选择实用的诊断技术，可以帮助养殖企业制定科 学的动物疫病防治策略和计划，建立有效的净化 措施，提高生产质量和经济效益，以保障畜牧业 快速、健康、持续发展，保障公共卫生事业，保 护人民身体健康。
谢 谢！
树立质量法制观念、提高全员质量意 识。20 .11.12 20.11 .12Th ursda y, November 12, 2020
猪瘟
正向间接血凝试验、阻断ELISA
高致病性猪蓝耳病 ELISA、
鸡新城疫
血凝抑制试验（HI）
布鲁菌病
虎红平板试验、试管凝集试验
血吸虫病
斑点ELISA、免疫金标快速试纸条
牛结核病
结核菌素变态反应试验
地市级、县级实验室的适用试验技术
县级实验室
凝集试验（高致病性禽流感 、口蹄疫、猪瘟、新城疫等 病）；
出多种病原体，在临床混合感染的鉴别诊断上具 有其独特优势和很高的实用价值。
病原学检测技术
1.细菌的分离与鉴定 2.病毒的分离与鉴定
是病毒性疫病检测、诊断、流行病学调查和未知新病 毒进行分类鉴定的重要方法之一。如，此法称为检测口蹄 疫的黄金标准。但是对实验室能力要求较高，且耗时长。
3.寄生虫检测
免疫转印技术。
正向间接血凝诊断技术
特点：正向间接血凝为一种微量的定量反应试验，其应用广泛，
其无需昂贵的设备，操作简单，并且有快速、敏感、特异性。
操作要点及注意事项：
A. 试验准备： 采集3只以上未免疫鸡全血混合制红细胞悬液；
选用孔底应光洁透明无可见沉淀附着物的反应板(一次性的最好)； 待检血清要新鲜，未腐败、溶血，无悬浮物。
面临的复杂形势
动物疫病种类多
农业部《一、二、三类动物疫病病种名录》中列入157 种；其中一类17种；二类77种；三类63种。
➢ OIE《陆生动物卫生法典》2010版中列入94种； 包括多种动物共患病26种；牛病14种； 绵羊和山羊病11种；马病11种；猪病8种；禽病14种； 兔病2种；蜂病6种；其他疫病2种。
间接血凝反应原理示意图
红细胞
间接血凝抑制反应原理示意图
联免疫吸附试验（ELISA）
具有灵敏度高、特异性强、快速、简便、重复性好、安全 、适合大批量标准化检测的特点。
是当前应用最广、发展最快的一项新技术，目前该方法已 被广泛用于多种细菌和病毒等疾病的诊断。
其基本过程是将抗原(或抗体)吸附于固相载体，在载体上 进行免疫酶反应，底物显色后用分光光度计或酶标仪判定 结果。
1.免疫胶体金快速诊断试纸条 2. 荧光PCR 3. 鉴别诊断技术 4. 原位PCR技术
免疫胶体金快速诊断试纸条
特点：操作简易，速度快快，10分钟内出结果，方便基
层开展工作 目前已经有了口蹄疫、猪瘟、禽流感、血吸虫等病的胶体
金快速诊断试纸条。
技术原理：
试纸条的正面和侧面
免疫层析快速检测试纸结构及原理
ELISA（猪瘟、口蹄疫、高 致病性蓝耳病等病）
地市级实验室
县级实验室开展的试验技术 RT-PCR技术（猪瘟，PRRS
等病）
省内诊断试剂使用的现状
主要诊断试剂 提供单位有：
兰州兽医研究所
猪瘟和口蹄疫O型正向间接血凝；
口蹄疫Ａ型、 Asia—I和 O型液相 阻断ELISA；
3ABC-ELISA，VP1-ELISA；
国家强制免疫 动物疫病
鸡新城疫、布鲁菌病、牛结核 病、血吸虫病、狂犬病
牛海绵状脑病、痒病、牛传染 性胸膜肺炎、牛瘟、小反刍兽 疫、非洲猪瘟、蓝舌病
外来动物疫病
主要疫病的国家指定监测方法
病名
指定诊断方法
口蹄疫
正向间接血凝试验、液相阻断ELISA
VP1-ELISA
高致病性禽流感 血凝抑制试验（HI）
寄生虫病诊断中其定性的实质性方法有以下几种:虫卵 检查法、虫体检查法、免疫学检查法和分子生物学检查法 。
诊断新技术及应用
我国免疫预防为主的动物防疫政策，决定了在现实的动物
疫病监测工作中，迫切需要实用的对动物疫病病原的快速 诊断技术以及能区分免疫动物和自然感染动物的鉴别诊断 技术。
目前国内符合上述要求的诊断新技术主要有以下3种:
新发动物疫病威胁
国外威胁： 非洲猪瘟（俄罗斯）等； 周边省威胁：小反刍兽疫（西藏）、
口蹄疫A型（ 2008年湖北）等； 新发亚型： 口蹄疫亚洲I型（2005年出现）等。